Die folgenden Protokolle sind unter der University of Maryland institutionelle Animal Care und Use Committee sowie der Institutional Review Board akzeptiert. Die Protokolle befolgen Bundes-, Landes- und lokalen Standards, und die Leitlinien von der University of Maryland-Richtlinie über die biologische Sicherheit.
(1) Dissektion Auge Probe
<ol><li>
Erhalten Sie eine Auge-Probe von örtlichen Schlachthof oder Gewebe-Bank. Wenn eine gesamte Augapfels vorliegt, sofort extrahieren Sie den Objektiv, angehängte Zonules und Glaskörper. Hinweis: Die unten beschriebenen Einzelheiten beziehen sich auf Schweine und menschlichen Augen.<ol>
<li>Mit desinfizierten Chirurgische Scheren und Pinzetten, schneiden Sie und entfernen Sie alle überschüssiges Gewebe rund um die Lederhaut.</li>
		<li>Fest halten Sie das Auge auf seiner Seite und mit einer Rasierklinge, machen Sie einen kleinen Schnitt an der Seite des Auges 3 mm entfernt von der Hornhaut. Machen Sie den Schnitt tief genug, um den Glaskörper im Inneren des Auges erreicht haben.</li>
		<li>Mit Schere, schneiden Sie vorsichtig weiter entlang der Schnitt um den Umfang des Auges. Punktion der Linse zu vermeiden. Ein repräsentatives Bild zeigt Abbildung 2A.</li>
		<li>Entfernen Sie der äußere Umfang des Auges geschnitten worden ist, die hintere Gewebe des Auges mit Pinzette. Isolieren der Linse, Zonules, Ziliarkörper und die beigefügten Glaskörper mit einer Pinzette. Ein repräsentatives Bild ist in Abbildung 2Bdargestellt.</li>
		<li>Mit Schere und Pinzette, entfernen Sie überschüssige Glaskörper, damit das Objektiv auf dem MLS flach liegen kann. Hinweis: Im Falle einer Hornhaut-Transplantation, die Hornhaut Taster in der Chirurgie und der Rest der Welt für Forschungszwecke zur Verfügung. Jedoch kann diese teilweise Globus noch bei der Vorbereitung der Gewebe von der Objektiv-trage-Setup verwendet werden. Wenn nur die hinteren vorliegt, führen Sie nur Schritt 1.1.4–1.1.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alle Gebrauchtmaschinen nach Dissektion in 15 % Bleichmittel-Lösung für 30 min zu desinfizieren.</li>
</ol>(2) Probemontage der manuellen Objektiv Bahre
<ol><li>Legen Sie die 10 mm-Schuh-Böden und den entsprechenden Schuh-Spitzen in die Bodenplatte des MLS, so ein Abstand von 5 mm zwischen der hinteren Wand des Schuh-Einzug und der Schuh selbst bleibt.</li>
	<li>Richten Sie die oberen und unteren Platten, fangen die Platten zusammen; das Gerät ist nun in der ungedehnten Position.</li>
	<li>Legen Sie die Platten in der Platte-Fall und die Verschluss-Schraube in das Loch an der Seite der Bodenplatte.</li>
	<li>Setzen Sie die Platte Fall in die Sockel und legen Sie den Schraubenschlüssel in die ausgerichteten Einzüge.</li>
	<li>Drehen Sie den Schlüssel im Uhrzeigersinn, bis sie die Schraube stoppen erreicht, um Vertrag die Schuhe, und drehen Sie wieder gegen den Uhrzeigersinn, die Schuhe in die ungedehnten Ausgangsposition zurückzukehren.</li>
</ol>3. Montage des Objektivs
<ol><li>Fügen Sie die 10 mm-Schuh-Böden in die Bodenplatte in der MLS, sodass eine 5 mm die Lücke zwischen Reste der hinteren Wand des Schuh-Einzug und der Schuh selbst.</li>
	<li>Mit gebogenen Pinzette, legen Sie die extrahierten Objektiv nach oben auf der Mitte der Bodenplatte, so dass die Schuhe die Linse über dem zentralen Loch unterstützen.</li>
	<li>Einrasten der entsprechenden Spitze Schuhe, clipping, nur die Zonules und den Glaskörper. Optisch sorgen dafür, dass das Objektiv bleibt so zentriert wie möglich auf der Bodenplatte.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2,3 – 2,4.</li>
