Name: adherence of bacteria to plant surfaces measured in the laboratory
Uploaded: 2018-06-19T12:30:00.000+00:00
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Der Autor dankt Susan Whitfield für Vorbereitung der Figuren und Camille Martin und Hillary Samagaio für Hilfe mit einigen der Experimente.

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	<li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere:+a+review.">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).</li><li>Beuchat, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+factors+influencing+survival+and+growth+of+human+pathogens+on+raw+fruit+and+vegetables.">Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruit and vegetables.</a> Microbes Infect. 4, 413-423 (2002).</li><li>Berger, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fresh+fruit+and+vegetables+as+vehicles+for+the+transmission+of+human+pathogens.">Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens.</a> Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).</li><li>Lugtenberg, B. J., Chin, A. W. T., Bloemberg, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbe-plant+interactions:+principles+and+mechanisms.">Microbe-plant interactions: principles and mechanisms.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 373-383 (2002).</li><li>Preston, G. M., Haubold, B., Rainey, P. 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Der Autor erklärt, dass sie keine finanziellen widerstreitenden Interessen hat.

Es ist wichtig zu wissen für alle Oberflächen, die Bakterien während des Experiments eingehalten werden können. So können Bakterien, die in der Lage, Bindung an Glas unterschätzt werden, wenn tragfähige zellenzahlen erfolgen mittels Glasröhren und Pipetten. Wenn Pflanzen im Agar oder Boden und einige der Agar wachsen oder Boden auf den Anlagen bleibt können die Bakterien auf das anhaftende Material nicht auf die Pflanzen binden. Auf der anderen Seite Waschen der Pflanzenoberfläche, insbesondere im Falle von Wurzeln, kann entfernen Sie natürliche Oberflächenbeschichtungen wie Schleim und verändern damit die Ergebnisse der Prüfungen der Einhaltung.
Es ist wichtig, sicher sein, dass die Bakterien, die Inkubation Mischung hinzugefügt während des Experiments am Leben zu bleiben. Somit sollten praktikable zellenzahlen von freien sowie beigefügte Bakterien routinemäßig erfolgen. Einige Behandlungen oder bakterielle Mutationen können bakterielles Wachstumsrate reduzieren oder tatsächlich dazu führen, den Tod eines Bruchteils der Bakterienpopulation. Lebende und tote Bakterien möglicherweise nicht im Mikroskop zu unterscheiden, es sei denn, Spezialfärbungen eingesetzt werden. Gibt es ein nützlich Fleck-Kit für die lebenden/Toten Bakterien die den Ausschluss von Farbstoffen aus der lebenden Bakterien abhängig. Allerdings, wenn eine gemischte Bevölkerung von Bakterienarten vorhanden ist dann lebensfähig Zellzahlen der Arten von Interesse ist wahrscheinlich die einfachste Methode um festzustellen, ob die Inkubation bakterielle Tod geführt hat.
Mittlere Zusammensetzung beeinflussen Bakterien überleben und Wachstum. Wurzel Exsudat und Materialien aus der Wunde entlassen und schneiden Websites bieten Substrat um bescheidene bakterielles Wachstum zu unterstützen. Stickstoff, Phosphat und Eisen neigen dazu, unter diesen Bedingungen zu begrenzen. Zweiwertige kationen wie Calcium und Magnesium können die Haftung beeinflussen. In manchen Fällen kann Kohlenstoffquelle Adhäsion wirkt. pH ist ebenfalls von Bedeutung. Im Allgemeinen ist der pH-Wert der Rhizosphäre zwischen 5,5 und 6,5.
Es ist notwendig, vorsichtig im Umgang mit Bakterien mit Antibiotika-Resistenz gekennzeichnet werden. Die am häufigsten verwendeten Antibiotika sind Rifampicin und Nalidixic Säure. Resistenz gegen diese Antibiotika ist in der Regel aufgrund von Mutationen in den chromosomalen Genen (RNA-Polymerase und Gyrase, beziehungsweise) und nicht so leicht auf eine andere Belastung während der Inkubation übertragen werden. Diese Art von Widerstand führt auch nicht in die Zerstörung oder Veränderung des Antibiotikums. Kennzeichnung von Bakterien mit einem Plasmid übertragene gen Marker wird nicht empfohlen, es sei denn, das Plasmid auf andere Bakterien übertragen werden kann. Die Antibiotikaresistenz darf nicht durch Abbau oder chemische Modifikation des Antibiotikums wie Antibiotika empfindlichere Bakterien dann in der Lage werden, auf Antibiotika Platten zu wachsen, wenn sie sich in der Nähe die resistenten Bakterien sind.
In diesem Artikel beschriebenen Methoden eignen sich für kleine Stichprobengrößen bzw. Experimente sollten die Proben (z. B. Experimente mit menschlichen Krankheitserreger) enthalten sein. Für große Stichproben (über 100 g Material oder mehr als 50 Pflanzen) wäre andere Methoden oder drastische Änderung dieser Methoden benötigt10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. die Anwesenheit einer großen Anzahl von Mikroorganismen als die untersuchten Arten kann auch erhebliche Probleme aufwerfen. Mögliche Lösungen umfassen die Verwendung von Bakterien mit einem fluoreszierenden Proteins oder Antibiotika-Resistenz gekennzeichnet, wie in den Schritten 6.1.2 und 7.3 beschrieben. Wenn die Bakterien von Interesse selten Individuen in einer großen Population von anderen Mikroorganismen sind können diese Markierungen nicht ausreichend, um die Zahl der untersuchten Bakterien eindeutig bewerten jedoch.
Alle die hier beschriebenen Methoden sind Labormethoden basiert. Geringfügige Änderungen wären für gewächshausstudien erforderlich. Weitere wesentliche Änderungen werden voraussichtlich für Feldstudien verlangt werden, wo Protozoen, Insekten und andere Tiere Prädation und Klima-Variante erschweren die Bereitstellung von definierten Bedingungen für die Experimente. In Zukunft können diese Methoden erweitert werden die Wechselwirkungen von zwei oder mehr Mikroorganismen auf der Pflanzenoberfläche.

