Name: quantitative and qualitative method for sphingomyelin by lc-ms using two stable isotopically labeled sphingomyelin species
Uploaded: 2018-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Forschungsstipendium für das Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie von Japan (KAKENHI), K.H (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), K.Y (#26461532) und ein Stipendium für das Studium der hartnäckigen Krankheit-Projekt vom Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Wohlfahrt (K.Y #201510032A). Wir danken der Edanz Gruppe (www.edanzediting.com/ac) für die Bearbeitung eines Entwurfs des Manuskripts.

Finden Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (SDB) vor dem Gebrauch. Tragen Sie Handschuhe um Probe Verunreinigungen von der Haut abgeleitet SM zu minimieren. Dieses Protokolls galt, HeLa-Zellen gewachsen in Adlers minimale wesentliche Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1.000 U/L Penicillin und Streptomycin 100 mg/L.
1. Vorbereitung der Lipid-Proben
Hinweis: Es ist wichtig, dass alle Glaswaren, einschließlich Reagenzgläser mit Teflon ausgekleidet Schraubverschlüsse Waschmittel-frei sein.
<ol><li>Gewinnung von insgesamt Lipid-Anteil aus Zelle Homogenat mit Bligh & Dyer Methode7<ol>
<li>Entfernen Sie die Kultur (oder konditioniert) Medien von 10 cm Gewebe Kulturschale und zweimal mit 6 mL eiskaltem PBS abspülen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL eiskaltem PBS in 10 cm Gewebe Kulturschale P1000 Pipette. Ernte der Zellen mit Zelle Schaber und sammeln Sie in 2,0 mL silikonisierte Kunststoffrohre.</li>
		<li>Entfernen Sie nach Zentrifugation (1.000 × g, 5 min, 4 ° C) den Überstand durch ein P1000 Pipette.</li>
		<li>1 mL Methanol hinzugeben. Vortex Rohre kurz und bei 200 W für 5 min in ein Bad-Typ sonikator beschallen. Hinweis: Einstellen Sie das Wasser-Niveau in einem Bad-Typ sonikator so, dass die Zelle Pellet effizient homogenisiert wird.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zelle Homogenat in Methanol Pipette in Reagenzgläser (13 mm x 100 mm) mit Schraubverschlüssen Teflon ausgekleidet.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL Methanol, 1 mL Chloroform, 0,8 mL doppelt destilliertem Wasser und 50 µL 10 µmol/L des internen standard D18:1 /(D31)-16:0 SM in jedes Reagenzglas.</li>
		<li>Vortex Reagenzgläser energisch für 5 min bei Raumtemperatur. Hinweis: an dieser Stelle eine einzelne Phase (Chloroform/Methanol/Wasser = 1/2/0,8 (V/V/V)) wird gebildet.</li>
		<li>1 mL Chloroform und 1,0 mL doppelt destilliertes Wasser zugeben.</li>
		<li>Vortex-Rohre kräftig bei 2.500 u/min für 5 min bei Raumtemperatur. Hinweis: an dieser Stelle werden die wässrigen (oben) und organischen (unteren) Phase getrennt.</li>
		<li>Nach Zentrifugation (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), zu sammeln und die untere Phase in Einweg-Glasröhren (untere Anfangsphase) übertragen. Hinweis: Sammeln Sie die untere Phase mit einer Pasteurpipette und eine Pipette Sicherheitsfilter. Setzen Sie die PIPETTENSPITZE in die untere Phase, die kleine Handpumpe neben der 'E'-Ventil, die obere Phase und Grenzflächen Flusen in der Pipettenspitze liefern und dann die untere Phase in die Pipette siphon.</li>
