DT wurde von einem Postdoc-Stipendium von le Fonds de Recherche du Québec-Nature et Technologies (FQRNT) und eine MITACS Elevate Strategische Fellowship unterstützt. CMC wurde von einem Postdoc-Stipendium von le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) und Ernest und Margaret Ford Kardiologie dotierten Forschungsstipendium an der University of Ottawa Heart Institute unterstützt. EOB wurde durch Betriebskostenzuschüsse MOP80204 von der kanadischen Institut für Gesundheitsforschung (CIHR) und T6335 aus der Herz-und Schlaganfall-Stiftung von Ontario unterstützt. Die CIHR und Medtronic kollektiv EOB mit einem Peer-Review-Research Chair (URC # 57093). AEP wird durch die Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Entdeckung Grant, NSERC Discovery Accelerator Supplement finanziert und dankt der Unterstützung des Canada Research Chairs (CRC)-Programm und einer früh Researcher Award aus der Provinz Ontario.

1. Mechanische Verformung von Einzelzellen <ol><li> Die Herstellung einer PDMS Substrat mit Embedded Leuchtstoffperlen Vor der Herstellung des Substrats werden fluoreszierenden Mikrosphären in einer Wasserlösung in Isopropanol suspendiert zu Wulst Mischen in PDMS aufgrund der hydrophoben Natur zu verbessern. <ol><li> Pipette 500 ul von fluoreszierenden Mikrokugeln in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 16.200 × g für 10 min. </li><li> Überstand verwerfen und fügen Sie 500 ul Isopropanol folgte mit 5 min von Vortex. Setzen Sie die Fläschchen beiseite über Nacht im Dunkeln, damit keine großen Partikel-Aggregate zu sedimentieren. </li><li> Am nächsten Morgen, entfernen Sie vorsichtig den Überstand in ein sauberes Mikro Fläschchen. Dieser Bead-Lösung kann verwendet werden, um mehr als 5 Substrate herzustellen. HINWEIS: Die Bead-Lösung wird sich weiterhin für die nächsten 3 Tage zu sedimentieren. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, Resuspendieren des Pellets. </li><li> Pour 0,5 g des Härters bereitgestelltmit dem PDMS-Kit in einem 1,5-ml-Mikro Fläschchen mit einem wissenschaftlichen Gleichgewicht. Durch die aufeinanderfolgenden Schritten, fügen Sie insgesamt 90 ul-Perlen (in sechs 15 ul Ergänzungen), Vortexen für 1 Minute zwischen jeder Zugabe. Beiseite stellen. </li><li> Gewicht von 10 g PDMS und Mischen für mindestens 12 min mit 0,5 g des Härters mit fluoreszierenden Kügelchen ergänzt. </li><li> Fabrizieren eine SU-8 2050 Kreuzform mit Standard-Photolithographietechniken folgenden Anweisungen des Herstellers. Die verwendete Form weist eine Höhe von 320 um und einer Fläche von 13,4 cm 2 (Fig. 3). Die Form kann 428 ul oder 440 mg PDMS enthalten. </li><li> Pour 400 mg des PDMS mit Perlen in der kreuzförmigen Form mit Hilfe einer Transferpipette und Heilung für 2 Stunden bei 80 ° C. Nach dem Aushärten Abziehen des Substrats von der Form (Fig. 5A). Das Substrat kann in einer Petrischale bei Raumtemperatur für 2 Wochen ohne eine signifikante Änderung in seiner mechanischen Eigenschaften gehalten werden. </li&gt; <li> Gießen Tröpfchen PDMS (Härter: PDMS mit einem Verhältnis von 1,20) in einer Petrischale mit einer endgültigen Größe von etwa 4 mm im Durchmesser und härten sie auf den Kopf für 2 h bei 80 ° C (Fig. 5B). Diese Verankerungs Merkmale können in einer Petrischale für Wochen aufbewahrt. HINWEIS: Halten Sie die Schüssel auf den Kopf, um die Tropfen aus Abflachung während der Aushärtung zu verhindern. </li><li> Air-Plasma-Behandlung (30 sec bei 30 W) das Substrat und 8 Verankerung Funktionen. Binden die Eigenschaften an jedem Ende des Substrats in einem Abstand von 4 mm von der quadratischen Gedankenstrich auf dem Substrat (Fig. 5C) vorhanden. </li></ol></li><li> Montage Membrane auf den Schellen <ol><li> Wickeln Sie jedes Ende des Substrats um die gerillten zylindrischen Teil der Klemmen und befestigen Sie sie mit den zwei Befestigungsschrauben von oben (2B und 5D-E). </li><li> Schrauben