Die Messung der bakterielle Bindung an Oberflächen zu Pflanzen ist in drei unterschiedlichen Situationen sehr wichtig geworden. Die erste Situation ist die Prüfung der Übertragung von menschlichen Krankheitserreger am Werk Oberflächen1,2,3. Das Ziel hier ist bakterielle Bindung zu verhindern oder zu entfernen oder gebundene Bakterien abtöten und damit die Übertragung von Krankheiten durch Pflanzenmaterial zu reduzieren. Im zweiten Fall ist die Untersuchung der Bindung der Pflanzenpathogene Oberflächen4Pflanzen. Wieder einmal das Ziel hier ist verbindlich zu verhindern oder zu entfernen oder gebundene Bakterien abtöten und damit zur Krankheit zu reduzieren. Die dritte Lage ist die Untersuchung der Bindung von symbiotischen oder Pflanze-wachstumsfördernde Bakterien5,6. Das Ziel dabei ist die Förderung bakterielle verbindlich und somit zur Erhöhung der Pflanzengesundheit und Ernte ergibt.
Die Techniken zur Messung der bakterielle Bindung an Oberflächen, die in diesem Artikel beschriebenen Pflanzen sind preiswert und relativ einfach durchzuführen. Die einzigen Voraussetzungen sind ein Mikroskop und Materialien, die in der Regel in einem Bakteriologie Labor gefunden. Für einige Techniken eignet sich ein Bad sonikator. Die beschriebenen Techniken eignen sich für verbindliche Experimente mit relativ kleinen Stichprobengrößen durchgeführt. Messungen von Bindung sind im Labor durchgeführt, obwohl es vielleicht möglich, einige dieser Techniken für den Einsatz im Gewächshaus oder im Feld zu ändern.
Diese Techniken wurden verwendet, um bakterielle Bindung an Wurzeln, Sprossen, geschnittene Blätter, geschnittenen Früchten und intakte Cherry-Tomaten im Labor7,8,9,10,11Messen, 12,13,14,15. Sie wurden auch zur Wurzel Besiedlung der Pflanzen wachsen im Boden zu messen oder sand in den Labor-16. Die Techniken wurden mit vielen Bakterienarten Agrobacterium Tumefaciens, Sinorhizobium Meliloti, Escherichia coli, Salmonella Enterica und Pseudomonas Fluorescenseinschließlich verwendet. Eine nützliche Beschreibung der Methoden für die Beurteilung der Wechselwirkung von A. Tumefaciens mit Oberflächen finden Sie in Morton und Fuqua (2012)17. In allen Fällen wurden die beteiligten Stichprobengrößen klein, in der Regel weniger als 25-50 Pflanzen. Die beschriebenen Techniken sind geeignet für den Einsatz mit menschlichen Krankheitserreger, die während der Experimente enthaltenen gehalten werden müssen.