		<li>Fügen Sie 2 mL Chloroform in den Reagenzgläsern und Wirbel Rohre kräftig bei 2500 u/min für 5 min bei Raumtemperatur ausreichend mit der oberen Phase und Grenzflächen Flusen zu mischen.</li>
		<li>Nach Zentrifugation (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), sammeln Sie und übertragen Sie die modifizierte untere Phase in Einweg-Glasröhren mit der unteren Anfangsphase wie in Schritt 1.1.10 beschrieben.</li>
		<li>Stellen der Glasröhren unter einer Stickstoff-Stream und die organischen Lösungsmitteln in den gesammelten untere Phase vollständig zu entfernen.</li>
		<li>Rekonstruieren Sie die Proben mit 500 µL von Methanol oder Ethanol, mit 0,02 µm Filter Filtern und speichern in Glasfläschchen bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Probenvorbereitung für die Eichkurve Konstruktion und Validierung der Methode<ol>
<li>Fügen Sie 50 µL 0.1, 0.5, 1, 5, 10 oder 50 µmol/L standard Verbindung (D18:1 /(D9)-18:1 SM) in Reagenzgläsern mit Schraubverschlüssen Teflon ausgekleidet.</li>
		<li>Fügen Sie Zelle Homogenat in jedes Reagenzglas und 1 mL fügen Sie Methanol hinzu. Hinweis: Die Höhe der Zelle Homogenat als Matrix variiert je nach jedem Experiment. Wenn die SM-Arten in Proben von Zellen in der Kulturschale 10 cm abgeleitet routinemäßig analysiert werden, sollte die Höhe der Zelle Homogenat in jedes Reagenzglas in der Nähe der Zellen in der Kulturschale 10 cm sein.</li>
		<li>Extrahieren Sie die gesamten Lipid-Anteil beschriebenen Schritte 1.1.6-1.1.14.</li>
		<li>Bereiten Sie Qualitätskontrolle vor (QC) Proben für die Validierung der Methode, wie in 1.2.1-1.2.3 Schritten umherspaziert. Drei QC Proben mit verschiedenen Konzentrationen der standard Verbindung vorbereiten (D18:1 /(D9)-18:1 SM): innert 3 x die untere Grenze der Standardkurve (QC-Low, QC-L), eines in der Nähe der Mitte (QC-Mitte, QC-M), und eines in der Nähe der oberen Grenze der Standardkurve (QC-hoch, QC-H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) SM-Analyse von LC-ESI-MS/MS
<ol><li>Vorbereitung der mobilen phase<ol>
<li>Mischen Sie das Lösungsmittel (Acetonitril/Methanol/DdH2O = 2/2/1 (V/V/V) für die wässrige Phase und Isopropanol für die organische Phase) in Glas-Flaschen mit Schraubverschlüssen Teflon ausgekleidet und für 5 min in ein Bad-Typ sonikator beschallen.</li>
		<li>Hinzufügen von Ameisensäure (Endkonzentration 26,4 Mmol/L) und NH4OH (14,9 Mmol/L) in jedem mobilen Phase.</li>
	</ol></li>
	<li>Qualitative Analyse der SM von LC-ESI-MS3<ol>
<li>Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-System zu aktivieren, die Glasflaschen, die mobile Phasen enthalten Einlass Röhrchen gesteckt und bereinigen die HPLC-Linien. Eine C-18 -HPLC-Säule (1,5 mm i.d. × 100 mm Länge, Partikel Größe 3,0 µm) mit der HPLC-Anlage verknüpfen, halten die Temperatur in der Spalte Ofen bei 50 ° C und Zustand der Spalte mit der wässrigen mobile Phase 100 µL/min. setzen die Proben in einem probenrack in der autosampl äh.</li>
		<li>Legen Sie die Parameter der triple Quadrupol und Quadrupol lineare Ionenfalle Massenspektrometrie System für MS3 -Analyse, wie in Tabelle 1 und Tabelle 2 sowie der ersten und zweiten Vorläufer Ionen der SM-Arten von Interesse aufgeführt.<ol>
<li>Doppelklick auf das Icon für die Datenerfassung, Doppelklick die Hardware-Konfiguration, wählen Sie "LC + QTRAP4500 + Valve" und klicken Sie auf "Profil aktivieren".</li>
