Manuelle Checkerboard-Array-Synergietests sind eine arbeitsintensive und fehleranfällige Methode. Im Gegensatz dazu verbessert unsere automatisierte, auf Tintenstrahldruckern basierende Schachbrettmethode die Geschwindigkeit, Genauigkeit und den Durchsatz erheblich. Die automatisierte Checkerboard-Methode ermöglicht es, eine große Anzahl von Medikamenten auf synergistische Kombinationen zu untersuchen, während die Time-Kill-Methode die Aktivität dieser Kombinationen bestätigen und weiter erforschen kann.
Neuartige Antibiotika-Entdeckung hält nicht Schritt mit der Ausbreitung der Resistenz, aber die Untersuchung von synergistischen Kombinationen bietet eine Möglichkeit für die Rettung bestehender Medikamente zur Behandlung resistenter Bakterien. Obwohl wir diese Technik mit Antibakterien demonstrieren, könnte es auch mit anderen Klassen von antimikrobiellen Mitteln oder sogar für verschiedene Arten von Kombinationsmedikamenten oder ZusammengesetztenTests verwendet werden. In diesem Video zeigen wir eine automatisierte Checkerboard-Array-Methode und eine manuelle Time-Kill-Methode.
Wir empfehlen, checkerboard-Array-Studien zuerst durchzuführen, um vielversprechende Kombinationen zu identifizieren und diese dann mit Time-Kill-Studien weiter zu untersuchen. Zunächst erstellen Sie antimikrobielle Stofflösungen aus Colistin und Minocyclin und führen Sie dann eine Qualitätskontrolle der Bestandslösungen durch, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Als nächstes fügen Sie etwa einen Milliliter 0,9% Natriumchlorid, Saline, zu 12-Millimeter-x-75-Millimeter-Rundglaskulturröhren hinzu.
Wählen Sie eine oder zwei Kolonien aus einer Nachtplatte von Bakterien, und legen Sie sie in die Kulturröhren. Wirbeln Sie die Rohre sanft, um die Bakterien in der Lösung zu suspendieren. Überprüfen Sie die Konzentration von Bakterien mit einem McFarland-Reader.
Passen Sie die Konzentration an, indem Sie mehr Saline oder mehr Bakterien hinzufügen, um eine 0,5 McFarland Trübung zu erreichen. Verdünnen Sie dann die Bakterien einbis 300, indem Sie 100 Mikroliter der Suspension zu 30 Millilitern kation-angepasster Mueller-Hinton-Brühe in einem 50-Milliliter-Konischen Rohr hinzufügen, um eine endgültige Zelldichte von fünf mal 10 zu den fünften koloniebildenden Einheiten pro Milliliter zu erreichen. Bereiten Sie nun die antimikrobiellen Mittel für den Druck vor, indem Sie das begleitende Textprotokoll mitverfolgen.
Speichern Sie das Protokoll, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Ausführen oben links, gefolgt von der Start-Schaltfläche. Laden Sie eine 384-Well-Platte in den Plattenhalter und drücken Sie Loaded unter der Load Plate 1 Synergy-Eingabeaufforderung. Platzieren Sie dann eine T8+-Kassette in den Kassettensteckplatz, und drücken Sie unter der Eingabeaufforderung T8+Kassette laden.
Wenn Sie dazu aufgefordert werden, fügen Sie den angegebenen Reservoirs auf der Kassette eine Antibiotika-Lagerlösung hinzu. Nachdem jede Lösung hinzugefügt wurde, drücken Sie die Schaltfläche Ausgefüllt. Sobald der D300 Dispenser jedem Brunnen Antibiotikainmengen in entsprechenden Mengen hinzugefügt hat und das Feld Abgeschlossen auslaufen angezeigt wird, klicken Sie auf Schließen, entfernen Sie die Platte, und schalten Sie die D300 aus.
Als nächstes gießen Sie die zuvor vorbereitete bakterielle Suspension in ein steriles Reagenzreservoir. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter der Suspension zu allen Brunnen im Schachbrett-Array hinzuzufügen. Dann 50 Mikroliter kation-angepasste Mueller-Hinton-Brühe ohne Bakterien in einen leeren Brunnen geben.
Dies wird die negative Kontrolle gut, um Sterilität der Medien zu bestätigen. Inkubieren Sie in einem 35-Grad-Grad-Luft-Inkubator für 16 bis 20 Stunden. Um den Test zu analysieren, folgen Sie dem begleitenden Textprotokoll.
Für den Time-Kill-Synergietest erneut die im Textprotokoll beschriebenen antimikrobiellen Bestandslösungen vorbereiten. Dann machen Sie eine 0,5 McFarland Suspension des Testorganismus in steriler Saline. Fügen Sie 100 Mikroliter der 0,5 McFarland Suspension zu fünf Milliliter NCM in einem 25 x 150 Millimeter Glas runden Boden Kulturrohr mit Edelstahlverschluss, und Wirbel sanft zu mischen.
