Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Start-Zuschuss von der Abteilung für Pathologie, Universität von Utah, J.C.S.B.

1. Identifizierung Synergie Vorhersage Mutanten aus chemisch-Genetik Dataset durch die Überlappung2 Methode (O2M)
Hinweis: Dies ist die Methode zur Identifizierung von Synergie Vorhersage Mutanten mit der veröffentlichten Dataset von Nichols Et Al. 17 in E. Coli. Allerdings kann dies auf alle chemisch-Genetik-Dataset und Mikroorganismus erfolgen. Diese Datensätze enthalten eine Bibliothek von Ko-Mutanten gewachsen in Anwesenheit von mehr als 100 kleine Moleküle geben ein quantitatives Wachstum Punktzahl für jede Mutante in jedem kleinen Molekül. Eine synergistische Paar muss bekannt sein sollte, und es Wachstum Noten für beide kleine Moleküle, die in dem Dataset enthalten.
<ol><li>
Berechnen Sie die mittlere Wachstum Partitur und Standardabweichung für alle Mutanten in Anwesenheit einer einzigen Konzentration jedes kleine Molekül gewachsen. Hinweis: Dies kann mit jedem Tabellenkalkulations-Software. Die braunen Lab verwendet Excel und die Funktionen =AVERAGE(B3:B3981) und =STDEV(B3:B3981) für die Berechnungen der einzelnen Spalten kleiner Moleküle.<ol>
<li>Berechnen Sie die Mittel und die Standardabweichungen aus jeder Spalte kleiner Moleküle, obwohl diese Ausrichtung unterschiedlich sein kann, wenn ein anderes Dataset verwenden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Z-Scores für jede Konzentration kleiner Moleküle mit der gleichen Dataset von Nichols Et al.zu berechnen. 17 in einem Tabellenkalkulationsprogramm. Hierzu werden negative Z-Scores Z(2.5) = bedeuten - 2,5 * Standardabweichung und positive Z-Scores werden Z(2.5) = Mittelwert + 2,5 * Standardabweichung.</li>
	<li>Bestimmen Sie, welche gen Mutanten enthalten bedeutende Z-Scores in den kleinen Molekülen, aus denen das bekannte synergistische Paar, als sicher zu betrachten alle Konzentrationen von diesen Molekülen besteht. Wenn das Wachstum, das Ergebnis einer Mutante ist weniger als die negative Z (2.5) Punkten oder größer als die positive Z (2.5) Punktzahl für dieses kleine Molekül ist, ist es als signifikant betrachtet.</li>
	<li>Festzustellen Sie, ob eines der bedeutenden gen Mutanten zu einem Operon gehören. Hinweis: Für E. Coli, die Autoren empfehlen "Ecoli Wiki" für Informationen bezüglich wenn Gene als Bestandteil einer Polycistronic RNA transkribiert werden.</li>
	<li>Gen/Operon Mutanten, die für die Mehrzahl der kleinen Moleküle von Interesse bei verschiedenen Konzentrationen sind zu identifizieren (z. B.., bei der Suche nach Molekülen, die mit dem Antibiotikum Trimethoprim synergize identifizieren Mutanten, die eine signifikante Z zeigen Ergebnis, wenn in Gegenwart von Trimethoprim und ihren bekannten synergistischen Partnern wie Sulfamethizole oder Sulfamethoxazole gewachsen). Dies sind vermeintliche Synergie Vorhersage Mutanten.</li>
</ol>(2) Vorhersage von Synergizers innerhalb der Chemie-Genetik-Dataset von O2M
<ol><li>Rückkehr in das Dataset17, identifizieren Sie jede Konzentration von kleines Molekül, das eine deutliche Zuwächse Punktzahl aus der Synergie Vorhersage Mutante entlockt. Dies geschieht anhand der Z-Scores berechnet für jede Konzentration von kleinen Molekülen. Wiederum ist ein signifikantes Wachstum Ergebnis kleiner als der negativen Z-Score oder größer als die positive Z-Score für diese Konzentration kleiner Moleküle. Hinweis: Wenn ein Molekül auch nur eines ihrer Konzentrationen angezeigt wird, wird das Molekül eine prognostizierte Synergizer betrachtet. Jedes Molekül, das kein deutliches Wachstum Partitur entlocken ist eine vorhergesagte nicht Synergizer.</li>
</ol>3. Überprüfung der vorhergesagten synergistische Wechselwirkungen
<ol><li>Suche nach minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) der prognostizierten Synergizers.
	<ol>
<li>Wachsen einer Übernachtung Kultur von E. Coli in M9 minimal Media bei 37 ° C. Hinweis: Jede Nacht Kultur kann in angemessen definierte Medium für den Organismus von Interesse gewachsen. Die braunen Lab empfiehlt nicht rich-Media wie LB oder YPD. M9 minimalste Medien besteht aus 10,5 g/L M9 Brühe, 0,2 % Casamino Säuren, 0,1 M CaCl2, 0,4 % Glukose, 1 M MgSO4, Nikotinsäure 0,25 % und 0,33 % Thiamin in H2O.</li>
		<li>Wenn keine MHK-Daten für Erreger von Interesse in der Literatur nach Erhalt die kleinen Moleküle gefunden wird in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in einer hohen Konzentration auflöst (> 10 mg/mL).</li>
		<li>Fügen Sie mithilfe einer 96-Well-Platte 100 µL der M9 Medien in jede Vertiefung. Fügen Sie eine zusätzliche 100 µL der M9 Medien in Spalte 1, so es eine Gesamtmenge von 200 µL enthält.</li>
		<li>Fügen Sie eine beliebige Anzahl (~ 10 µL) konzentrierte niedermolekularer Lösung in Spalte 1. Ein kleines Molekül pro Bohrloch von Spalte 1 (8 kleine Moleküle pro Platte). Hinweis: Dies sind die kleinen Moleküle des Interesses, die voraussichtlich synergize. Das braune Labor fügt in der Regel 10 µL der hochkonzentrierten niedermolekularer Lösung, die unter dem Betrag von 100 % DMSO ist, die E. Colihemmen können.</li>
		<li>Sobald die kleinen Moleküle hinzugekommen sind, verdünnen Sie die kleinen Moleküle auf der x-Achse der Platte. Nehmen Sie 100 µL Lösung von Spalte 1, in Spalte 2 und vermischen. Nehmen Sie 100 µL aus Spalte 2, Spalte 3 und vermischen. Fortfahren Sie, bis 100 µL in Spalte 11 platziert sind. Spalte 11 mischen, dann nehmen Sie 100 µL aus der Spalte und verwerfen. Lassen Sie die Spalte 12 mit nur Medien, die Daten zu normieren.</li>