			<li>Erstellen Sie einen neuen Unterordner, indem Sie auf "Neues Unterprojekt" und "OK".</li>
			<li>Klicken Sie auf die Registerkarte "Datei", wählen Sie "Neu" und "Übernahme-Methode" und "OK". Klicken Sie auf das Symbol 'Mass Spec' und 'MS' tab. Wählen Sie Scan-Typ als "MS/MS/MS (MS3)", Abtastrate als 10.000 Da/s, Polarität als "Negativ" und "Dauer" als ganze Zeit analysiert (min) sein. M/Z 'Start (Da)' und 'Stop (Da)' als zu scannenden Bereichs festgelegt. Stellen Sie die m/Z der 1. und 2. Vorläufer Ionen des Ziels SM Arten von Interesse. Hinweis: Um mehrere SM-Arten zu analysieren, markieren die "-MS3" Symbol, klicken Sie rechts, wählen Sie "Copy dieses Experiment" und setzen Sie dann die m/Z der 1. und 2. Vorläufer Ionen anderer SM-Arten.</li>
			<li>Wählen Sie die Registerkarte "Advanced MS", und legen Sie jeden Parameter wie folgt: Scan-Modus als "Profil", Schrittweite als 0,12 (Da), Auflösung Q1 und Q3 'Einheit' und 'Beleuchtet', bzw. Intensität Schwelle als 0, Abbindezeit 50 (ms), Pause zwischen Masse reicht als 1,5 ms, wählen Sie "dynamische Zeit zu füllen ", Q3 Eintrittsbarriere als 8V und Erregung Zeit als 25 ms.</li>
			<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche "Parameter bearbeiten" im Reiter "MS" und wählen Sie die "Quelle/Gas" tab. Legen Sie die Parameter der Vorhang Gas, Kollision Gas, Ionspray Spannung, Temperatur, Ionen-Quelle gas1 und gas2 wie in Tabelle 1aufgeführt. Dann wählen Sie "Compound" tab. legen die Parameter der declustering Potenzial, Eingang Potenzial, Aufprallenergie, Anregungsenergie und Aufprallenergie verteilt wie in Tabelle 2aufgeführt.</li>
			<li>Markieren Sie "Integrierte Valco Valve" und wählen Sie 'Position Name für Schritt 0' a und "B" als Position für insgesamt 5,0 min Zeit. Legen Sie auch 'A' als Position für insgesamt 70,0 min..</li>
			<li>Markieren Sie "Shimadzu LC-System". Wählen Sie die Registerkarte "Pump" und legen Sie Pumpen Modus als binäre Flow, Gesamtfluss als 0,28 mL/min und maximal druckgrenzen als 20,0 MPa. Wählen Sie die Registerkarte "Autosampler" und stellen Sie die Spülung Lautstärke als 200 µL, Nadel Hub 52 mm, Spülung 35 µL/s Geschwindigkeit, Geschwindigkeit als 5.0 µL/s Probenahme, Spülzeit 25,0 min, spülen Sie Dip-Mal als 5 s und spülen Modus als "Vor und nach dem Absaugen".<ol>
<li>Darüber hinaus ermöglichen die Kühlereinheit, als 4 ° C kühlere Temperatur einstellen und das Fläschchen Nadel Regelhub 52 mm. Wählen Sie die Registerkarte "Ofen" ermöglichen den Ofen und die Ofentemperatur und die maximale Temperatur 50 ° C und 85 ° C "bzw." festgelegt.</li>
				<li>Wählen Sie die Registerkarte "Controller" und aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Einschalten". Wählen Sie die Registerkarte "Zeitprogramm" und legen Sie die Lösungsmittel Steigungen wie folgt: Lösungsmittel A / B im Verhältnis 100/0 für 5 min Programm lineare Änderungen an 80/20 über 4 min, 35/65 über 50 min und 25/75 über 1 min. danach , halten Sie sie an 25/75 für 10 min, dann linear auf 100/0 über 4 min. Speichern Sie anschließend die Methode.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Batch-Datei erstellen<ol>
<li>Doppelklick das "Bauen Erwerb Batch"-Symbol, klicken Sie auf ' hinzufügen ', "Hinzufügen Proben", legen Sie die Anzahl der neuen Proben, und klicken Sie auf "OK".</li>