Sie die 4 Klammern auf dem Klemmhalter und gießen PDMS (Verhältnis 1:20) mit einem Einweg-transfer Pipette an der Schnittstelle zwischen dem Substrat und der genuteten zylindrischen Teil der Klammern. Verbreiten Sie die nicht ausgehärteten PDMS rund um den genuteten zylindrischen Teil mit einem 1,5 mm-Sechskantschlüssel. </li><li> Gießen PDMS (1:20) in die Nuten, bis sie vollständig durch Kapillarwirkung gefüllt und die Anordnung zu härten bei 80 ° C für 2 h (Fig. 5F). </li></ol></li><li> Impfen Zellen auf der Membran <ol><li> Air-Plasma-Behandlung (30 sec bei 30 W) die ganze Versammlung zu sterilisieren und zu funktionalisieren, die das Substrat für die Kollagenbeschichtung ermöglichen. </li><li> Funktionalisieren den Bereich des Substrats, wo Zellen mit 1 ml 0,02 M Essigsäure mit 16 ug / ml Rattenschwanzkollagen bei Raumtemperatur 1 h ergänzt ausgesät werden. Die gewünschte endgültige Kollagendichte ist 5 ug / cm 2. </li><li> Mit Phosphatpuffer spülen Substrat 3x und lassen Sie es trocken bei Raumtemperatur für mindestens 10 min. </li><li> 40 &amp;mgr; l Kulturmedium mit 10% fötalem Rinder seru ergänztm und 1% Penicillin-Streptomycin enthält 2.000 Zellen in dem zentralen Abschnitt des Substrats, um eine Fläche von 1 cm 2 bedecken (Zelldichte: 20 Zellen / mm 2). Zelldichte nach Versuchsanforderungen verändert werden. </li><li> Setzen Sie die gesamte Anordnung in einem Standardzellkulturbrutschrank bei dem das Substrat nach oben mit dem Tropfen Kulturmedium, Zellen darauf. HINWEIS: Die Montage muss das Substrat nach oben für mindestens 3 Stunden, damit Zellen zu fest an sie gehalten werden. Um die Verdampfung zu verhindern, wird 30 ul warmes Kulturmedium in den Tropfen auf dem Substrat alle 45 min während 3 h zugegeben. </li><li> Nach 3 Stunden, drehen die ganze Versammlung in eine Petrischale mit frischem Kulturmedium gefüllt, um das Substrat untertauchen und Inkubation über Nacht, sodass die Zellen zu vermehren. </li><li> Am nächsten Tag vorzubereiten HEPES-gepufferter Salzlösung (HBSS, 20 mM Hepes, 120 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 0,8 mM MgSO 4, 1,8 mM CaCl 2, 11,1 mM dextrose). Den pH-Wert auf 7,4. HINWEIS: Die HBSS-Lösung muss täglich frisch hergestellt und bei 37 º C während des Experiments gehalten. Diese physiologische Lösung wird verwendet, um die Zellen auf dem Objekttisch durch Nachahmung der normalen Gewebe / Blut-Umgebung aufrechtzuerhalten. </li><li> Montieren Sie das Set-up auf invertierten Phasenkontrast-oder Fluoreszenzmikroskop Montieren Sie die Klemme-Substrat-Baugruppe auf der BAXS Plattform und Motoren. Füllen Sie die Petrischale in der Petrischale Heizung mit HEPES-Puffer (2D). </li></ol></li></ol> 2. Steifigkeit Messung der Kleinkaliber Schiffe <ol><li> Vorbereitung <ol><li> Krebs physiologischer Lösung: Eine Lösung von 118,1 mM NaCl, 11,1 mM D-Glucose, 25 mM NaHCO 3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4 und 2,5 mM CaCl 2. Den pH-Wert auf 7,4 und mit Sauerstoff der Lösung mit Carbogen medizinisches Gas (95% O 2/5% CO 2) für 30 min. HINWEIS: Der Krebs-Löauf muss täglich frisch hergestellt und bei 37 º C während des Experiments gehalten. Diese physiologische Lösung wird verwendet, um die lebendig Gewebe durch Nachahmung der normalen Gewebe / Blut-Umgebung aufrechtzuerhalten. </li><li> Sammeln Instrumentierung für die Zerlegung und mechanische Beurteilung der Aorten-Behälter: chirurgische Schere, Pinzette gebogen, Mikro-Scheren, chirurgische Binokular, 50 ml Polypropylenzentrifugenröhrchen, 10 ml und serologischen Pipetten. Das chirurgische Verfahren und Experiment keine sterilen Bedingungen. Montieren Sie die Klemmen des BAXS Plattform zusammen mit der Wägezelle vorher. </li></ol></li><li> Tissue Isolierung und Dissection Alle Experimente mit Labortieren haben, die von der Animal Care und Verwenden Ausschuss der Nutzer Institution, die mit der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren der der Nutzer entspricht &quot;Land genehmigt werden. <ol><li> Führen Maus Euthanasie mit der Inhalation von 99% CO 2 (7 psi)in einer Plexiglaskammer (6A). </li><li> Offene Maus Bauch und schneiden Sie die Brustaorta, die Maus zu bluten. </li><li> Entfernen Sie die Blende, den Brustkorb und die Lungenlappen (6B). HINWEIS: Um die Gefahr einer Beschädigung des Gewebes zu minimieren, halten das Herz, die Aorta befestigt und vermeiden direktes Berühren des Schiffes, aber mit dem Herzen manipulieren. </li><li> Entfernen des Herzens, der Aortenwurzel und der Aorta durch leichtes Schneiden zwischen dem Behälter und der Wirbelsäule. HINWEIS: Führen Sie keine Dehnung im Behälter während der Exzision herbeiführen, um die innere Struktur des Gewebes intakt (6C) zu halten. </li><li> Sofort tauchen und halten das Herz und die Aorta in Krebs-Lösung. </li><li> Schneiden und sorgfältig waschen die Aorta in Krebs-Lösung, um alle Blutgerinnsel zu entfernen. Entfernen Bindegewebe mit Mikro-Schere, Pinzette und chirurgische Binokular (6D-E). HINWEIS: Bewahren Sie alle Schiffslänge und verwenden Sie die aortic Wurzel, das Schiff Ausrichtung zu bestimmen. </li></ol></li><li> Schiff Dimension Ermittlung und Montage Um die Steifigkeit des Behälters zu bestimmen, werden die entladenen Behälterabmessungen erforderlich und kann mit einem kalibrierten Mikroskop bestimmt werden. <ol><li> Schneiden Sie ein Aorten-Ring von etwa 2 mm in der Länge und präzise die Länge messen mit einem kalibrierten Mikroskop-Einstellung (6F-G). Setzen Sie dieses Segment beiseite in Krebs-Lösung. </li><li> Geschnitten andere Aortaring so klein wie möglich zwischen den einzelnen Segmenten 2 mm (6F). Diesen kleinen Segment auf einem Mikroskopglasobjektträger mit dem Lumen nach oben und messen die Wandstärke mit einem kalibrierten Mikroskopeinstellung (6H). </li><li> Füllen Sie die Petrischale auf der BAXS Plattform mit Krebs-Lösung und der Aorta 2 mm Ringsegment auf der Ziehstifte (in 4C eingelassen) einfügen. </li></ol></li></ol> ge = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. PDMS-Substrat Fertigung und Montage. A) Nach dem Aushärten wird das Substrat vorsichtig von den SU-8 2050 Form geschält und beiseite stellen in einer Petrischale. B) Verankerung Funktionen von PDMS und helfen, das Substrat, auf die Sicherung Schellen. C) Substrat mit Verankerungs Funktionen bereit für die Montage. D) Das Substrat wird auf den 4 Klemmen, die dann auf dem Klemmhalter montiert sind (siehe Kasten) montiert. E) Detailaufnahme der auf den 4 Klemmen montiert Substrat. F ) Verfahren des Gießens PDMS in der Nut unterhalb des Substrats. Der Pfeil zeigt die PDMS langsam füllt die Nut durch Kapillarwirkung. 454fig6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Abbildung 6. Vorbereitung und Isolierung der thorakalen Aorta. A) Vorbereitung chirurgischer Instrumente und die eingeschläfert Maus. B) Durch eine Längsbauchschnitt, der Brustkorb-und Lungen Lobs entfernt werden. C) Die Aorta ist sorgfältig mit dem Herzen zu manipulieren entfernt das Gewebe. D) Das Herz und die Aorta in Krebs physiologischen Lösung setzen. Die Aorta wird durch Entfernen aller Bindegewebe gereinigt. E) Detaillierte Abbildung zeigt das Herz und die Aorta. F) Aorta-Segment für Steifigkeit Beurteilung zusammen mit kleinen Segmenten zur Dickenmessung verwendet. GH) Die genaue Länge (G) und Dicke (H) von jeweils Gefäßsegmente werden mit einem inversen Mikroskop und ein Analyseprogramm ausgewertet.