		<li>Die Platte zu impfen. Erhalten Sie die optische Dichte (OD600) von einer Übernacht-Kultur. Bereiten Sie eine Lösung mit der Kultur und M9-Medien auf einem OD-600 von 0,002 (oder entsprechende Konzentration, die 500 Zellen/µL für den gewünschten Organismus von Interesse darstellt). Pipette 2 µL Kulturlösung in jede Vertiefung der Platte, so gibt es 1.000 Zellen pro Bohrloch.</li>
		<li>Schütteln Sie die Platte und erhalten Sie die OD600 für die 0 h lesen. Lassen Sie die Platte bei 37 ° C für 24 Std. erhalten die OD600 für die 24 h lesen wachsen. Hinweis: Verwendung geeigneten Anbaubedingungen für andere Organismen von Interesse.</li>
		<li>Berechnen Sie die Netto-Wachstum für jeden gut mit einem Tabellenkalkulationsprogramm.</li>
		<li>Durchschnitt der Nettozuwachs der Spalte 12 im Durchschnitt keine Droge Wachstum zu erhalten. Die weiteren Bohrungen auf den Durchschnitt der kein Medikament Wachstum mit einem Tabellenkalkulationsprogramm zu normalisieren. Suchen Sie nach jeder gut mit weniger als 10 % Wachstum, die MIC90 zu identifizieren. Alle gut mit weniger als 50 % Wachstum zeigt die MIC50. Berechnen Sie die Konzentration der kleinen Molekül in den Brunnen.</li>
	</ol></li>
	<li>Schachbrett-Assays für die synergistische Wechselwirkungen
	<ol>
<li>Wachsen Sie eine Übernachtung Kultur von E. Coli in M9 minimal Medien wie vor. Hinweis: Verwendung geeigneten Anbaubedingungen für andere Organismen.</li>
		<li>Jede Vertiefung einer 96-well-Platte und eine zusätzliche 100 µL in Spalte 1 100 µL der M9 Medien hinzufügen.</li>
		<li>Fügen Sie das Test kleines Molekül (~ 8 x MIC) zueinander auch in Spalte 1 und fügen Sie verdoppeln die Konzentration (~ 16 x MIC) gut a1 (ein kleines Molekül getestet pro Platte). Hinweis: Dieser Betrag ergibt sich aus der MIC Test abgeschlossen vor und unterscheidet sich für jede mögliche Synergizer.</li>
		<li>Erstellen Sie eine Farbverlauf Verdünnung auf der x-Achse von 100 µL aus Spalte 1 und Spalte 2. Fortfahren Sie, bis 100 µL, Spalte 11 hinzugefügt wird. Mischen, dann 100 µL aus Spalte 11 nehmen und entsorgen. Spalte 12 (Abbildung 1A) keines Medikament hinzufügen.</li>
		<li>Das zweite Medikament Gefälle über die y-Achse für die Eingabe Droge eingerichtet. Fügen Sie 100 µL Medium mit 2 x MIC input Moleküls in Zeile A. Mix und als vor dem verdünnen, wobei 100 µL aus Zeile A und Platzierung in B. weiter bis 100 µL in Zeile G. Mix platziert wird, nehmen Sie 100 µL und entsorgen, Gewährleistung nicht fügen Sie jede Eingabe Droge in Reihe H. Dadurch können Zeilen-H und 12 einzelne Mikrofone der Droge paar getestet (Abbildung 1 b) enthalten.</li>
		<li>Die Platte zu impfen. Fügen Sie 2 µL einer E. Coli -Kultur von OD600 0,002 in jede Vertiefung (1.000 Zellen pro Well).</li>
		<li>Messen Sie die OD600 von jedem Bohrloch in der Platte für die 0 h Lesung.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte für 24 h bei 37 ° c</li>
		<li>Messen Sie die OD600 von jedem Bohrloch um 24 Uhr.</li>
	</ol></li>
	<li>Berechnung des fraktionierten hemmende Konzentration Index (FICI) von Schachbretter
	<ol>
<li>Berechnen Sie die Netto-Wachstum für jede Vertiefung der Platte durch Subtraktion der OD600 um 0 Uhr die OD600 bei 24 h in einem Tabellenkalkulationsprogramm.</li>
		<li>Das Wachstum in der Software durch Teilung jedes gut durch gut H12, enthält kein kleines Molekül zu normalisieren.</li>
		<li>Finden Sie die MIC90 des Eingabe-Moleküls in Spalte 12 und die MIC90 von potenziellen Synergist in Reihe H.</li>
		<li>Suchen Sie nach alle Brunnen, die 90 % Wachstum zu hemmen.</li>
		<li>Berechnen Sie die FICI90 für die gut, die entweder die niedrigste unten (synergistische) oder oben (antagonistisch) höchste beide MIC90 Werte, unter Verwendung der Gleichung: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57241/57241eq1.jpg">
</li>
		<li>Betrachten alle FICI ≤ 0,5 als synergistische und FICI ≥ 4 als antagonistisch (Abbildung 2). Hinweis: Dies geht auch mit MIC50 (50 % Hemmung des Wachstums), ein FICI50, basierend auf diesen Werten MIC zu bekommen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bliss-Unabhängigkeit-Assay Hinweis: Bliss Unabhängigkeit wird mit jeder möglichen Synergist geführt, die nicht über ein Mikrofon auf eigene.<ol>
<li>Wie zuvor wachsen Sie eine Nacht Kultur von E. Coli in M9 Medien bei 37 ° C. Hinweis: Können geeignete Wachstumsbedingungen für andere Organismen von Interesse in diesem Schritt wiederverwendet werden.</li>
		<li>Bereiten Sie 96-Well Platten für die Prüfung der potentiellen synergistischen Molekül, das Eingabe-Molekül und die Kombination einer unbehandelten Kontrolle vor.</li>
		<li>Erstellen Sie die potenziellen Synergist Platte durch Zugabe von 50 µL der M9 Medien in jede Vertiefung. Jede Vertiefung einer Zeile fügen Sie 50 µL der Medien mit einer bestimmten Konzentration (10 µM oder 100 µM hinzu) von den potenziellen Synergist. Testen Sie 8 Moleküle pro Platte.</li>
		<li>Erstellen Sie die Eingabe-Molekül-Platte durch Zugabe von 50 µL der Medien in jede Vertiefung. Fügen Sie 50 µL mit 4 X MIC input Droge in jede Vertiefung in Spalte 1. Erstellen Sie eine Farbverlauf Verdünnung entlang der x-Achse ähnlich MIC Platten, wobei 50 µL aus Spalte 1, Dispergieren und mischen in Spalte 2. Fortfahren Sie, bis Spalte 12, 50 µL aus Spalte 12 Entsorgung. Fügen Sie eine zusätzliche 50 µL der Medien in jede Vertiefung, also Ende insgesamt für jedes gut 100 µL.</li>
		<li>Fügen Sie die Kombination Platte mithilfe einer 96-well-Platte erstellen hinzu, 50 µL der Medien in jede Vertiefung. Fügen Sie 50 µL mit 4 X MIC input Droge in jede Vertiefung in Spalte 1. Verdünnen Sie entlang der x-Achse ähnlich wie MIC Platten, wobei 50 µL aus Spalte 1, Dispergieren und mischen in Spalte 2. Auch weiterhin diese den ganzen Weg bis Spalte 12, 50 µL aus Spalte 12 Entsorgung. Fügen Sie 50 µL Medium, das die potenziellen Synergisten bei 10 µM oder 100 µM in jede Vertiefung einer Zeile enthält. Auch hier sollte eine Konzentration oder Medikament pro Zeile.</li>