Mit einer sterilen Impfschleife, Isolierung Streifen einen Tropfen der verdünnten Suspension auf eine Blut-Agar-Platte, und inkubieren Sie die Platte bei 35 Grad Celsius in der Umgebungsluft, um inoculum Reinheit zu bestätigen. Ersetzen Sie den Verschluss an der Röhre, und inkubieren Sie ihn in einem Reagenzglasregal auf einem Shaker bei 35 Grad Celsius in der Umgebungsluft für mindestens 3 Stunden, bis das Wachstum der logarithmischen Phase erreicht ist. Während die Anfangskultur inkubiert wird, fügen Sie fünf autoklavierten Glaskulturröhren 10 Milliliter kationangepasste Mueller-Hinton-Brühe hinzu.
Für eine Time-Kill-Synergie-Studie sollte mindestens ein Medikament in einer Konzentration sein, die die Wachstumskurve nicht einzeln beeinflusst. Dies kann durch die Bewertung der Auswirkungen einzelner Arzneimittelkonzentrationen vor der Synergiestudie bestimmt werden. Fügen Sie der ersten Röhre 10 Mikroliter Einmilligramm pro Milliliter Colistin-Lager hinzu, um eine endgültige Colistinkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten, da dies eine Konzentration ist, die gegen den in diesem Beispiel verwendeten Stamm unwirksam ist.
Für die zweite Röhre, fügen Sie 10 Mikroliter ein Milligramm pro Milliliter Minocyclin-Lager, um eine endgültige Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Diese Konzentration ist auch gegen den in diesem Beispiel verwendeten Stamm wirkungslos. In die dritte Röhre, fügen Sie 10 Mikroliter ein Milligramm pro Milliliter Minocyclin-Lager und 10 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter Colistin-Lager.
Dies ist die gleiche Menge an Colistin und Minocyclin in den Rohren eins und zwei verwendet. In der vierten und fünften Tube keine Antibiotika hinzufügen. Dies wird die Wachstumskontrolle bzw. die negativen Kontrollrohre sein.
Als nächstes bereiten Sie 96 Tiefbrunnen-Polypropylenplatten mit Zwei-Milliliter-Bohrungen für serielle Verdünnungen vor, indem Sie 900 Mikroliter steriler Kochchen zu den Reihen B durch H der Spalten eins bis vier mit einer Mehrkanalpipette hinzufügen. Wenn sich die Kultur in der logarithmischen Wachstumsphase befindet, entfernen Sie die Kulturröhre aus dem Shaker und wirbeln Sie sie sanft aus. Übertragen Sie einen Milliliter der Suspension auf ein 12 mal 75 Millimeter großes Glaskulturrohr und überprüfen Sie die Dichte mit einem McFarland-Reader.
Wenn die Dichte kleiner als 1,0 McFarland ist, geben Sie die Röhre zum Shaker zurück und brüten Sie länger. Wenn es größer als 1.0 McFarland ist, fügen Sie kation-angepasste Mueller-Hinton-Brühe in die Röhre, Wirbel sanft, und Re-Sample, bis die Suspension bei 1.0 McFarland ist. Es ist wichtig, dass sich die Kultur bei der Vorbereitung des Startinokulums in der logarithmischen Wachstumsphase befindet.
Sie können eine Wachstumskurve konstruieren, um zu bestimmen, wann ein Organismus diese Phase erreicht. Dann 100 Mikroliter der 1.0 McFarland Suspension zu den Röhren eins bis vier hinzufügen und sanft wirbeln. Unmittelbar nach dem Mischen und nach einer, zwei, vier, sechs und 24 Stunden, entfernen Sie ein 150-Mikroliter-Aliquot aus jedem Kulturrohr, indem Sie das Rohr so kippen, dass nur die sterile Pipettenspitze in das Rohr und nicht die unsterile Pipettenwelle während des Aliquot-Entzugs gelangt.
Fügen Sie Aliquots zu aufeinanderfolgenden Brunnen in der ersten Reihe der zuvor vorbereiteten 96-Tiefbrunnenplatte hinzu. Bringen Sie Dierohre sofort nach dem Entfernen von Aliquots zu jedem Zeitpunkt an einen Reagenzglasträger auf einem Shaker in einem 35-Grad-Grad-Luft-Inkubator zurück. Entfernen Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter aus Zeile A der Platte, und fügen Sie sie der Zeile B hinzu, die 900 Mikroliter Kochchen enthalten und so eine Verdünnung von 1 bis 10 bilden.