<table><tbody><tr><td>light microscope</td><td>any</td><td>N/A</td><td>phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required.</td></tr><tr><td>seeds</td><td>any&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>make a note of the seed lot number and the cultivar</td></tr><tr><td>bleach</td><td>any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>bath sonicator</td><td>any scientific supply company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>nutrient agar&amp;nbsp;</td><td>Difco&amp;nbsp;</td><td>001-01-8</td><td></td></tr><tr><td>soytone</td><td>Difco&amp;nbsp;</td><td>24360</td><td></td></tr><tr><td>Sand</td><td>sea sand Fisher Scientific</td><td>S25</td><td></td></tr><tr><td>sand</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td>conetainers</td><td>Stuewe &amp;amp; Sons, Inc.</td><td>Ray-Leach cone-tainers</td><td>many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow</td></tr><tr><td>parafilm</td><td>any scientific supply company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MS salts</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>parrafin</td><td>any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>centrigfuge</td><td>any scientific company</td><td>N/A</td><td>to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed</td></tr><tr><td>vortex mixer</td><td>any scientific company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micrometer</td><td>ACCU-SCOPE Accessories</td><td>A3145</td><td></td></tr><tr><td>Sedgwick-rafter counting cell</td><td>Hauser Scientific</td><td>HS3800</td><td></td></tr><tr><td>probe-clip press-seal incubatin chamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359483</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>naladixic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n8878</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead stain</td><td>In Vitrogen Molecular Bioprobes</td><td>L7007</td><td></td></tr></tbody></table>

adherence of bacteria to plant surfaces measured in the laboratory

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Messung der bakterielle Bindung an axenic pflanzlicher Oberflächen im Lichtmikroskop und durch den Einsatz von lebensfähigen Zellzahlen. Pflanzlichen Stoffen verwendet gehören Wurzeln, Sprossen, Blätter und Früchte schneiden. Die beschriebenen Methoden sind kostengünstig, leicht und eignet sich für kleine Probenmengen. Bindung wird im Labor gemessen und eine Vielzahl von Medien Inkubation und Bedingungen verwendet werden. Der Einfluss von Inhibitoren kann ermittelt werden. Situationen, die zu fördern und hemmen die Bindung können auch beurteilt werden. In einigen Fällen ist es möglich zu unterscheiden, ob verschiedene Bedingungen verbindlich in erster Linie aufgrund ihrer Wirkung auf die Pflanze oder die Bakterien verändern.