		<li>Erstellen der unbehandelten Kontrolle durch Zugabe von 100 µL der M9 Medien in alle Vertiefungen der Platte.</li>
		<li>Impfen Sie alle Platten durch Zugabe von 2 µL der Bakterienkultur mit einem OD-600 von 0,002 oder 1.000 Zellen in jede Vertiefung als vor.</li>
		<li>Messen Sie die OD600 von jedem Bohrloch bei 0 und 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Berechnung der Glückseligkeit Unabhängigkeit Gäste
	<ol>
<li>Berechnen Sie die Netto-Wachstum für jede Vertiefung der Platte durch Subtraktion der OD600 um 0 Uhr vom Wachstum um 24 Uhr mit einem Tabellenkalkulationsprogramm.</li>
		<li>Normalisieren der Brunnen, das durchschnittliche Wachstum von der keine Droge-Platte in einem Tabellenkalkulationsprogramm.</li>
		<li>Berechnen Sie Tabellenkalkulations-Software verwenden, die Hemmung durch Subtrahieren der Nettozuwachs von 1.</li>
		<li>Durchschnitt der Spalten in der Steuerelement-Platte, die nur die Eingabe Gradienten in der Tabellenkalkulations-Software enthalten.</li>
		<li>Berechnen Sie die Glückseligkeit Score für jede Vertiefung durch die Gleichung: Bliss-Score = (auch X + Eingabespalte X) – kombiniert gut X
</li>
		<li>Suchen Sie nach negativen Punktzahlen in Brunnen unter die MIC90 des Eingangs. Hinweis: Negative Resultate über mehrere Konzentrationen würde eine synergistische Interaktion zeigen.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Hochdurchsatz-Screen mit Synergy Vorhersage Mutanten, neuartige synergistische Paare zu identifizieren
<ol><li>
Synergie-Vorhersage-Mutanten zu identifizieren Hinweis: Schritt 1.5 identifiziert vermeintliche Synergie Vorhersage Mutanten. Hier bestimmen wir, welche diese Mutanten funktioniert am besten in einem Hochdurchsatz-Bildschirm für synergistische Drogen. Dieser Assay in einer Bioscreen-Maschine durchgeführt, aber 96-well-Platte-Leser sollte auch akzeptabel.<ol>
<li>Wachsen Sie jede vermeintliche Synergie Vorhersage Mutanten und Wildtyp Zellen in M9 minimal Medien.</li>
		<li>Richten Sie die 100 gut Waben-Platte (oder 96-well-Platte) mit dem entsprechenden Wachstumsmedium, Wachstumsmedium + Eingabe Medikament, Wachstumsmedium + bekannte synergistische Partner der Eingabe Droge und Wachstumsmedium + bekannte nicht synergistische Droge. Sicherstellen Sie, dass Fahrzeug Steuerelemente enthalten. Hinweis: Wir empfehlen, dass vier Brunnen für jede Belastung/Wirkstoffkonzentration replizieren.</li>
		<li>Impfen Sie 1.000 Zellen pro Bohrloch, einschließlich der leeren Kontroll-Vertiefungen.</li>
		<li>48 h bei 37 ° C mit schütteln, zu wachsen und alle 20 min OD600 zu lesen.</li>
		<li>Bestimmen Sie Medikament Konzentration und Zeit-Punkt, der das größte Wachstum Unterschied zwischen Wildtyp und Synergie Vorhersage mutierten Zellen in Anwesenheit der Eingabe Medikament und seine bekannten synergistische Partner zeigt. An der optimalen Zeitpunkt und Konzentration sollte nicht viel Wachstum Unterschied zwischen Wildtyp und Synergie Vorhersage mutierten Zellen wenn in Gegenwart von Drogen bekannt Handlungsfähigkeit nicht synergistisch mit dem Eingang Medikament (Abbildung 3) gewachsen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hochdurchsatz-Bildschirm für synergistische Drogen
	<ol>
<li>Wachsen Sie Wildtyp Zellen und Synergie Vorhersage mutierten Zellen in M9 minimal Medien. Hinweis: Verwenden Sie geeignete Wachstumsmedium für Organismus von Interesse.</li>
		<li>Fügen Sie Medikamente aus der Bibliothek hinzu, um Medien so dass jeder auch die 100 µL Medien mit kleinen Molekülen in festgelegten Konzentration enthält, die im vorherigen Schritt ermittelt wurde. Sind leere Brunnen (ohne Zellen) und Brunnen mit Fahrzeug-Kontrollen (ez., DMSO) zu einer Wachstumshemmung durch das Medikament Verdünnung Fahrzeug entfallen.<ol>
<li>Bereiten Sie mindestens vier Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen pro Platte, im Idealfall verstreut über die Platte gut Positionseffekte berücksichtigen. Wenn Assays variabel sind, dann gehören Sie mindestens eine Fahrzeugkontrolle auch pro Zeile/Spalte und verwenden Sie jede Zeile/Spalte Kontrolle sowie die Steuerung, um Z-Scores für jede Zeile/Spalte anstatt für eine ganze Platte (Schritt 4.2.5) zu berechnen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fügen Sie 2 µL der Kultur in jede Vertiefung als vor. (Eine Platte für Wildtyp-Bakterien und eine Platte für die vorhergesagten Synergie mutierten Bakterien).</li>
		<li>Beurteilen Sie die OD600 bei 0 und 18 h für E. Coli oder 48 h für C. Neoformans.</li>
		<li>Berechnen Sie Tabellenkalkulations-Software verwenden, die Netto-Wachstum durch Subtraktion der OD-600 von leeren Brunnen aus der Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen. Brunnen mit einem Z-Score von-2,5 identifizieren (Z-Score = Mittelwert - 2,5 * Standardabweichung). Diese Vertiefungen enthalten ein potenzieller Synergist kleines Molekül.</li>
		<li>Validieren Sie Bildschirm-Hits mit den Methoden in Schritt 3 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Antimicrobial+Resistance+Crisis%3A+Causes%2C+Consequences%2C+and+Management%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management.</a> Front Public Health. 2, 145(2014).</li>
<li>Butts, A., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+Drug+Discovery%3A+Something+Old+and+Something+New%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New.</a> PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870(2012).</li>