</ol>4. Messung der Linse
<ol><li>Platzieren Sie ein bildgebendes System direkt über das Gerät, um Videos und Bilder von den Reckvorgang zu erfassen. Achten Sie darauf, ein Lineal in den Rahmen des Bildes präzise Größe und Skalierung Bilder im Post-Processing aufzunehmen. Hinweis: Alle geeignetes imaging-System ist ausreichend für diesen Schritt; Hier verwenden wir ein 12 Megapixel, Autofokus Smartphone einen Fuß aus der Probe.</li>
	<li>Drehen Sie fest und doch glatt, den Schlüssel im Uhrzeigersinn um das Objektiv zu dehnen. Abbildung 3 zeigt repräsentative Bilder auf den ungedehnten und gestreckten Zustand.</li>
	<li>Drehen Sie nach der gestreckten Objektiv fotografieren den Schlüssel in Richtung gegen den Uhrzeigersinn um die Probe in seinem ruhenden Zustand wiederherzustellen. Hinweis: Es ist zwingend notwendig, dass die Messung der Linse in einer fristgerechten Weise durchgeführt wird, um die Austrocknung der Linse zu minimieren.</li>
	<li>Klar, Foto den ruhenden Endzustand des Objektivs.</li>
</ol>(5) Datenanalyse
<ol><li>Laden Sie das Bild auf ImageJ und verwenden Sie die Funktion "Punkt" mindestens 40 Punkte um den Umfang des Objektivs wie in Abbildung 4Aauswählen. Die Option "Analysieren" → "Messen" um die Lage der einzelnen ausgewählten Punkte zu erzielen.</li>
	<li>Passen Sie die Positionspunkte (mit Software wie z.B. MATLAB) um einen Radius und Chi-Quadrat-der Fit wie in Abbildung 4Bzu erzielen. Wandeln Sie die Pixel Radius und Fehler in Kennzahlen mit dem fotografierten Lineal.</li>
	<li>Führen Sie gepaarter zwei tailed t-Test zum Vergleich einer einzelnen Linse vor und nach dem Dehnen von der MLS.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Von Helmholtz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uber+die+akkommodation+des+auges.">Uber die akkommodation des auges.</a> Arch Ophthal. 1, 1-74 (1855).</li><li>Schachar, R. A., Black, T. D., Kash, R. L., Cudmore, D. P., Schanzlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+accommodation+and+presbyopia+in+the+primate.">The mechanism of accommodation and presbyopia in the primate.</a> Ann Ophthalmol. 27, 58-67 (1995).</li><li>Glasser, A., Campbell, C. 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C., K&#252;chle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+accommodation+after+implantation+of+an+accommodating+posterior+chamber+intraocular+lens.">Measurement of accommodation after implantation of an accommodating posterior chamber intraocular lens.</a> J Cataract Refract Surg. 29 (4), 677-685 (2003).</li><li>Ehrmann, K., Ho, A., Parel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+analysis+of+the+accommodative+apparatus+in+primates.">Biomechanical analysis of the accommodative apparatus in primates.</a> Clin Exp Optom. 91 (4), 411 (2008).</li><li>Pinilla Cort&#233;s, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Protocols+for+Ex+Vivo+Lens+Stretching+Tests+to+Investigate+the+Biomechanics+of+the+Human+Accommodation+Apparatus.">Experimental Protocols for Ex Vivo Lens Stretching Tests to Investigate the Biomechanics of the Human Accommodation Apparatus.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (5), 2926 (2015).</li><li>Fisher, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elastic+constants+of+the+human+lens.">The elastic constants of the human lens.</a> J Physiol. 212 (1), 147-180 (1971).