A. Tumefaciens kolonisiert Wurzeloberflächen. Um festzustellen, ob bakterielle Produktion von Zellulose eine Rolle bei der Kolonisierung der Wurzel spielt, die Auswirkungen der bakteriellen Mutationen, die Zellulose-Synthese zu verhindern wurden geprüft,16. In den Schritten 1.3 und 7.1 beschriebenen Techniken wurden verwendet. Tomaten-Samen wurden Oberfläche sterilisiert und in sterilem Wasser keimten. Wenn die Wurzeln ca. 2 cm lang waren waren sie eingetaucht in eine Suspension von 105 Bakterien pro mL und in pasteurisierter Boden in Container gepflanzt. Die Pflanzen wurden gezüchtet für 14 Tage bei 25 ° C auf einem 12 h Licht/12 h-Dunkel-Zyklus. Nach der angegebenen Zeit die Pflanzen wurden aus den Behältern entfernt. Die Wurzeln wurden gewaschen und beschallt in einem Bad sonikator gebundene Bakterien zu entfernen. Bakterielle Zahlen wurden mit lebensfähigen Zellen bestimmt. Abbildung 2 zeigt die Wirkung von zwei verschiedenen Zellulose-Minus-Mutationen auf die Fähigkeit der Bakterien, Tomate Wurzeln zu kolonisieren. Obwohl die Standardabweichungen der einige Messungen waren so hoch wie 0,910 (ein häufiges Problem bei dieser Art der Messung) melden Sie sich der Rückgang der Bindung der Zellulose-Minus Mutanten ist klar ersichtlich und wir können feststellen, dass die bakterielle Produktion von Zellulose hilft die Bakterien bei der Besiedlung der Tomate Wurzeln.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg"> Abbildung 2 : Root Besiedlung durch Wildtyp und Mutanten Zellulose-Minus von A. Tumefaciens. Log10 Gesamtzahl der Bakterien pro cm Wurzellänge erholte sich von Tomaten Wurzeln mit Wildtyp-Stamm A. Tumefaciens C58 und Zellulose-Minus Mutanten, C58:1 und C58:A60 geimpft. Die Nummern sind die Mittel von einem Minimum von vier separate Experimente. Balken zeigen Standardabweichungen vom Mittel. Wurzeln wurden durch Eintauchen in eine Suspension von 105 Bakterien pro mL für 1 min geimpft. Die Pflanzen waren in Containern angebaut und die lose anhaftenden Bakterien wurden durch die Wurzeln in Waschpuffer in eine Glasflasche Waschen entfernt. Fest anhaftende Bakterien wurden entfernt, mit einem Bad sonikator und die entstandene Suspension vergoldet um festzustellen, dass lebensfähige Zelle16zählt. Diese Zahl wurde von Matthysse und McMahan geändert. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Die Rolle der exopolysaccharide in der Bindung von E. Coli und andere Bakterien, Alfalfasprossen wurde untersucht. Einige Ausbrüche von Durchfallerkrankungen durch E. Coli O157: H7 haben auf kontaminierte Alfalfasprossen zurückzuführen. Bindung von Wildtyp Bakterien und Mutanten, die nicht in der Lage zu verschiedenen exopolysaccharide wurde mittels in Schritte 1.1, 5.1 und 7.2 beschriebenen Methoden gemessen. Alfalfasprossen waren Oberfläche sterilisiert und für einen Tag in sterilem Wasser bei 25 ° C im Dunkeln gekeimt. Vier Sprossen mit angehängten samenhüllen wurden in sterilen Plastikschalen mit 5 mL Wasser platziert. Bakterien in Luria Brühe angebaut wurden, eine Endkonzentration von etwa 5 x 103 pro mL hinzugefügt. Die beimpften Sprossen waren für 3 Tage bei 25 ° C im Dunkeln inkubiert. Die Sprossen wurden zweimal in 5 mL sterilem Wasser in einer Phiole durch kräftige Umkehrung gewaschen und in Waschpuffer mit einer motorbetriebenen Teflon Glas Homogenisator homogenisiert. Bisherigen Experimente mit Hilfe von Bakterien markiert mit einem Plasmid trägt das GFP-gen zeigten keine internalisierten Bakterien zwar Oberfläche Bakterien leicht beobachtet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1dargestellt. Zwei Stämme von E. Coli O157: H7 wurden untersucht. Beide Stämme erschien die Produktion von Poly-β-1,6-glucuron-acid(PGA) zu den größten Beitrag zur Bindung von pathogenen E. Coli , Oberflächen zu Pflanzen. Kolon Säure spielte auch eine bedeutende Rolle in Bindung. Während der Rückgang der Bindung in Zellulose-Minus Mutanten erhebliche war es nicht so groß wie für die anderen zwei Polysaccharide.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Auswirkungen von Mutationen in den Genen Exopolysaccharide Produktion auf die Bindung von E. coli O157: H7, Sprossen und offene samenhüllen</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Bakterienstamm</td>
			<td rowspan="2">Mutation oder Genotyp (entsprechenden Phänotyp)</td>
			<td colspan="2">Log10 Anzahl der Bakterien pro Spross oder Samenschale gebunden</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alfalfa Sprossenb
</td>
			<td>Offenen samenhüllen</td>
		</tr>
<tr>
<td>86-24</td>
			<td>Keiner (Wildtyp)</td>
			<td>4,7 ± 0,6</td>
			<td>5,6 ± 0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624N</td>