<li>Roemer, T., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+Drug+Development%3A+Challenges%2C+Unmet+Clinical+Needs%2C+and+New+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703(2014).</li>
<li>Oprea, T. I., Mestres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+Repurposing%3A+Far+Beyond+New+Targets+for+Old+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs.</a> AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).</li>
<li>Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosing+the+decline+in+pharmaceutical+R%26D+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).</li>
<li>Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., García-Contreras, S. J., García-Contreras, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+repurposing+as+an+alternative+for+the+treatment+of+recalcitrant+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections.</a> Front Microbiol. 6, 282(2015).</li>
<li>Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+Drug+Synergy+in+Antimicrobial+Treatments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments.</a> PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796(2010).</li>
<li>Cowen, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+Hsp90+function+as+a+powerful%2C+broadly+effective+therapeutic+strategy+for+fungal+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease.</a> P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).</li>
<li>Zuo, G. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+Antibacterial+and+Antibiotic+Effects+of+Bisbenzylisoquinoline+Alkaloids+on+Clinical+Isolates+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+Aureus+%28MRSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA).</a> Molecules. 16 (12), 9819(2011).</li>
<li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+drug+combinations%3A+interaction+and+network+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives.</a> Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).</li>
<li>Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+identification+and+rational+design+of+synergistic+small-molecule+pairs+for+combating+and+bypassing+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance.</a> PLOS Biol. 15 (6), e2001644(2017).</li>
<li>Brown, J. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+biology+of+a+fungal+meningitis+pathogen+using+chemical+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics.</a> Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).</li>
<li>Cokol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+exploration+of+synergistic+drug+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic exploration of synergistic drug pairs.</a> Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).</li>
<li>Borisy, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+multicomponent+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of multicomponent therapeutics.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13), 7977-7982 (2003).</li>
<li>Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+synergy%3F+The+Saariselk%C3%A4+agreement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">What is synergy? The Saariselkä agreement revisited.</a> Front Pharmacol. 6, 181(2015).</li>
<li>Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+assessed+by+checkerboard.+A+critical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+Landscape+of+a+Bacterial+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell.</a> Cell. 144 (1), 143-156 (2011).</li>
<li>Chandrasekaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).</li>
<li>Pradhan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenomic+profiling+of+Plasmodium+falciparum+as+a+tool+to+aid+antimalarial+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery.</a> Sci Rep. 5, 15930(2015).</li>
<li>Pethe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+genetic+screen+in+Mycobacterium+tuberculosis+identifies+carbon-source-dependent+growth+inhibitors+devoid+of+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy.</a> Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).</li>
<li>Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Hsp90+Genetic+Interaction+Network+in+Candida+albicans+Reveals+Environmental+Contingency+and+Rewired+Circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry.</a> PLoS Genetics. 8 (3), e1002562(2012).</li>
<li>Robbins, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Antifungal+Combination+Matrix+Identifies+a+Rich+Pool+of+Adjuvant+Molecules+that+Enhance+Drug+Activity+Against+Diverse+Fungal+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens.</a> Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).</li>
<li>Wildenhain, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+Synergism+from+Chemical-Genetic+Interactions+by+Machine+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning.</a> Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).</li>
<li>Spitzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+discovery+of+syncretic+drug+combinations+that+potentiate+the+antifungal+fluconazole%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole.</a> Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Synergistische niedermolekularer Paare können ein mächtiges Werkzeug in der Behandlung von mikrobiellen Infektionen, doch sie haben nicht ihre volle klinische Potenzial erreicht, weil synergistische Paare schwierig zu identifizieren sind. Dieses Dokument beschreibt eine Methode zur Identifizierung von synergistischen Paare viel schneller als einfache paarweisen Kombinationen. Durch die Verwendung chemischer Genetik Datasets, identifiziert O2M Mutanten mit Gen-Knockouts, die dann als einer Anzeige auf Bildschirm große ...