</li><li>Eppig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+eye+model+and+measurement+setup+for+investigating+accommodating+intraocular+lenses.">Biomechanical eye model and measurement setup for investigating accommodating intraocular lenses.</a> Z Med Ohys. 23 (2), 144-152 (2013).</li><li>Manns, F., Parel, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Human+and+Monkey+Lenses+in+a+Lens+Stretcher.">Response of Human and Monkey Lenses in a Lens Stretcher.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (7), 3260 (2007).</li><li>Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+age-related+stiffening+in+the+crystalline+lens+by+Brillouin+optical+microscopy.">In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy.</a> Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).</li><li>Besner, S., Scarcelli, G., Pineda, R., Yun, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Brillouin+Analysis+of+the+Aging+Crystalline+Lens.">In Vivo Brillouin Analysis of the Aging Crystalline Lens.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5093 (2016).</li><li>Cortes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Protocols+for+Ex+Vivo+Lens+Stretching+Tests+to+Investigate+the+Biomechanics+of+the+Human+Accommodation+Apparatus.">Experimental Protocols for Ex Vivo Lens Stretching Tests to Investigate the Biomechanics of the Human Accommodation Apparatus.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (5), 2926-2932 (2015).</li><li>Bernal, A., Parel, J. -. M., Manns, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+Posterior+Zonular+Fiber+Attachment+on+the+Anterior+Hyaloid+Membrane.">Evidence for Posterior Zonular Fiber Attachment on the Anterior Hyaloid Membrane.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (11), 4708 (2006).</li><li>Kammel, R., Ackermann, R., Mai, T., Damm, C., Nolte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pig+Lenses+in+a+Lens+Stretcher.">Pig Lenses in a Lens Stretcher.</a> Optom Vis Sci. 89 (6), 908-915 (2012).</li><li>Hahn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Ex+Vivo+Porcine+Lens+Shape+During+Simulated+Accommodation,+Before+and+After+fs-Laser+Treatment.">Measurement of Ex Vivo Porcine Lens Shape During Simulated Accommodation, Before and After fs-Laser Treatment.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5332-5343 (2015).</li><li>D'Antin, J. C., Cortes, L. P., Montenegro, G. A., Barraquer, R. I., Michael, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+portable+manual+stretching+device+to+simulate+accommodation.">Evaluation of a portable manual stretching device to simulate accommodation.</a> Acta Ophthalmol. 93 (255), (2015).</li><li>Pierscionek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+response+of+human+lenses+to+stretching+forces.">Age-related response of human lenses to stretching forces.</a> Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).</li><li>Marussich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Crystalline+Lens+Volume+During+Accommodation+in+a+Lens+Stretcher.">Measurement of Crystalline Lens Volume During Accommodation in a Lens Stretcher.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (8), 4239 (2015).</li><li>Martinez-Enriquez, E., P&#233;rez-Merino, P., Velasco-Ocana, M., Marcos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OCT-based+full+crystalline+lens+shape+change+during+accommodation+in+vivo.">OCT-based full crystalline lens shape change during accommodation in vivo.</a> Biomed Opt Exp. 8 (2), 918-933 (2017).</li></ol>

