Zellzyklus bezieht sich auf die zelluläre und biochemische Prozesse, die innerhalb einer Zelle führt zu seiner Division. Eine Zelle durchläuft verschiedene Phasen des Zyklus, und der Zeitaufwand für diesen Vorgang ist nahezu konstant für einen Zelltyp. Jede Abweichung von dieser Dauer ist bezeichnend für abnorme Zellteilung. Zellzyklus-Analyse wird daher ein sehr nützliches Werkzeug für Biologen, die Interesse an einem Studium Mechanismen der Zellteilung, die letztlich hilft bei der Behandlung von Patienten mit Krankheiten wie Krebs, in denen der Zellzyklus gestört ist.
Dieses Video wird das Prinzip und eine generalisierte Protokoll des Zellzyklus Analyse besprechen. Zu guter Letzt zeigen wir, dass einige Anwendungen dieser Methode häufig verwendet.
Lasst uns lernen welche Zellzyklus-Analyse ist, und wie dieser Test funktioniert.
Im Wesentlichen, Zellzyklus-Analyse einer gemischten Bevölkerung sagt uns, wie viele Zellen in den verschiedenen Phasen sind. Dies geschieht am häufigsten durch die Auswertung der Zelle DNA-Gehalt. Sie mögen denken: Warum DNA-Gehalt? Um dies zu verstehen, lassen Sie uns kurz wiederholen was passiert mit chromosomaler DNA einer Zelle im Laufe durch den Zyklus.
Während der Phase G1 DNA-Gehalt innerhalb einer Zelle nicht geändert. Durch die S-Phase DNA-Replikation erfolgt, und durch das Ende dieser Phase DNA Inhalt verdoppelt. In G2-Phase, die Zellen überprüft werden, dass keine Fehler in DNA-Vervielfältigung, und schließlich – am Ende des M Bühne – diese DNA bekommt gleich zwei Tochterzellen aufgeteilt. Daher hilft DNA Kennzeichnung ein Wissenschaftlers die Zellzyklus-Phase zu bestimmen.
Ein wichtiger Aspekt für diese Kennzeichnung ist die Wahl des DNA-bindenden Farbstoff. Bromodeoxyuridine oder BrdU, ist eine analoge Nukleinsäure und strukturell imitiert Thymidin. Dies ermöglicht BrdU in den wachsenden Strang während der DNA-Replikation zu integrieren. Daher kennzeichnet dieser Farbstoff Zellen in der S-Phase. BrdU-Aufnahme die DNA-Stränge getrennt und BrdU wird mit Hilfe von Eindringmittel tagged Antikörper erkannt.
Andere Verbindungen, wie z. B. Propidium Jodid oder PI, die von Natur aus fluoreszierendem, zwischen doppelte gestrandete Nukleinsäuren einzulagern, und daher Fleck Zellen in allen Phasen. Allerdings ist die Menge der PI Färbung proportional zur DNA-Menge.
Obwohl das Experiment griffbereit Auswahl des Fleckes abhängt, verwenden die Forscher oft dual befleckenden Verfahren. Moleküle wie PI, die proportional zu allen Zellen binden leicht kann zu unterscheiden von G2 G1 oder M-Phase-Zellen. S-Phase-Zellen sind jedoch noch im Übergang. Daher Zugabe von Molekülen wie BrdU, dass nur Label S Phase Zellen erhöhen die Spezifität des Zellzyklus Erkennung. Schließlich sind Zellen mittels Durchflusszytometrie aufzuzählenden Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen analysiert.
Nun, da Sie die Prinzipien hinter Zellzyklus Färbung zu verstehen, sprechen wir über ein Verfahren mit BrdU und PI.
Zelle Kultur Gerichte einrichten: eine für das Experiment und eine zusätzliche drei als Kontrollen. Bei etwa 60 % confluency, BrdU in Kulturmedien aufgelöst wird hinzugefügt, um die lebenden Zellen, gefolgt von Inkubation. In diesem Stadium ist BrdU innerhalb der replizierende DNA eingebaut.
Nach Inkubation sind Zellen zentrifugiert und Nukleinsäuretablette in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung oder PBS. Als nächstes werden Zellen durch Zugabe von Zellsuspension tropfenweise zu eiskalten 70 % Ethanol beim Aufschütteln sanft fixiert. Dies hört auf Zellteilung und verhindert verklumpen.
Fixe Zellen sind erneut zentrifugiert und Nukleinsäuretablette mit PBS-Puffer. Anschließend ist eine konzentrierte Säure-Lösung mit einem Reinigungsmittel, z. B. Triton-X, tropfenweise die Zellen hinzugefügt. Das Waschmittel permeabilizes der Zellen, um die Einreise von Membran-undurchlässige Verbindungen, und Säure sinkt der pH-Wert und DNA, Verfügbarmachen BrdU denaturiert. Zellen sind dann zentrifugiert, Überstand wird verworfen, und das Pellet ist Nukleinsäuretablette in alkalischer Lösung, pH wiederherzustellen.