Antibiotika-resistente Bakterien dazu führen, dass mehr als 2 Millionen Infektionen und 23.000 Todesfälle jährlich in den Vereinigten Staaten nach der CDC-1. Neue Behandlungen sind erforderlich, um diese Infektionen zu überwinden. Strategien zu identifizieren, diese neuen Behandlungen umfassen die Entwicklung neuer antimikrobielle Medikamente oder die Wiederverwendung von kleinen Molekülen, die für andere Bedingungen zur Behandlung von mikrobiellen Infektionen2,3,4zugelassen. Neue Drogeentdeckung ist jedoch sehr kostspielig und zeitaufwendig. Wiederverwendung von Drogen kann nicht identifizieren neuartiger Medikamente oder Drogen richtet sich an5,6. Unser Labor konzentriert sich auf eine dritte Strategie als synergistische Kombinationstherapien bekannt. Synergistische Kombinationen auftreten, wenn zwei kleine Moleküle zusammen eine Wirksamkeit größer als die additive Wirkung von ihrer individuellen Wirksamkeiten7haben. Darüber hinaus können synergistische Kombinationen gegen einen Erreger resistent gegen eines der kleinen Moleküle des Paares neben mit weniger unerwünschten Wirkungen Ziel, wodurch sie große potenzielle8,9wirksam, 10.
Synergistische Paare sind selten, auftreten bei etwa 4-10 % der Droge Kombinationen11,12,13. So sind traditionelle Techniken wie paarweisen Bildschirmen schwieriger und zeitaufwendiger, mit Tausenden von möglichen Kombinationen aus einer kleinen Bibliothek von hundert Moleküle. Synergistische Wechselwirkungen können darüber hinaus in der Regel von der Aktivität der Verbindungen14vorhergesagt werden. Jedoch entwickelten die Autoren einen Hochdurchsatz-Ansatz für Bildschirm für synergistische Paare, genannt die Überlappung2 Methode (O2M)12. Diese hier beschriebene Methode ermöglicht schnellere, effizientere Identifikation dieser synergistischen Paare. O2M erfordert den Einsatz eines bekannten synergistische Paares und ein Chemie-Genetik-Dataset. Chemie-Genetik-Datasets werden generiert, wenn eine Bibliothek von Knockout-Mutanten in Anwesenheit von vielen verschiedenen kleinen Molekülen angebaut wird. Wenn ein Molekül in einem bekannten synergistische paar den gleichen Phänotyp aus einer bestimmten ko-Mutante als das zweite synergistische Molekül induziert, sollten alle anderen kleines Molekül, das den Phänotyp aus diesem gleichen Mutant entlockt auch mit jedem Mitglied der bekannten synergize. synergistische Paar. Diese Begründung wurde in der braunen Lab verwendet, um synergistische Antibiotika wirksam gegen Escherichia coli (E. Coli) und synergistische pilzbefallverhütende Droge Paare aktiv gegen die pathogenen Pilzes Cryptococcus Neoformans (C. identifizieren Neoformans)11,12. O2M ist nicht nur anpassungsfähig für verschiedene Krankheitserreger, sondern ermöglicht für das Screening der großen Bibliotheken der Moleküle, synergistische Paare einfach und schnell zu identifizieren. Screening mit der genetischen Mutant bezeichneten O2M ermöglicht es uns, nur diesen kleinen Molekülen vorhergesagt für Synergie zu validieren. So würde eine 2.000-Molekül-Bibliothek paarweise testen Monate dauern, während gäbe es nur 20 Moleküle in dieser Bibliothek synergize voraussichtlich, Test für Synergie jetzt eine Frage von Tagen dauert. O2M erfordert keine Programmierkenntnisse und das benötigte Equipment gibt es in den meisten Labors oder zentrale Einrichtungen. Neben der Forscher Wirkstoffkombinationen interessieren ist O2M Analyse für jeden von Interesse, die hat einen Drogentest absolviert und will ihre Hits zu erweitern, indem Sie wichtige Wechselwirkungen zu identifizieren. Unten ist das Protokoll für synergistische kleine Moleküle in Bakterien zu identifizieren, sowie die Validierung der vorhergesagten synergistischen Interaktionen in bekannten Assays15,16.