AB hat Beteiligung an Bioniko Consulting LLC.

Wir haben eine neue Methode um eine präzise und effiziente Weise die Unterkunft Fähigkeit der Linse durch den Einsatz eines Dual-Stück-Klemmen-Mechanismus zu studieren, die Bahre zur Probe zu koppeln bieten entwickelt. Während Unterkunft die Linse entspannt, und der Durchmesser verringert sich in Reaktion auf Entspannung der zonular Fasern1,2,4,19. Die Methode konzentriert sich auf dieses P...

Unterkunft ist der Prozess, durch den das menschliche Auge in der Lage, dynamisch anpassen, die Form der Augenlinse, weit oder nahe Objekte scharf zu sehen ist. Unterkunft ist ein intrinsisch biomechanische Prozess. Auf neuronale Impulse erzeugen die ciliary Muskeln eine Kraft auf den Ziliarkörper und Zonule Fasern, die den Umfang der Linse Kapsel1,2anfügen. Zwar gibt es verschiedene Theorien hinter die Biomechanik der Unterkunft, ist die am weitesten verbreitete die Helmholtz-Hypothese. Nach der Hypothese ist das Objektiv in einem natürlichen gestreckten Zustand entsprechend der dünnsten Form der Linse für optimale im Mittelpunkt von weit entfernten Objekten. Um den Fokus auf nahe Objekte ändern, die ciliary Muskeln kontrahieren und die zonular Fasern sind entspannt. Im Gegenzug verdickt die Linse, erhöht die vorderen und hinteren Oberfläche Krümmungen. Dies entspricht einer Steigerung im dioptrische macht das Nahsehen daher eine kürzere Brennweite1für notwendig ist.
Die Fähigkeit zur Aufnahme ist im Laufe der Zeit über eine Bedingung genannt Presbyopie gefährdet. Auswirkungen auf alle nach dem Alter 50, macht Presbyopie das Auge nicht in der Lage dynamisch ändern Fokus von weit nach Distanzen3schließen. Um die Presbyopie zu bekämpfen, sind aktuelle Methoden passiv einschließlich Korrekturgläsern und Bifocals. Gleichzeitiger Erhöhung der Fähigkeit, sich auf nahe Objekte auf einigen Ebenen konzentrieren, Wiederherstellen nicht solche passiven Behandlungen der dynamischen Fokus Fähigkeit der Linse4,5. Um Presbyopie effizient zu behandeln, oder möglicherweise verhindern, dass es, gibt es ein laufenden Bedarf Unterkunft besser zu verstehen.
Um Objektiv Unterkunft zu untersuchen, wurden eine Anzahl von Geräten simuliert das Phänomen ex Vivo4,6,7,8,9entwickelt. Rotierende Festplatten wurden zuerst eingeführt, um die Dehnung des Objektivs durch Zentrifugalkräfte8zu überwachen. Um das Phänomen mehr treu zu replizieren, wurden Objektiv-stretching-Geräte nach und nach eingeführt und erneuert. Mit Hilfe einer Linse trage, Manns Et al.. die erforderliche Kraft, um Platz für das Objektiv beim korrelieren diese Linse macht und äquatorialen Durchmesser9gekennzeichnet. Gegenwärtiges Verständnis ist, dass die Linse mit zunehmendem Alter versteift, was zu einer geringeren Änderung in Scheibenform in Reaktion auf eine gleiche Kraft vom Ziliarkörper3,10,11,12.
Aktuelle Objektiv Bahren oft beinhalten einen komplizierten Aufbau, Implementierung von Elektronik und programmierbare stretching Preise, und erfordert die ganze Kadaver Augapfel6,7,10,13. Diese Anforderung erhöht die Kosten pro Versuch, mehr als $500,00 pro Auge und Probe Verfügbarkeit sinkt. Hier präsentieren wir eine Methode, um Objektiv Unterkunft zu niedrigen Kosten zu replizieren, da das Auge posterior beläuft sich auf rund $200,00. Weile weniger anspruchsvoll als viele Geräte verwendet, heute ist die Technik viel kostengünstiger und herrenlose ohne Ergebnisse. Diese Methode ist im Mittelpunkt einer manuellen Objektiv trage (MLS) in Abbildung 1dargestellt und verwendet eine einzigartige Klemmsystem auf die zonular Fasern und eine radiale Verdrehung Methode, um den Durchmesser des Objektivs zu erweitern. Die physiologische Richtigkeit des Protokolls wird validiert durch die Feststellungen des Bernal Et Al., der studiert des Weges durch die vorderen und hinteren zonular Fasern mit der Linse-Kapsel-14verbunden sind. Mit dem Design des benutzerdefinierten Schuhe, die nur die Linse, Zonule und Ziliarkörper erfordern, wollten wir Objektiv Biomechanik zu studieren, durch die Replikation physiologischen Unterkunft.

<table><tbody><tr><td>Manual Lens Stretcher</td><td>Bioniko</td><td>MLS</td><td>Different animal species will require different shoe sizes</td></tr><tr><td>Porcine Eye Samples</td><td>George G. Ruppersberger; slaughterhouse</td><td>N/A</td><td>Whole eyeballs were obtained</td></tr><tr><td>Human Eye Samples</td><td>The National Disease Research Interchange</td><td>N/A</td><td>Posterior poles without corneas were ordered</td></tr><tr><td>Dissecting Scissors (5 1/2&#039;&#039; Straight)</td><td>Electron Microsopy Sciences</td><td>72960</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Forceps (4 1/2&#039;&#039;)</td><td>Electron Microsopy Sciences</td><td>72960</td><td></td></tr><tr><td>iPhone 6s</td><td>Apple</td><td>N/A</td><td>Any imaging system with ~0.1 mm resolution will work</td></tr><tr><td>Sodium Hypochorite</td><td>Clorox</td><td>Clorox Regular-Bleach</td><td>Any disinfectant will work</td></tr></tbody></table>