			<td>
yhjN (Zellulose-Minus)</td>
			<td>2.9 ± 0,7c
</td>
			<td>3,5 ± 0,6c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624C</td>
			<td>
wcaD (Kolon Säure-Minus)</td>
			<td>1,8 ± 0,7c
</td>
			<td>2.4 ± 0,5c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624P</td>
			<td>
pgaC (PGA-Minus)</td>
			<td>< 1.0c
</td>
			<td>1,0 ± 1.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4A</td>
			<td>Keiner (Wildtyp)</td>
			<td>5,6 ± 0,2</td>
			<td>6.1 ± 0,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AN</td>
			<td>
yhjN (Zellulose-Minus)</td>
			<td>4,8 ± 0,8d
</td>
			<td>4.1 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AC</td>
			<td>
wcaD (Kolon Säure-Minus)</td>
			<td>3.9 ± 0,5c
</td>
			<td>4,8 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AP</td>
			<td>
pgaC (PGA-Minus)</td>
			<td>< 1.0c
</td>
			<td>1.2 ± 0,7c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">ein Mittelwert ± Standardabweichung von mindestens drei Messungen der Anzahl (Log10) der Bakterien nach 3 Tagen gebunden.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">b-Sprossen wurden vor der Messung gewaschen.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Deutlich anders als der Wildtyp c: P < 0,01.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">d signifikant verschieden von dem Wildtyp: P < 0,05.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Diese Tabelle wurde von Matthysse, Deora, Mishra und Torres10geändert.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Auswirkungen von Mutationen in den Genen Exopolysaccharide Produktion auf die Bindung von E. Coli O157: H7, Sprossen. Um festzustellen, die Rolle der verschiedenen exopolysaccharide und Lipopolysaccharid in der Bindung von pathogenen E. Coli O157: H7-Stämme, Alfalfasprossen, die Bindung einer Gruppe von Mutanten, die Sprossen und offene samenhüllen wurde untersucht, mit den Methoden in Schritt 6 beschrieben. Die Ergebnisse zeigten, dass Poly-ß-1, 6 -N-Acetyl-D-Glucosamin (PGA) scheint wesentlich für die Bindung an Sprossen und Zellulose und Colanic Säure sind für maximale Bindung von E. Coli O157 erforderlich. Diese Tabelle wurde von Matthysse, Deora, Mishra und Torres10geändert.
Um festzustellen, ob die Produktion von PGA ausreichend, um bakterielle Bindung an Oberflächen, ein Plasmid (pMM11) tragen die geklonten Operon Codierung die Gene für PGA erforderlichen Pflanzen verursachen wurde Produktion in zwei verschiedenen Bakterien eingeführt, die nicht werden Sie normalerweise Tomaten Wurzeln10binden. A. Tumefaciens A1045 ist eine Mutante der Wildtyp-Stamm C58 nicht zyklische-β-1,2-Glucan machen und auch nicht an Oberflächen29Pflanzen binden. Sinorhizobium Meliloti 1021 bildet WURZELKNÖLLCHEN auf Luzerne scheitert an nicht-Leguminosen binden darunter Tomaten12. In Schritte 1.1, 6.3, 5.1 und 7.1 beschriebenen Techniken wurden verwendet, um festzustellen, ob die Fähigkeit zur PGA in der Regel bakterielle Bindung an Wurzeloberflächen erhöht. Tomaten-Samen wurden Oberfläche sterilisiert und in sterilem Wasser keimten. Wurzeln in Segmente 1 cm Länge geschnitten und in sterilem Wasser gelegt wurden und die Bakterien geimpft wurden. Da diese beiden Arten von Bakterien unterschiedlich schnell wachsen, wurde Bindung zu verschiedenen Zeiten, um etwa gleiche Mengen von Bakterienwachstum ermöglichen gemessen. Das Vorhandensein von Plasmid pMM11 verursacht eine ähnliche deutliche Erhöhung der Anzahl der gebundenen Bakterien von beiden Arten (Tabelle 2)10. Eine deutliche Zunahme der Bindung galt auch in dem Lichtmikroskop die Bindung war jedoch ganz anders für die beiden Arten (Abbildung 3). A. Tumefaciens A1045 als einzelne Bakterien an der wurzeloberflächegebunden. S. Meliloti gebunden in großen Clustern, in denen nur ein paar der Bakterien wurden direkt an der Wurzel und die Mehrheit der Bakterien auf andere Bakterien befestigt waren. Dieses Beispiel zeigt, dass einfach die Zahl der Bakterien gebunden ohne einschließlich mikroskopische Beobachtungen analysiert einen irreführenden Eindruck der Ergebnisse eines Experiments geben kann. Obwohl beide Methoden (tragfähige Zellzahlen und mikroskopische Beobachtungen) zeigen, dass pMM11 bakterielle Bindung an Tomaten Wurzeln erhöht, war die Art der Bindung verursacht bei der Herstellung von PGA für zwei Bakterienarten10unterschiedlich.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Die Wirkung von Plasmid pMM11 auf die Bindung von Bakterien zu Tomaten Wurzeln</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bakterienstamm</td>
			<td>Plasmid</td>
			<td>Anzahl der Bakterien pro mm Wurzellänge gebunden</td>
		</tr>
<tr>