Zu guter Letzt sind Zellen mit PBS gewaschen und mit einem BrdU Antikörper konjugiert auf einen fluoreszierenden Transponder bei Raumtemperatur inkubiert. Nach diesem Schritt sollten Proben von Licht zu vermeiden, Immunofluoreszenz geschützt werden.
Wenn dual Färbung, Zellen mit PI und RNase inkubiert werden. RNase ist notwendig, RNA-RNA oder RNA-DNA-Doppelstränge zu entfernen, die auch an PI binden und können falsch positive Ergebnisse erzielt. Zellen werden dann durch ein Sieb Zelle zu einzelnen Zellsuspension für notwendige durchflusszytometrischen Analyse übergeben.
Nun, da Sie das Protokoll für das Beflecken gelernt haben, betrachten wir die gewonnenen Daten zu analysieren.
Kurz, Flow Cytometry, die ein Laserstrahl auf einen schmalen Bach der einzelnen Zellsuspension und die Emission bei bestimmten Wellenlängen von Farbstoffen in jeder Zelle scheint als ein einzelnes Ereignis auf ein Streudiagramm erkannt wird.
Hier, befleckt das Streudiagramm von PI Zellen zeigen zwei verschiedene Cluster, mit fast die doppelte Menge an PI als die andere. Nach Optimierung der PI-Detektor erscheinen diese Sätze als zwei Gipfeln in einem Histogramm-Analyse. Der Peak bei intensiver PI stellt G2/M-Zellen und bei geringerer Intensität dar G1-Zellen. Diese Peakflächen repräsentieren die Anzahl der Zellen in den entsprechenden Phasen.
Ebenso können der BrdU-FITC-Ereignisse in einem Histogramm-Analyse auf einer logarithmischen Skala angezeigt werden. Diese Darstellung zeigt, dass BrdU positive Zellen sind deutlich heller als die ungefärbten Zellen, und da nur ein Bruchteil der Bevölkerung sind in der S-Phase, eine größere Spitze BrdU ungefärbten Zellen gesehen werden kann.
Das Streudiagramm von Zellen befleckt mit BrdU und PI kann mit PI auf der linearen X-Achse und BrdU auf der logarithmischen Y-Achse angezeigt werden, und dies zeigt ein Hufeisen Muster gehen von G1, S, G2. Der Anteil der Zellen in den geschlossenen Bereichen kann ermittelt und auf ein Balkendiagramm angezeigt werden.
Nun, da wir das grundlegende Protokoll für Zellzyklus Analyse durchlaufen haben, schauen Sie wie sie in verschiedenen Versuchsaufbauten verwendet werden kann.
A. durch die Kombination von genetischen Manipulationen mit Zellzyklus Analyse, untersuchen die Wissenschaftler Rollen spezifischer Proteine in der Zelle Zyklus Progression. In dieser Studie überexprimiert Wissenschaftler ein Protein namens p27 in embryonalen Fibroblasten der Maus. Die Ergebnisse zeigen, dass Überexpression führte zu geringeren Zahl von Zellen in der S-Phase darauf hinweist, dass dieses Protein eine entscheidende Rolle im Zellzyklus-Verordnung spielt.
Mit Zellzyklus Analyse können Wissenschaftler Fortschreiten Kinetik vergleichen. Hier wurden Fortschreiten Kinetik zwischen zwei colorectal Krebs-Zell-Linien und eine Brust-Krebs-Zell-Linie verglichen. Ergebnisse zeigten, dass der Brustkrebs-Zellen durch Zelle Zyklus mit einer langsameren Rate im Vergleich zu den kolorektalen Zelllinien, angesichts der höheren Anteil an Brustkrebs-Zellen in der G1 im Laufe der Zeit fortgeschritten.
Zu guter Letzt für in Vivo Zellzyklus-Analyse BrdU kann bei Nagern injiziert werden und die Zielpopulation Zelle für Zelle Zyklus Analyse isoliert werden kann. In dieser Studie wurden Blutstammzellen oder HSCs BrdU injiziert Mäusen isoliert für durchflusszytometrischen Analyse. Erhobenen Daten offenbart die Verteilung von HSZ unter verschiedenen Zellzyklus Phasen mit Dominanz in G1 und S-Phase.
Sie haben nur Jupiters Video auf Zellzyklus Analyse angesehen. Wir haben überprüft die Prinzipien, die hinter diesem Prozess, detaillierte Schritt für Schritt Protokoll und überprüft, wie diese Art der Analyse in den verschiedenen experimentellen Einstellungen verwendet wird. Wie immer vielen Dank für das ansehen!