<table><tbody><tr><td>Bioscreen C</td><td>instrument</td><td>Growth Curves USA</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1</td><td>instrument</td><td>BioTek</td><td></td></tr><tr><td>M9 broth</td><td>reagent</td><td>Amresco</td><td>J863-500G</td></tr><tr><td>Casamino Acids</td><td>reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424-500</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>reagent</td><td>Sigma</td><td>G7021-10KG</td></tr><tr><td>Nicotinic Acid</td><td>reagent</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12683</td></tr><tr><td>Thiamine</td><td>reagent</td><td>Acros Organics</td><td>148991000</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;Dihydrate</td><td>reagent</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;Heptahydrate</td><td>reagent</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td></tr><tr><td>chemical-genetics dataset</td><td>dataset</td><td>examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text.</td><td></td></tr><tr><td>trimethoprim (example input drug; any can be used)</td><td>reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19552701</td></tr><tr><td>sulfamethoxazole (example test drug; any can be used)</td><td>reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15671125</td></tr></tbody></table>

high-throughput identification of synergistic drug combinations by the overlap2 method

Obwohl antimikrobielle Medikamente erheblich die Lebensdauer und die Qualität des Lebens im20. Jahrhundert zugenommen haben, droht Antibiotikaresistenz unsere gesamte Gesellschaft Fähigkeit, systemische Infektionen zu behandeln. In den Vereinigten Staaten allein töten Antibiotika-resistente Infektionen etwa 23.000 Menschen pro Jahr und rund 20 Milliarden US-Dollar im Gesundheitswesen zusätzliche Kosten. Ein Ansatz zur Bekämpfung der Antibiotikaresistenz ist die Kombinationstherapie, die in der kritischen frühen Phase der Infektion, besonders nützlich ist, bevor der infizierenden Organismus und seine Droge-Widerstand-Profil identifiziert wurden. Viele antimikrobielle Behandlungen verwenden Kombinationstherapien. Jedoch die meisten dieser Kombinationen sind additiv, d. h., dass die kombinierte Wirkung die gleiche wie die Summe der einzelnen antibiotische Wirksamkeit ist. Einige Kombinationstherapien sind synergistische: die kombinierte Wirkung ist viel größer als Additiv. Synergistische Kombinationen sind besonders nützlich, weil sie das Wachstum von Antibiotika resistente Stämme hemmen können. Diese Kombinationen sind jedoch selten und schwer zu identifizieren. Dies ist aufgrund der schieren Anzahl der Moleküle, die in gewissem Sinne paarweise getestet werden: eine Bibliothek mit 1.000 Moleküle hat 1 Million Kombinationsmöglichkeiten. So wurden Anstrengungen unternommen, Moleküle für Synergie vorherzusagen. Dieser Artikel beschreibt unsere Hochdurchsatz-Methode für die Vorhersage synergistische niedermolekularer Paare als Überlappung2 Methode (O2M) bekannt. O2M verwendet Muster aus chemisch-genetische Datasets Mutanten zu identifizieren, die überempfindlich auf jedes Molekül in einem synergistischen paar aber nicht auf andere Moleküle. Die braunen Lab nutzt dieses Wachstum Unterschied durch Ausführen eines Hochdurchsatz-Bildschirms für Moleküle, die das Wachstum von Mutant aber nicht Wildtyp-Zellen hemmen. Das Labor Arbeit zuvor identifizierten Moleküle, die mit dem Antibiotikum Trimethoprim und der antimykotische Wirkstoff Fluconazol mit dieser Strategie synergize. Hier präsentieren die Autoren eine Methode, um Bildschirm für neuartige synergistische Kombinationen, die für mehrere Mikroorganismen verändert werden kann.