<td>A. Tumefaciens A1045ein
</td>
			<td>keine</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (Vektor)</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (PGA-Synthese)</td>
			<td>10 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td>S. Meliloti 1021b
</td>
			<td>keine</td>
			<td>keine erkannt</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (Vektor)</td>
			<td>keine erkannt</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (PGA-Synthese)</td>
			<td>50 x 103 ± 5 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">eine bakterielle Bindung wurde nach 2 Stunden gemessen.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">b bakterielle Bindung war Maßnahme nach 18 Stunden</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Diese Tabelle wurde von Matthysse, Deora, Mishra und Torres10geändert.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: die Wirkung von ein Plasmid mit Genen für die Synthese von PGA auf Bindung der A. Tumefaciens A1045 und S. Meliloti 1021 Tomate Wurzel Segmenten. Um zu prüfen, die Fähigkeit der Poly-ß-1, 6 -N-Acetyl-D-Glucosamin (PGA) zur Förderung der Bindung von Bakterien, Pflanzen Wurzeln, die Wirkung von ein Plasmid verleiht die Fähigkeit, PGA (pMM11) auf die Bindung von zwei Bakterienstämme Anlage verbunden sind, Tomaten-Wurzeln wurde untersucht. Weder Bakterienstamm zeigten signifikante Bindung an Tomaten Wurzeln in Abwesenheit des Plasmids oder im Beisein der Plasmid ohne den Genen Codierung PGA-Synthese (pBBR1mcs). Die Zugabe des Plasmids mit PGA Synthese Genen erhöhte Bindung von beiden Arten von Bakterien. Da A. Tumefaciens schneller wächst als S. Meliloti Bindung nach 2 h Inkubation für A. Tumefaciens und nach 18 h für S. Melilotigemessen wurde. Die verwendeten Techniken sind in Schritt 7 beschrieben. Diese Tabelle wurde von Matthysse, Deora, Mishra und Torres10geändert.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg"> Abbildung 3 : Die Wirkung von Plasmid pMM11 tragen die PGA-Biosynthese-Gene auf die Bindung von A. Tumefaciens A1045 und S. Meliloti 1021, Tomate Wurzelhaare. A. Tumefaciens A1045 Bindung an Tomaten Wurzelhaare von A), B) A. Tumefaciens A1045 pMM11, C) S. Meliloti 1021 und D) S. Meliloti 1021 pMM11. Obwohl die Zunahme der Bindung von zwei Bakterienarten ungefähr ähnlich ist sind Details der Bindung wie in dem Lichtmikroskop gesehen ganz anders. Die verwendeten Techniken sind in Schritt 6 beschrieben. Diese Zahl wurde von Matthysse, Deora, Mishra und Torres10geändert. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Es ist manchmal möglich, Bindung an nicht-biologischen Oberflächen verwenden, um Hilfe bei der Unterscheidung des Beitrags der Bakterien und des Werkes in eine spezifische Interaktion. Die unipolaren polysaccharide(UPP) von A. Tumefaciens hat sich gezeigt, um bakterielle Bindung an eine Vielzahl von beiden biologischen und nicht-biologischen Oberflächen30vermitteln zu können. Calcium wurde beobachtet, um die Bindung von A. Tumefaciens , Oberflächen, vermittelt durch die UPP28Pflanzen hemmen. Die Bindung der Bakterien an Nylonfäden wurde untersucht, um festzustellen, ob die Hemmung von Calcium-Ionen der bakterielle Bindung zu Flächen Pflanzen durch Wirkung auf Bakterien oder auf der Pflanzenoberfläche ist. Beschreibt die Techniken im Schritt 8.2 dienten. Tomaten-Samen wurden Oberfläche sterilisiert und gekeimt im Wasser wie in Schritt 1 beschrieben. Die Bakterien wurden in minimaler Medium mit Saccharose angebaut und zur Tomate Wurzeln oder Nylonfäden an eine Endkonzentration von etwa 105/mL hinzugefügt, wie im Schritt 5.1 beschrieben. Die Wirkung der zusätzlichen CaCl2 auf bakterielle Bindung an Tomaten-Wurzeln und Nylonfäden war im Mikroskop untersucht. Abbildung 4 zeigt eine ähnliche Hemmung der Bindung von Kalzium mit entweder Oberfläche vorschlagen, die die Wirkung des Kalziums in erster Linie auf die Bakterien10ist.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg"> Abbildung 4 : Die Wirkung von Kalzium auf die Bindung von A. Tumefaciens an Tomaten Wurzelhaare und Nylonfäden. A. Tumefaciens wurde mit Tomate Wurzeln (A und B) oder Nylonfäden (C und D) für 24 h inkubiert, in einem 01:10 Verdünnung von MS Salzen und ein 01:20 Verdünnung AB minimaler Medium, 0,4 % Saccharose (A und C) oder in einem 01:10 Verdünnung von MS Salzen und 01:20 Verdünnung von minimaler Medium AB , 0,4 % Saccharose mit 60 mM CaCl2 (B und D)31. Die zusätzlichen CaCl2 gehemmt bakterielle Bindung zu den Wurzeln und Nylonfäden, die darauf hindeutet, dass die Hemmung in erster Linie durch einen Effekt auf die Bakterien nicht auf der Pflanzenoberfläche war. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