			<li>Klicken Sie auf "Methode Editor" und wählen Sie die Methode verwendet werden. Wenn mehrere Methoden in einer Batch-Datei verwendet werden, aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Verwendung mehrerer Methoden" und wählen Sie die Erwerbsmethode für jede Probe. Benennen Sie "Probe", legen Sie die entsprechende Anzahl für "Fläschchen Position", und geben Sie die Menge der Einspritzmenge. Speichern Sie die Batch-Datei.</li>
		</ol>
</li>
		<li>MS3 Produkt Ion Spektren der SM-Arten von Interesse durch LC-ESI-MS3 -Analyse zu erhalten<ol>
<li>Wählen Sie die Registerkarte 'Senden' in Batch-Datei, markieren Sie die Zeile der zu analysierenden Proben, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Senden".</li>
			<li>Klicken Sie auf die '' Ansicht Quene "Symbol"Äquilibriert"-Symbol, wählen Sie die Erwerbsmethode verwendet werden, die Uhrzeit als 1 min und klicken Sie auf"OK".</li>
			<li>Deaktivieren Sie "Reserve Instrument für Tuning" durch Anklicken des entsprechenden Symbols. Führen Sie dann Stapelsequenz durch Anklicken des Symbols "Sample starten".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Weisen Sie jeder MS3 Produkt Ion Spektren des SM durch den Vergleich der Masse Verhältnis (m/Z) des Produktes berechnen Ionen-Spektren und die genaue Masse der Sphingoid LCB und N-Acyl Glyko-von Interesse. Ermitteln die Anzahl von Kohlenstoffatomen und doppelte Anleihen in der Sphingoid LCB und N-Acyl Glyko-gemäß der entsprechenden Produkt-Ionen.<ol>
<li>Bestätigen Sie, dass der entsprechende Sub-Projekt-Ordner ausgewählt ist, dann doppelklicken Sie das Symbol "Open Data File", und wählen Sie die Proben analysiert werden. Ziehen Sie die Peak im Chromatogramm für jedes Ziel SM Arten und klicken Sie dann doppelt. Die erhaltenen MS3 Produkt Ion Spektren im Bereich gezogen werden vorgestellt.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Quantitative Analyse des SM durch LC-ESI-MS/MS<ol>
<li>Legen Sie die mobilen Phasen und HPLC-Säule, wie unter Punkt 2.1 und 2.2.1 beschrieben.</li>
		<li>Legen Sie die Parameter der triple Quadrupol und Quadrupol lineare Ionenfalle Massenspektrometrie System für mehrere Reaktion monitoring (MRM) Analyse, wie in Tabelle 1 und Tabelle 2aufgeführt.<ol>
<li>Führen Sie die Verfahren, wie in Schritt 2.2.2.1 und 2.2.2.2 beschrieben.</li>
			<li>Klicken Sie auf die Registerkarte "Datei", wählen Sie "Neu" und "Übernahme-Methode" und "OK". Klicken Sie auf das Symbol 'Mass Spec' und 'MS' tab. Wählen Sie Scan-Typ als "MRM" Polarität "Positiv". Legen Sie "Dauer", als die ganze Zeit analysiert werden. Legen Sie den m/Z [M + H]+ und 184 als "Q1 (Da)' und 'Q3 Masse (Da)" des Ziels SM Arten von Interesse, jeweils. Festlegen Sie 'Zeit' als 10 ms und "ID" als Namen für das Ziel SM Arten.</li>
			<li>Wählen Sie die Registerkarte "Advanced MS", und legen Sie jeden Parameter wie folgt: sowohl die Auflösung Q1 und Q3 als "Einheit", Intensität Schwelle als 0, Zeiteinstellung 0 (ms) und Pause zwischen Masse reicht als 5 ms.</li>
			<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche "Parameter bearbeiten" im Reiter "MS" und wählen Sie die "Quelle/Gas" Registerkarte legen Sie die Parameter der Vorhang Gas und Kollision Gas, Ionspray Spannung, Temperatur, Ionen-Quelle gas1 gas2 wie in Tabelle 1aufgeführt. Wählen Sie dann die "Compound" Registerkarte "setzen Sie die Parameter des declustering Potenzial, Eingang Potenzial, Aufprallenergie und Kollision Zelle Ausfahrt Potenzial wie in Tabelle 2aufgeführt.</li>