simulating the mechanics of lens accommodation via a manual lens stretcher

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Biomechanik des physiologischen Unterkunft auf kostengünstige, praktische Weise nachahmen. Unterkunft wird durch die Kontraktion der Ziliarkörper und Entspannung Zonule Fasern, die Ergebnisse in die Verdickung der Linse notwendig für Nahsehen erreicht. Hier präsentieren wir Ihnen eine neuartige, einfache Methode, die in der Unterkunft repliziert wird, durch die Anspannung der Zonules an der Linsenkapsel über einer manuellen Objektiv trage (MLS) angeschlossen. Diese Methode überwacht die radiale Dehnung erreicht durch ein Objektiv bei einer konsequenten Krafteinwirkung umkippen und ermöglicht einen Vergleich der Aufnahme-Objektive, die gedehnt werden können, um nicht Platz für Objektive, die gedehnt werden kann nicht. Wichtig ist, die Bahre Paare Zonules direkt, und nicht der Sklera des Auges, erfordern somit nur das Objektiv, Zonules, und Ziliarkörper anstatt den gesamten Globus-Probe. Dieser Unterschied kann die Kosten für den Erwerb Spender Kadaver Objektive von etwa 62 % im Vergleich zum Erwerb einer ganzen Welt erheblich verringern.

Porcines Augen, eine gemeinsame Probe für das Studium Presbyopie über Objektiv Dehnung4,15, stammen, (n = 10) von einem lokalen Schlachthof und dieses Protokoll wurde verwendet, um die Unterkunft Fähigkeit der Linsen zu beobachten. Abbildung 5 A zeigt den Vergleich der porcinen Linse vor und nach dem Dehnen über die MLS. Gab es eine durchschnittlich 0,19 ± 0,07 mm Erhöhung Linse...

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Simulating the Mechanics of Lens Accommodation via a Manual Lens Stretcher

Die Mechanik der Linse Unterkunft über einen manuellen Objektiv Stretcher simulieren

Wir präsentieren Ihnen eine effiziente Methode des Studiums Objektiv Unterkunft mithilfe einer manuellen Objektiv trage. Das Protokoll Mimik physiologischen Unterkunft durch Ziehen der Zonules um die Linsenkapsel dabei verbunden erstreckt sich das Objektiv.

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved ...

simulating-mechanics-lens-accommodation-via-manual-lens

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.7K Aufrufe.  University of Maryland. Wir präsentieren Ihnen eine effiziente Methode des Studiums Objektiv Unterkunft mithilfe einer manuellen Objektiv trage. Das Protokoll Mimik physiologischen Unterkunft durch Ziehen der Zonules um die Linsenkapsel dabei verbunden erstreckt sich das Objektiv.

Serie: Simulating the Mechanics of Lens Accommodation via a Manual Lens Stretcher

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

Stretching kurze DNA-Sequenzen mit Constant Force Axial Optische Pinzetten

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Forschung

Biotechnik

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

Stretching-Cells auf einer mikrostrukturierten PDMS-Membran

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Synthesis of Soft Polysiloxane-urea Elastomers for Intraocular Lens Application

This study discusses a synthesis route for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers for their applications as accommodating intraocular lenses (a-IOLs). Aminopropyl-terminated polydimethylsiloxanes (PDMS) were previously prepared via the ring-chain equilibration of the cyclic siloxane octamethylcyclotetrasiloxane (D4) and 1,3-bis(3-aminopropyl)-tetramethyldisiloxane (APTMDS). Phenyl groups were introduced into the siloxane backbone via the copolymerization of D4 and 2,4,6,8-tetramethyl-2,4,6,8-tetraphenyl-cyclotetrasiloxane (D4Me,Ph). These polydimethyl-methyl-phenyl-siloxane-block copolymers were synthesized for increasing the refractive indices of polysiloxanes. For applications as an a-IOL, the refractive index of the polysiloxanes must be equivalent to that of a young human eye lens. The polysiloxane molecular weight is controlled by the ratio of the cyclic siloxane to the endblocker APTMDS. The transparency of the PSU elastomers is examined by the transmittance measurement of films between 200 and 750 nm, using a UV-Vis spectrophotometer. Transmittance values at 750 nm (upper end of the visible spectrum) are plotted against the PDMS molecular weight, and &#62; 90% of the transmittance is observed until a molecular weight of 18,000 g&#183;mol&#8722;1. Mechanical properties of the PSU elastomers are investigated using stress-strain tests on die-cut dog-bone-shaped specimens. For evaluating mechanical stability, mechanical hysteresis is measured by repeatedly stretching (10x) the specimens to 5% and 100% elongation. Hysteresis considerably decreases with the increase in the PDMS molecular weight. In vitro cytotoxicity of some selected PSU elastomers is evaluated using an MTS cell viability assay. The methods described herein permit the synthesis of a soft, transparent, and noncytotoxic PSU elastomer with a refractive index approximately equal to that of a young human eye lens.