Schachbrett-Assays sind eine semi-quantitative Methode zur Messung von synergistischer Interaktionen. Das Endergebnis ausgegeben, FICI, bestimmt wenn eine Arzneimittelkombination synergistische (FICI ≤0.5) gilt, nicht-wechselwirkenden (0,5 < FICI < 4), oder antagonistischen (FICI ≥4.0). Abbildung 1 veranschaulicht, wie die Droge Gradienten in einem Schachbrettmuster-Assay einrichten. Abbildung 2 veranschaulicht gemeinsame Erg...

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High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistische Wirkstoffkombinationen sind schwierig und zeitaufwändig, empirisch zu identifizieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung und Validierung von synergistischen kleine Moleküle.

Hochdurchsatz-Identifizierung von synergistischen Wirkstoffkombinationen durch die Überlappung2 Methode

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

high-throughput-identification-synergistic-drug-combinations-overlap2

Research

JoVE Journal

Genetics

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

11.7K Aufrufe.  University of Utah. Synergistische Wirkstoffkombinationen sind schwierig und zeitaufwändig, empirisch zu identifizieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung und Validierung von synergistischen kleine Moleküle.

Serie: High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy against cancer. Here we provide a protocol to identify a rational combination at the preclinical step. First, we describe a cell-based assay to assess the synergism between anticancer mAb and cytotoxic drugs, that uses the combination index equation of Chou and Talalay1. This includes the measurement of tumor cell drug- and antibody-sensitivity using an MTT assay, followed by an automated computer analysis to calculate the combination index (CI) values. CI values of &lt;1 indicate synergism between tested mAbs and cytotoxic agents1. To corroborate the in vitro findings in vivo, we further describe a method to assess the combination regimen efficacy in a xenograft tumor model. In this model, the combined regimen significantly delays tumor growth, which results in a significant extended survival in comparison to single-agent controls. Importantly, the in vivo experimentation reveals that the combination regimen is well tolerated. This protocol allows the effective evaluation of anticancer drug combinations in preclinical models and the identification of rational combination to evaluate in clinical trials.

This protocol describes how to assess synergism between an anticancer antibody and antineoplastic drugs in preclinical models by using the combination index equation of Chou and Talalay.

Potenzierung der Anti-Krebs-Antikörper-Wirksamkeit von Zytostatika: Nachweis von Antikörper-Wirkstoff-Synergismus mit der Kombination-Index-Gleichung

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

Forschung

Krebsforschung

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of both synthetic lethal interactors leads to loss of cell viability or cell death. The best studied synthetic lethal interaction is between BRCA1/2 and PARP1, with PARP1 inhibitors being used in clinical practice to treat patients with BRCA1/2 mutated tumors. Large genetic screens in model organisms but also in haploid human cell lines have led to the identification of numerous additional synthetic lethal interaction pairs, all being potential targets of interest in the development of novel tumor therapies. One approach is to therapeutically target genes with a synthetic lethal interactor that is mutated or significantly downregulated in the tumor of interest. A second approach is to formulate drug combinations addressing synthetic lethal interactions. In this article, we outline a data integration workflow to evaluate and identify drug combinations targeting synthetic lethal interactions. We make use of available datasets on synthetic lethal interaction pairs, homology mapping resources, drug-target links from dedicated databases, as well as information on drugs being investigated in clinical trials in the disease area of interest. We further highlight key findings of two recent studies of our group on drug combination assessment in the context of ovarian and breast cancer.

Large genetic screens in model organisms have led to the identification of negative genetic interactions. Here, we describe a data integration workflow using data from genetic screens in model organisms to delineate drug combinations targeting synthetic lethal interactions in cancer.

Ein Datenintegrations-Workflow zur Identifizierung von Arzneimittelkombinationen, die auf synthetische tödliche Wechselwirkungen abzielen

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in glioblastoma (GBM), the most prevalent and devastating primary brain tumor. The presence of GSCs makes the GBM very refractory to most of individual targeted agents, so high-throughput screening methods are required to identify potential effective combination therapeutics. The protocol describes a simple workflow to enable rapid screening for potential combination therapy with synergistic interaction. The general steps of this workflow consist of establishing luciferase-tagged GSCs, preparing matrigel coated plates, combination drug screening, analyzing, and validating the results.

Ein schneller Screening-Workflow zur Identifizierung einer potenziellen Kombinationstherapie für GBM unter Verwendung von vom Patienten abgeleiteten Gliomstammzellen

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Spheroid Drug Sensitivity Screening in Glioma Stem Cell Lines

In vitro drug sensitivity screens are important tools in the discovery of anti-cancer drug combination therapies. Typically, these in vitro drug screens are performed on cells grown in a monolayer. However, these two-dimensional (2D) models are considered less accurate compared to three-dimensional (3D) spheroid cell models; this is especially true for glioma stem cell lines. Cells grown in spheres activate different signaling pathways and are considered more representative of in vivo models than monolayer cell lines. This protocol describes a method for in vitro drug screening of spheroid lines; mouse and human glioma stem cell lines are used as an example. This protocol describes a 3D spheroid drug sensitivity and synergy assay that can be used to determine if a drug or drug combination induces cell death and if two drugs synergize. Glioma stem cell lines are&#160;modified to express RFP. Cells are plated in low attachment round well bottom 96 plates, and spheres are allowed to form overnight. Drugs are added, and the growth is monitored by measuring the RFP signal over time using the Incucyte live imaging system,&#160;a fluorescence microscope embedded in the tissue culture incubator. Half maximal inhibitory concentration (IC50), median lethal dose (LD50), and synergy score are subsequently calculated to evaluate sensitivities to drugs alone or in combination. The three-dimensional nature of this assay&#160;provides a more accurate reflection of tumor growth, behavior, and drug sensitivities in vivo, thus forming the basis for further preclinical investigation.