Eine einfache Methode zur Messung und Charakterisierung von bakteriellen Adhäsion zu Pflanzen, besonders Wurzeln und Sprossen, wird in diesem Artikel beschrieben.

Einhaltung von Bakterien auf Flächen, die im Labor ermittelten Pflanzen

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

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Research

JoVE Journal

Environment

12.6K Aufrufe.  University of North Carolina at Chapel Hill. Eine einfache Methode zur Messung und Charakterisierung von bakteriellen Adhäsion zu Pflanzen, besonders Wurzeln und Sprossen, wird in diesem Artikel beschrieben.

Serie: Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

In-vitro-Assay der bakteriellen Adhäsion auf Mammalian Epithelzellen

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Engineering adhärenten Bakterien durch Schaffung eines einheitlichen Synthetic Curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Biotechnik

Nachweis der Rhizobakterienbesiedlung auf Arabidopsis thaliana

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized method for measuring bacterial colonization in the rhizosphere is necessary to improve reproducibility. We first cultured sterile A.thaliana in hydroponic conditions and then inoculated the bacterial cells in the rhizosphere at a final concentration of OD600 of 0.01. At 2 days post-inoculation, the root tissue was harvested and washed three times in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. The roots were then weighed, and the bacterial cells colonized on the root were collected by vortex. The cell suspension was diluted in a gradient with a phosphate-buffered saline (PBS) buffer, followed by plating onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. The plates were incubated at 37 &#176;C for 10 h, and then, the single colonies on LB plates were counted and normalized to indicate the bacterial cells colonized on roots. This method is used to detect bacterial colonization in the rhizosphere in mono-interaction conditions, with good reproducibility.

Autor im Rampenlicht: Verbesserung der Rhizobakterienbesiedlung an Pflanzenwurzeln für eine verbesserte mikrobielle Düngemitteleffizienz

Colonization of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) in the rhizosphere is essential for its growth-promoting effect. It is necessary to standardize the method of detection of bacterial rhizosphere colonization. Here, we describe a reproducible method for quantifying bacterial colonization on the root surface.