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+stretch+and+reorientation+modulates+mesenchymal+stem+cell+morphology+and+fibrous+gene+expression+on+oriented+nanofibrous+microenvironments.">Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments.</a> Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).</li><li>Zdero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+and+torsional+mechanical+characteristics+of+intact+and+reconstructed+scapholunate+ligaments.">Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments.</a> J Biomech Eng. 131, (2009).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die hier vorgestellten BAXS Plattform ermöglicht zahlreiche Experimente in der Studie von Mechanobiologie aus Untersuchungen von Einzelzellen zu ganzen Geweben. Außerdem ist die Plattform hoch flexibel und konfigurierbar, so dass für zahlreiche mechanische Stimulationsexperimente und multiaxiale Zugversuch. Die Plattform ermöglicht auch die Aufrechterhaltung von Zellen und Geweben unter physiologischen Bedingungen und ermöglicht die gleichzeitige Mikroskopie während des Streckens Experimenten. Die beiden in den vo...

Die mechanische Mikro spielt eine wichtige Rolle in vielen Zellfunktionen wie Proliferation, Migration und Differenzierung, die eine tiefgreifende Wirkung auf die Entwicklung und die Homöostase von Geweben und auch Krankheiten 1-6 haben. Im Laufe der Jahre eine Vielzahl von experimentellen Werkzeuge werden verwendet, um mechanisch zu stimulieren Zellen oder Geweben zu messen und mechanischen Eigenschaften von biologischem Gewebe mit dem Ziel der Erhöhung der unser Verständnis der Grund Mechanobiologie und Untersuchung der Entstehung und Progression von Krankheiten 6-17. Allerdings muss man oft auf verschiedenen experimentellen Vorrichtungen, um die Ziele einer bestimmten Untersuchung zu erreichen. Dieser Artikel stellt eine Einzel-, Multi-Funktions-, biaxiale Streckung (BAXS)-Plattform, die für die Studien, die die Rolle zu untersuchen, dass die mechanischen Eigenschaften und mechanische Kräfte spielen in der Biologie an der sub-zellulären, ganze Gewebelängenskalen erlaubt. Die BAXS Plattform ermöglicht nicht nur für die quantification der mechanischen Eigenschaften von Geweben isoliert, sondern erleichtert auch die Fähigkeit, einfache, komplexe und dynamische Spannungsfeldern auf lebende Zellen, um ihre Reaktion auf Strecken, die in vivo auftritt verstehen anzuwenden. Die Plattform BAXS behält auch die Fähigkeit lebender Zellen Mikroskopie bei der mechanischen Prüfung und Störungen auf Zellen und Gewebe durchzuführen. Die BAXS Plattform ist ein custom-built Vorrichtung, die verwendet werden können, um die Wirkung der Substratdeformation auf zellulärer Ebene zu untersuchen und durchzuführen, Zugversuche an biologischen Geweben (Abb. 1A). Eine Aluminium Heizvorrichtung wurde hergestellt, um eine Standard-10-cm-Petrischale aufzunehmen und irgendwelche physiologischen Lösungen aufrechterhalten bei 37 ° C mit einem Temperaturregler und Kapton Heizer (Fig. 1B). Diese BAXS Plattform auf einem invertierten Phasenkontrast und / oder Fluoreszenzmikroskop integriert werden und ermöglicht die gleichzeitige Bildgebung (Fig. 1C).Kurz gesagt, die BAXS Plattform besteht aus vier linearen Schwingspulenmotoren, von denen die beweglichen Teile auf Miniatur-Linearbewegung-Kugellager gleitet entlang von zwei senkrechten Achsen (Fig. 1D) ausgerichtet montiert ist. Ein Linearstellstufe zu jeder der vier Motoren angebracht, um die vertikale Bewegung des Spannsystems, mit (1E) werden können. Die Position jedes Motors wird durch einen optischen Codierer mit einer Auflösung von 500 nm (Fig. 1F) überwacht. Alle vier Motoren sind unabhängig voneinander mit einer Bewegungssteuerung, die optische Encoder-Feedback, Bewegungsbefehle (1G) ausführen gesteuert. Ein LabVIEW-Schnittstelle bietet die volle Kontrolle über die Verschiebungsgröße, Geschwindigkeit und Beschleunigung jedes Motors, um vollständig anpassbar, statische und dynamische Verformung der Zellen oder Gewebeproben zu generieren. Die Einrichtung zur Verformung in Zellen zu induzieren Technik wird erreicht, indem einfach allowing Zellen fest an einem flexiblen und transparenten Substrat zu haften und dann Strecken dieses Substrat mit den vier Motoren der BAXS Plattform. Die Plattform