<meta charset="utf8"></head><body>Screening der Empfindlichkeit von Sphäroiden in Gliom-Stammzelllinien

In vitro drug sensitivity screens are important tools for discovering anti-cancer drug combinations. Cells grown in spheres activate different signaling pathways and are considered more representative of in vivo models than monolayer cell lines. This protocol describes a method for in vitro drug screening for spheroid lines.

Screening der Empfindlichkeit von Sphäroiden in Gliom-Stammzelllinien

In vitro drug sensitivity screens are important tools in the discovery of anti-cancer drug combination therapies. Typically, these in vitro drug screens ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

Immunologie und Infektion

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The goal of computational methods for drug repurposing is to enable solutions for safer, cheaper and faster drug discovery. Towards this end, we developed a novel method that integrates genetic and clinical phenotype data from large-scale GWAS and PheWAS studies with detailed drug information on the concept of transitive Drug-Gene-Disease triads. We created "RE:fine Drugs," a freely available, interactive dashboard that automates gene, disease and drug-based searches to identify drug repurposing candidates. This web-based tool supports a user-friendly interface that includes an array of advanced search and export options. Results can be prioritized in a variety of ways, including but not limited to, biomedical literature support, strength and statistical significance of GWAS and/or PheWAS associations, disease indications and molecular drug targets. Here we provide a protocol that illustrates the functionalities available in the "RE:fine Drugs" system and explores the different advanced options through a case study.

Here we describe a protocol using the web-based drug repurposing hypothesis generation tool: "RE:fine Drugs." This protocol can be modified to a user's preferences at the level of the query type (gene, drug or disease) and/or the range of available advanced options.

Drug Repurposing Hypothesengenerierung Mit der &quot;RE: Fein Drugs&quot; System

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...

Medizin

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR bacteria are increasingly becoming a necessity. One such approach is combination therapy, in which two or more antibiotics are used together to treat an infection against which one or both of the drugs may be ineffective alone. When two drugs, in combination, exert a greater than additive effect, they are considered synergistic. In vitro investigation of synergistic activity is an important first step in evaluating the possible efficacy of drug combinations. Two main in vitro synergy testing methods have been developed: the checkerboard array and the time-kill study. In this paper, we present an automated checkerboard array method that makes use of inkjet printing technology to increase the efficiency and accuracy of this technique, as well as a standard manual time-kill synergy method. The automated checkerboard array can serve as a high-throughput screening assay, while the manual time-kill study provides additional, complementary data on synergistic activity and killing.
The checkerboard array is a modification of standard minimum inhibitory concentration (MIC) testing, in which bacteria are incubated with antibiotics at different concentration combinations and evaluated for growth inhibition after overnight incubation. Manual performance of the checkerboard array requires a laborious and error-prone series of calculations and dilutions. In the automated method presented here, the calculation and dispensing of required antibiotic stock solution volumes are automated through the use of inkjet printer technology. In the time-kill synergy assay, bacteria are incubated with the antibiotics of interest, both together and individually, and sampled at intervals over the course of 24 h for quantitative culture. The results can determine whether a combination is synergistic and whether it is bactericidal, and provide data on inhibition and killing of bacteria over time.

Antimicrobial synergy testing is used to evaluate the effect of two or more antibiotics used in combination and is typically performed by one of two methods: the checkerboard array or the time-kill assay. Here, we present an automated, inkjet printer-assisted checkerboard array synergy technique and a classic time-kill synergy study.

Antimikrobielle Synergie Tests durch Tintenstrahldrucker-gestützte, automatisierte schachbrettartige Anordnung und die manuelle Zeit-Kill-Methode

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Biologie

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many doses, allow sensitive measurement of drug interactions. However, these assays are costly and do not scale well for measuring interaction among many drugs. Several recent studies have reported drug interaction measurements using a diagonal sampling of the traditional checkerboard assay. This alternative methodology greatly decreases the cost of drug interaction experiments and allows interaction measurement for combinations with many drugs. Here, we describe a protocol to measure the three pairwise interactions and one three-way interaction among three antibiotics in duplicate, in five days, using only three 96-well microplates and standard laboratory equipment. We present representative results showing that the three-antibiotic combination of Levofloxacin + Nalidixic Acid + Penicillin G is synergistic. Our protocol scales up to measure interactions among many drugs and in other biological contexts, allowing for efficient screens for multi-drug synergies against pathogens and tumors.

In this protocol, we describe how to make Loewe additivity-based drug interaction measurements for pairwise and three-way drug combinations.

Diagonale Methode zur Maßnahme Synergie zwischen beliebig vieler Medikamente

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

Hochdurchsatz-Identifizierung von synergistischen Wirkstoffkombinationen durch die Überlappung² Methode

Zusammenfassung

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Screening der Empfindlichkeit von Sphäroiden in Gliom-Stammzelllinien

Screening der Empfindlichkeit von Sphäroiden in Gliom-Stammzelllinien

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Drug Repurposing Hypothesengenerierung Mit der "RE: Fein Drugs" System

Antimikrobielle Synergie Tests durch Tintenstrahldrucker-gestützte, automatisierte schachbrettartige Anordnung und die manuelle Zeit-Kill-Methode

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening

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