Messung der bakteriellen Besiedlung von Arabidopsis thaliana-Wurzeln im hydroponischen Zustand

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

Umwelt

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, rhizosphere colonization by plant growth-promoting bacteria (PGPB) can increase the health or the development of host plants relative to uncolonized plants. However, in field settings, bacterial treatments with PGPB often do not provide substantial benefits to crops. One explanation is that this may be due to loss of the PGPB during interactions with endogenous soil microbes over the lifespan of the plant. This possibility has been difficult to confirm, since most studies focus on the initial colonization rather than maintenance of PGPB within rhizosphere communities. It is hypothesized here that the assembly, coexistence, and maintenance of bacterial communities are shaped by deterministic features of the rhizosphere microenvironment, and that these interactions may impact PGPB survival in native settings. To study these behaviors, a hydroponic plant-growth assay is optimized using Arabidopsis thaliana to quantify and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after transfer to different growth environments. This system&#8217;s reproducibility and utility are then validated with the well-studied PGPB Pseudomonas simiae. To investigate how the presence of multiple bacterial species may affect colonization and maintenance dynamics on the plant root, a model community from three bacterial strains (an Arthrobacter, Curtobacterium, and Microbacterium species) originally isolated from the A. thaliana rhizosphere is constructed. It is shown that the presence of these diverse bacterial species can be measured using this hydroponic plant-maintanence assay, which provides an alternative to sequencing-based bacterial community studies. Future studies using this system may improve the understanding of bacterial behavior in multispecies plant microbiomes over time and in changing environmental conditions.

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Here we describe a hydroponic plant growth assay to quantify species presence and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after their transfer into different growth environments.

Überwachung der bakteriellen Kolonisation und Erhaltung von Arabidopsis thaliana Roots in einem schwimmenden Hydroponischen System

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Use of Fimbrial Rod for F18ab Fimbriae+ STEC Colonization to Host Cells

Type 1 fimbriae are important virulence determinants of some Gram-negative pathogens, which promote bacterial colonization. The fimbrial rod is primarily composed of multiple copies of the major fimbrial subunit FimA. FimH adhesin, however, is present as a fibrillar tip structure that drive bacteria binding to host cellular mannose containing receptor. Here, we provide protocols to evaluate and compare the function of type 1 fimbrial subunits in F18ab fimbriae+ Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC). We found that both FimA and FimH are required for bacterial adhesion, invasion, and biofilm formation. Deleting fimA gene showed much more reduction in bacterial adhesion and invasion to porcine intestinal columnar epithelial cells IPEC-J2, than that of fimH mutant. Biofilm formation was significantly reduced in both mutants with an equal level. In addition, qPCR demonstrated that either fimA or fimH deletion down-regulated the bacterial flagella and F18 fimbriae genes expression, while up-regulated adhesin was involved in diffuse adherence-I (AIDA-I) gene expression, suggesting the co-regulation of cell surface-localized adhesins in F18ab fimbriae+ STEC.

Use of Fimbrial Rod for F18ab Fimbriae+ STEC Colonization to Host Cells

Here we present a protocol to study the function of fimbriae in bacterial colonization.

Type 1 fimbriae are important virulence determinants of some Gram-negative pathogens, which promote bacterial colonization. The fimbrial rod is primarily ...

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

C. parapsilosis (Cp) is an emerging cause of bloodstream infections in certain populations. The&#160;Candida clade, including Cp, is increasingly developing resistance to the first and the second line of antifungals. Cp is frequently isolated from hands and skin surfaces, as well as the GI tract. Colonization by Candida predisposes individuals to invasive bloodstream infections. To successfully colonize or invade the host, yeast must be able to rapidly adhere to the body surfaces to prevent elimination by host defense mechanisms. Here we describe a method to measure adhesion of Cp to immobilized proteins under physiologic fluid shear, using an end-point adhesion assay in a commercially available multichannel microfluidic device. This method is optimized to improve reproducibility, minimize subjectivity, and allow for the fluorescent quantification of individual isolates. We also demonstrate that some clinical isolates of Cp show increased adhesion when grown in conditions mimicking a mammalian host, whereas a frequently used lab strain, CDC317, is non-adhesive under fluid shear.

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

Adhesion is an important first step in colonization and pathogenesis for Candida. Here, an in vitro assay is described to measure adhesion of C. parapsilosis isolates to immobilized proteins under fluid shear. A multichannel microfluidics device is used to compare multiple samples in parallel, followed by quantification using fluorescence imaging.

Einhaltung von Bakterien auf Flächen, die im Labor ermittelten Pflanzen

Zusammenfassung

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