ermöglicht die Montage BAXS jeder maßgeschneiderten Satz von Klammern, um das Substrat auf den Schwingspulenmotoren befestigen. Zu diesem Zweck haben wir eine Reihe von Klemmen, um die ein flexibles und transparentes Substrat, Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellt ist, kann angebracht werden (Fig. 2A-C und Fig. 3). Da die Klemmen werden physiologischen Lösungen ausgesetzt werden, wurden alle Teile aus rostfreiem Stahl gefertigt, um für die Sterilisation zu ermöglichen. Diese Klemmen sind sorgfältig entworfen, um das Substrat so nahe wie möglich an dem Mikroskopobjektiv zu bringen, um die Bildqualität zu verbessern und gleichzeitig eine Minimierung der Belastung des Substrats während des Streckens (Fig. 2D). Das gleiche BAXS Plattform kann auch verwendet werden, um die Steifheit der kleinen Gewebeproben zu quantifizieren, unter Verwendung eines geeigneten Satzes von Klemmen mit ADAPted Träger für die Gewebeproben und einer Lastzelle, um Kräfte zu überwachen. Verschiedene Ansätze werden können, um ein Gewebe zu den BAXS Plattform Motoren montieren; in diesem Fall werden die Edelstahl-Insekten minutiens Stifte durch die Öffnung des Gefäßgewebe um Zugversuche (Fig. 4A-B) führen zu haken. Alternativ für dicke Gewebe ohne eine natürliche Öffnung, Gewebekanten können entweder in der Position mit den Klemmen an den Schwingspulenmotoren angebracht oder mit kleinen Glasobjektträger mit biologischen Kleber verklebt und an die Motoren mit den Klemmen befestigt gehalten werden. Um Zug-Tests durchführen, ein Miniatur-Wägezelle ist erforderlich und kann leicht auf die Plattform BAXS Motoren eingebaut und verwendet, um die während einer Streckzyklus (4C) auf das Gewebe wirkenden Kraft zu messen. Da die BAXS Plattform von vier Motoren besteht, die Einführung einer zweiten Lastzelle erlaubt es, Zugprüfmaschine entlang zweier orthogonaler Richtungen durchzuführen. Diese Fähigkeit ermöglicht es, quantify die mechanische Steifigkeit eines einzelnen Gewebe entlang zwei senkrechten Richtungen im gleichen Experiment. Wichtig ist, dass in allen Konfigurationen, die Zellen oder Gewebeproben von Interesse sind immer in einem temperaturkontrollierten Bad, das für den Benutzer zugänglich ist, gehalten. Diese Fähigkeit ermöglicht die Einführung von pharmakologischen Mitteln während der Proben Strecken, um die zeitliche Antwort der Probe zu untersuchen. Zusätzlich, da die optische Achse des umgekehrten Mikroskop unbehindert bleibt, sind immer noch alle Formen der Mikroskopie für den Benutzer verfügbar. Schließlich wird, wie alle vier Motoren der BAXS Plattform unabhängig ist es möglich, in hohem Maße konfigurierbar Spannungsfeldern auf die Probe von Interesse anzuwenden. In vivo Zellen und Gewebe ausgesetzt sind komplex und anisotrope Streckung, angemessener nachgeahmt in dieser Plattform gegen sein kann zu herkömmlichen einachsigen Dehnung Plattform 7,13,15,18,19. Darüber hinaus sind die physikalischen Eigenschaftender Dehnungsfeld kann dynamisch während eines Experiments geändert werden. Diese Fähigkeiten ermöglichen es dem Benutzer, den Zell-und Gewebeebene als Reaktion auf eine große Anzahl von komplexen, anisotropen, zeitlich und räumlich variierenden Spannungsfelder zu prüfen. Dieser Artikel beschreibt die Vorteile und Grenzen der BAXS Plattform sowie sein Design, Funktionsprinzipien und die experimentellen Details für einzelne Zelle und ganze Gewebe Experimenten. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Übersicht der BAXS-Plattform. A) Top Blick auf die BAXS Plattform, welche die vier Schwingspulenmotoren. B) Detailaufnahme der Petrischale Heizung Die Plattform kann auf einem inversen Mikroskop live-montiert werden verwendet, um Zellen und Gewebe bei 37 ° C C zu halten) Cell Imaging Experimente während der Dehnung.D) Detailaufnahme des Schwingspulenmotor; der bewegliche Teil der Plattform. E) Detaillierte Abbildung des linearen Positionierungsstufe ermöglicht vertikale Verschiebung der Spannsystemen. F) Detailaufnahme des optischen Encoder, der Echtzeit-Position des Motors bietet der Bewegungssteuerung. G) Detailaufnahme der Motion-Controller, der die vier optischen Encoder-Eingänge und Stromausgänge zu den vier Schwingspulenmotoren. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig2highres.jpg" width="500" /> 2. Spannsystem für Zellstreckexperimente. AB) Bilder, welche die Details der zur Herstellung der PDMS-Substrat zu den Schwingspulenmotoren für die Dehnung. C) Das Substrat wird um den zylindrischen Teil der Klemme mit seiner Verankerung featur gewickelt befestigen Schellenes sitzt in der Nut an der Spitze. Dann wird das Substrat mit den Stellschrauben, die das Substrat schieben / Verankerung Features in die obere Nut D) Illustration der BAXS Plattform mit die Klammern halten das Substrat an Ort und Stelle gesichert.. Der Einschub zeigt eine Detailansicht des Substrats mit Zellen daran befestigt sitzt direkt über einem Deckglas und dem Mikroskopobjektiv. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig3highres.jpg" width="500" /> 3. Stückmaterialien der Membran und ihre Spannsystem. Zeichnungen, die die Abmessungen der Hauptteile integriert werden, um die biaxiale Streckung Plattform Zellexperimente durchzuführen. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig4highres.jpg" width="500" /> 4. Exreichlich von einem Spannsystem für Steifigkeit Beurteilung der Kleinkalibergefäße. AB) Detailbilder des Spannsystems verwendet, um eine Verformung in einem 1 mm Durchmesser Maus Aorta zu induzieren. Edelstahl-Pins wurden sorgfältig in offene Dreiecke geformt, dass das Schiff auf beide Pins gleiten. C) Illustration der BAXS Plattform mit die Klammern halten das Schiff und eine Lastzelle zwischen der feststehenden Motor und der linken Klammer befestigt. Der Einschub zeigt eine detaillierte Draufsicht des auf den Stiften montiert Gefäß.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="849">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">PDMS</td>
			<td style="width:155px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:255px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td style="width:167px;">The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">FluoSpheres fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">F8810</td>
			<td>Keep away from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Linear voice coil</td>
			<td style="width:155px;">Moticont</td>
			<td style="width:255px;">LVCM-051-051-01</td>
			<td>The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Ball bearing slide</td>
			<td style="width:155px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:255px;">NT37-360</td>
			<td>Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">linear positioning stage</td>
			<td style="width:155px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:255px;">38-960</td>
			<td>Center Drive 1.25&#34; Square Linear Translation Stages</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">optical encoder</td>
			<td style="width:155px;">GSI microE systems</td>
			<td style="width:255px;">Mercury II 1600S - 0.5um resolution</td>
			<td>reflective incremental encoder.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">motion controller</td>
			<td style="width:155px;">Galil</td>
			<td style="width:255px;">DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440</td>
			<td>4 axis controller with a 4 axis amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">load cell&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Honeywell</td>
			<td style="width:255px;">31 low</td>
			<td>miniature load cell with a range of 0-150 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Insect minutiens pins (0,20mm)</td>
			<td style="width:155px;">Pin Service Austerlitz Insect pins</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td>Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">SU-8 2050</td>