Pipette die Lösung nach oben und unten vier bis fünf Mal zu mischen, und dann die Spitzen zu entsorgen. Zuerst beschriften Sie Mueller-Hinton Agar-Platten mit den zu verdünnenden Antibiotika-Bedingungen und Verdünnung. Dann die verdünnten Proben für Koloniezahlen mit der Fallplattenmethode mit einer Mehrkanalpipette mit extralangen Spitzen plattieren.
Entfernen Sie 10 Mikroliter von jedem Brunnen in Spalte eins, und geben Sie sorgfältig in einer Reihe auf die entsprechend beschriftete Platte. Fahren Sie fort, bis alle Reihen auf Platten abgegeben werden. Darüber hinaus legen Sie am 24-Stunden-Zeitpunkt einen 10-Mikroliter-Tropfen, der direkt aus dem Negativkontrollrohr entnommen wird, auf die dafür vorgesehene Stelle, um die Sterilität zu testen.
Dann alle Platten inumlegen und über Nacht bei 35 Grad Celsius in der Umgebungsluft bebrüten. Zählen Sie dann die Anzahl der Kolonien auf jedem Gebiet, und berechnen Sie die Zelldichte. Markieren Sie Kolonien mit einem feinspitzen permanenten Marker auf der Rückseite der Platte, um Doppelzählungen oder fehlende Kolonien zu vermeiden.
Identifizieren Sie für jede Verdünnungsserie Tropfen mit drei bis 30 Kolonien. Zählen Sie die Kolonien in diesen Tropfen, und erfassen Sie die Zählung zusammen mit dem Verdünnungsfaktor. Hier ist ein Raster aus einem Schachbrett-Array-Synergieexperiment zu sehen, bei dem Minocyclin in Konzentrationen von null bis 32 Mikrogramm pro Milliliter mit Colistin in Konzentrationen von null bis 16 Mikrogramm pro Milliliter kombiniert und gegen einen E.coli-Stamm getestet wurde.
Brunnen mit OD600-Werten unter 07 stellen kein Wachstum dar und sind rot schattiert, während Brunnen mit OD600-Werten über oder gleich 07 Wachstum darstellen und grün schattiert sind. Für jedes Medikament ist die minimale hemmende Konzentration die niedrigste Konzentration von Medikamenten, die das bakterielle Wachstum hemmt. Für Minocyclin, Dies ist 32 Mikrogramm pro Milliliter, und für Colistin, Es ist acht Mikrogramm pro Milliliter.
Die Schattierung bleibt hier erhalten, aber Werte innerhalb der Brunnen, in denen das Wachstum gehemmt wird, werden durch fraktionelle hemmende Konzentration oder FIC-Indexwerte ersetzt. In jedem Brunnen wird der FIC-Index jedes Medikaments berechnet, indem die Konzentration von Antibiotika in diesem Brunnen durch die minimale hemmende Konzentration des Arzneimittels dividiert wird. Brunnen mit einem FIC-Index von weniger als oder gleich 0,5, der als Grenzwert für Synergien gilt, werden mit einer gebrochenen Linie angegeben, und der Brunnen mit dem niedrigsten FIC-Index wird fett gedruckt.
Da sich der minimale FIC-Wert im synergistischen Bereich befindet, wird die Kombination als synergistisch betrachtet. Ein Beispiel für einen Fall, der keine Synergie zeigt, wird hier gezeigt, da der minimale FIC-Index, bei dem das Wachstum gehemmt wird, eins ist, der größer als 0,5 ist. Schließlich traten in diesem Beispiel mehrere übersprungene Brunnen auf, was ein bakterielles Wachstum darstellt, das gehemmt wird, trotz des Vorhandenseins von Bakterienwachstum in angrenzenden Brunnen mit höheren Konzentrationen von Antibiotika.
Wenn mehr als ein übersprungener Brunnen in einem Schachbrett-Array aufgetreten ist, sollten die Ergebnisse verworfen und der Test wiederholt werden. Ein Beispiel für ein Diagramm, das die Ergebnisse eines Time-Kill-Synergie-Assays zeigt, wird hier vorgestellt. Einzelheiten zur Interpretation des Time-Kill-Synergie-Assays finden Sie im begleitenden Textprotokoll.
Weitere Informationen über die Aktivität synergistischer Kombinationen können durch Auswertungen der Pharmakokinetik und Pharmakodynamik sowie durch In-vivo-Studien mit Tiermodellen gewonnen werden. Befolgen Sie bei der Arbeit mit Bakterien immer die entsprechenden Sicherheitsverfahren, einschließlich der Verwendung persönlicher Schutzausrüstung. Wenn Sie Aerosole erzeugen oder hochriskante Krankheitserreger verwenden, führen Sie alle Arbeiten in einem Biosicherheitsschrank durch.