This study describes synthetic routes for aminopropyl-terminated polydimethylsiloxanes and polydimethyl-methyl-phenyl-siloxane-block copolymers and for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers. It presents the application of PSUs as accommodating an intraocular lens. An evaluation method for in vitro cytotoxicity is also described.

Synthese von weichen Polysiloxan-Harnstoff-Elastomeren für Intraokularlinsen Anwendung

This study discusses a synthesis route for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers for their applications as accommodating intraocular lenses ...

Chemie

Production of a Strain-Measuring Device with an Improved 3D Printer

A traditional strain measurement sensor needs to be electrified and is susceptible to electromagnetic interference. In order to solve the fluctuations in the analog electrical signal in a traditional strain gauge operation, a new strain measurement method is presented here. It uses a photographic technique to display the strain change by amplifying the change of the pointer displacement of the mechanism. A visual polydimethylsiloxane (PDMS) lens with a focal length of 7.16 mm was added to a smartphone camera to generate a lens group acting as a microscope to capture images. It had an equivalent focal length of 5.74 mm. Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) and nylon amplifiers were used to test the influence of different materials on the sensor performance. The production of the amplifiers and PDMS lens is based on improved 3D printing technology. The data obtained were compared with the results from finite element analysis (FEA) to verify their validity. The sensitivity of the ABS amplifier was 36.03 &plusmn; 1.34 &#181;&epsilon;/&#181;m, and the sensitivity of the nylon amplifier was 36.55 &plusmn; 0.53 &#181;&epsilon;/&#181;m.

This work presents a strain measurement sensor consisting of an amplification mechanism and a polydimethylsiloxane microscope manufactured using an improved 3D printer.

Herstellung eines Strain-Messgeräts mit verbessertem 3D-Drucker

A traditional strain measurement sensor needs to be electrified and is susceptible to electromagnetic interference. In order to solve the fluctuations in ...

Ingenieurwesen

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Kontrollierte Dehnung von 3D-Hydrogelen unter Live-Mikroskopie-Bildgebung

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Biomechanische Charakterisierung einer Schweineokularlinse mit automatisierter Kompression

Automated Compression Testing of the Ocular Lens

The biomechanical properties of the ocular lens are essential to its function as a variable power optical element. These properties change dramatically with age in the human lens, resulting in a loss of near vision called presbyopia. However, the mechanisms of these changes remain unknown. Lens compression offers a relatively simple method for assessing the lens' biomechanical stiffness in a qualitative sense and, when coupled with appropriate analytical techniques, can help quantify biomechanical properties. A variety of lens compression tests have been performed to date, including both manual and automated, but these methods inconsistently apply key aspects of biomechanical testing such as preconditioning, loading rates, and time between measurements. This paper describes a fully automated lens compression test wherein a motorized stage is synchronized with a camera to capture the force, displacement, and shape of the lens throughout a preprogrammed loading protocol. A characteristic elastic modulus may then be calculated from these data. While demonstrated here using porcine lenses, the approach is appropriate for the compression of lenses of any species.

Autor im Rampenlicht: Besseres Verständnis altersbedingter Veränderungen der Linsensteifigkeit 

We present an automated method for characterizing the effective elastic modulus of an ocular lens using a compression test.

Automatisierte Kompressionsprüfung der Okularlinse

The biomechanical properties of the ocular lens are essential to its function as a variable power optical element. These properties change dramatically ...

Die Mechanik der Linse Unterkunft über einen manuellen Objektiv Stretcher simulieren

Zusammenfassung

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Stretching kurze DNA-Sequenzen mit Constant Force Axial Optische Pinzetten

Stretching-Cells auf einer mikrostrukturierten PDMS-Membran

A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie

Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch

Synthese von weichen Polysiloxan-Harnstoff-Elastomeren für Intraokularlinsen Anwendung

Herstellung eines Strain-Messgeräts mit verbessertem 3D-Drucker

Kontrollierte Dehnung von 3D-Hydrogelen unter Live-Mikroskopie-Bildgebung

Automatisierte Kompressionsprüfung der Okularlinse

Automatisierte Kompressionsprüfung der Okularlinse

Automatisierte Kompressionsprüfung der Okularlinse