			<td style="width:155px;">Micro Chem</td>
			<td style="width:255px;">SU-8 2050</td>
			<td>Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Air-plasma treatment system</td>
			<td style="width:155px;">Glowresearch</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td>Autoglow Oxygen Plasma System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Rat-tail collagen</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">A10483-01</td>
			<td>Collagen I, Rat Tail 5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">R37605</td>
			<td>DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters</td>
			<td style="width:155px;">omega.ca</td>
			<td style="width:255px;">KHLV-0504/(10)-P</td>
			<td>28V flexible heaters; can be supplied with a 24V</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers</td>
			<td style="width:155px;">omega.ca</td>
			<td style="width:255px;">CN63200-R1-LV</td>
			<td>Temperature controller; supply 24 V.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">DMEM culture medium</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH3024301</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SV30010</td>
			<td>Keep stock frozen. Keep working solution at 4 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH3039603C</td>
			<td>Keep frozen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Trypsin 0,05%</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH30236,02</td>
			<td>Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Hepes</td>
			<td style="width:155px;">Wisent Inc</td>
			<td style="width:255px;">330-050-EL</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP358-1</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">KCl</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP366-500</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">MgSO4</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">M65-500</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">CaCl2</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">C614-500</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Dextrose</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP220-1</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP328-1</td>
			<td>Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP362-500</td>
			<td>Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">Carbogen 95% O2/ 5% CO2</td>
			<td style="width:155px;">Lindle</td>
			<td style="width:255px;">DIN:02154749</td>
			<td>Krebs physiological solution oxygenation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">M1404</td>
			<td>Microtubules depolymerization agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cytochalasin-D</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">C8273</td>
			<td>Actin filaments depolymerization agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Anti-&#945;-SMA-FITC</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">F3777</td>
			<td>Used to stain and quantify smooth muscle cells content</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Picrosirius red stain</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td style="width:255px;">43665</td>
			<td>Used to stain and quantify collagen content</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel stretching platform for applications in cell and tissue mechanobiology

Werkzeuge, die die Anwendung von mechanischen Kräften, um Zellen und Gewebe oder die Quantifizierung zu ermöglichen kann die mechanischen Eigenschaften von biologischem Gewebe haben sich zum Verständnis der Grund Mechanobiologie beigetragen. Diese Techniken wurden intensiv genutzt, um zu zeigen, wie die Entstehung und Progression von verschiedenen Krankheiten sind stark von mechanischen Signale beeinflusst. Dieser Artikel stellt eine multifunktionale biaxiale Streckung (BAXS)-Plattform, die entweder mechanisch stimulieren können einzelne Zellen oder zu quantifizieren, die mechanische Steifigkeit des Gewebes. Die BAXS Plattform besteht aus vier Schwingspulenmotoren, die unabhängig voneinander gesteuert werden können. Einzelne Zellen können auf einem flexiblen Substrat, das an die Motoren so dass man die Zellen, um komplexe, dynamische und räumlich variierenden Dehnungsfeldern aus befestigt werden kann, kultiviert werden. Umgekehrt wird durch den Einbau eines Kraftlastzelle, kann man auch eine Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Primärgeweben, wie sie Deformationszyklen ausgesetzt sind.In beiden Fällen muss eine richtige Satz von Klemmen entwickelt und montiert, um den Motoren BAXS Plattform, um fest zu halten das flexible Substrat oder das Gewebe von Interesse sein. Die BAXS Plattform auf einem inversen Mikroskop, um die gleichzeitige Durchlicht und / oder Fluoreszenzabbildung durchzuführen, um die strukturelle oder biochemische Reaktion der Probe während des Streckens Experimente untersuchen montiert werden. Dieser Artikel enthält experimentelle Details der Gestaltung und Nutzung des BAXS Plattform und präsentiert die Ergebnisse für einzelne Zelle und ganze Gewebestudien. Die BAXS Plattform wurde verwendet, um die Verformung der Kerne in Einzel Maus Myoblasten Zellen in Reaktion zu messen, um Stamm-Substrat und die Steifigkeit der isolierten Maus-Aorten messen. Die BAXS Plattform ist ein vielseitiges Werkzeug, mit verschiedenen optischen Mikroskopie, um neue Erkenntnisse zu den mechanobiological subzellulärer, Zell-und Gewebespiegel bieten ganze kombiniert werden können.

Handy Stretching Die BAXS Plattform verwendet, um die mechanische Antwort des Kerns in einzelne Maus-Myoblasten-Zellen (C2C12) auf ein Substrat eine Verformung von 25% exponiert wurden. Myoblasten-Zellen werden in Muskelgewebe gefunden und werden ständig mechanischen Dehnung und Kompression in vivo ausgesetzt wird. Die Form und die mechanischen Eigenschaften des Zellkerns haben gezeigt, eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression und Transkriptionsakti...

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A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Wir stellen in diesem Artikel ein neues Streck Plattform, die verwendet werden können, um einzelne Zellantworten auf komplexe anisotropen biaxiale mechanische Verformung zu untersuchen und zu quantifizieren, die mechanischen Eigenschaften von biologischen Geweben.

A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

a-novel-stretching-platform-for-applications-cell-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.6K Aufrufe.  University of Ottawa.  Wir stellen in diesem Artikel ein neues Streck Plattform, die verwendet werden können, um einzelne Zellantworten auf komplexe anisotropen biaxiale mechanische Verformung zu untersuchen und zu quantifizieren, die mechanischen Eigenschaften von biologischen Geweben. 

Serie: A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Forschung

Biotechnik

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Sandwichartigen Mikroumgebungen zu nutzen Handy / Material-Interaktionen

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Elektrospinnen Schreiben von dreidimensionalen Poly(ε-caprolactone) Gerüste mit steuerbaren Morphologien für Tissue Engineering Anwendungen zu schmelzen

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Eine neuartige Tenorrhaphy-Nahttechnik mit tissue engineered Collagen Graft zur Reparatur großer Sehnendefekte

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Eine mikrofluidische Plattform zur Stimulierung von Chondrozyten mit dynamischer Kompression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Etablierung von Single-Cell-basierten Kokulturen auf deterministischem Weg mit einem mikrofluidischen Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...