			<li>Stellen Sie das Ventil, wie in Schritt 2.2.2.6 beschrieben.</li>
			<li>Legen Sie die LC-Bedingung, wie in Schritt 2.2.2.7 beschrieben. Speichern Sie anschließend die Methode.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Die Batch-Datei zu erstellen, wie unter Punkt 2.2.3 beschrieben.</li>
		<li>Erhalten Sie die MRM-Daten der einzelnen SM-Arten durch LC-ESI-MS/MS-Analyse, wie unter Punkt 2.2.4 beschrieben.</li>
		<li>Mit der Software für Datenintegration MRM Daten verarbeiten und die Daten der Peakfläche für die extrahierten Ion Chromatogramm der einzelnen SM-Arten zu erhalten.<ol>
<li>Doppelklick auf das Icon für die Datenintegration in der quantitativen Analyse, klicken Sie auf die Registerkarte "Bearbeiten" und wählen Sie Benutzer standardmäßig Integration. Festlegen Sie "glockenförmig" glatte Breite als 1,0 Punkte, und klicken Sie auf "OK". Klicken Sie auf die Registerkarte "Bearbeiten" und wählen Sie "Neue Tabelle". Wählen Sie das Beispiel integriert werden, klicken Sie auf einen Pfeil, und klicken Sie auf "Weiter". Wählen Sie "Erstellen neue Methode", legen Sie den Namen der Methode, und klicken Sie auf "Weiter". Klicken Sie auf "Weiter" und aktivieren Sie das Kontrollkästchen D18:1 /(D31)-16:0 SM ist, klicken Sie auf "Weiter", und klicken Sie auf "Fertig stellen".</li>
			<li>Klicken Sie auf "Zeigt den Gipfel-Beitrag" und bestätigen Sie, dass die Chromatogramm Gipfel entsprechend anerkannt werden. Ist anzumerken, dass die Verweilzeit des D18:1 /(D31)-16:0 SM ist in der Regel um kleiner ~ 0,3 min im Vergleich zu der eines der 34-1 SM (in der Regel besteht der D18:1 / 16:0 SM).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Jede SM-Art entsprechend dem Verhältnis der Spitze der einzelnen SM-Arten, die D18:1 /(D31)-16 zu quantifizieren: 0 SM interner Standard.<ol>
<li>Klicken Sie auf die Registerkarte "Datei", wählen Sie "Exportieren", wählen Sie "Tabelle", bestätigen Sie das Format als "MultiQuant", Spalten, wie "alle Spalten"Exportieren", Zeilen wie"Alle Zeilen außer diesen explizit versteckte "Exportieren", und klicken Sie dann auf "OK".</li>
			<li>Öffnen Sie die exportierte Datei in die Excel-Software. Das Gebiet des Ziels SM-Arten durch die Fläche des IS zu normalisieren (D18:1 /(D31)-16:0 SM). Multiplizieren Sie dann mit der theoretischen Menge des IS in der injizierten Probe zur Berechnung des Ziels SM-Arten in der injizierten Probe.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Erstellung der Standardkurve<ol>
<li>Die MRM Daten von D18:1 /(D9)-18:1 SM und D18:1 /(D31)-16:0 SM in den Proben für das Konstruieren der Standardkurve von LC-ESI-MS/MS-Analyse, wie in Schritt 2.3.1-2.3.4 beschrieben.</li>
		<li>Die Daten der Peakfläche des D18:1 /(D9)-18:1 SM und D18:1 /(D31)-16:0 SM wie in Schritt 2.3.5 beschrieben.</li>
		<li>Berechnen Sie die Menge der D18:1 /(D9)-18:1 SM in der injizierten Probe gemäß Schritt 2.3.6.</li>
		<li>Die Trendlinie zu konstruieren, durch Festlegen der X-Achse und die Y-Achse als der Nominalbetrag und berechnete Menge an D18:1 /(D9)-18:1 SM und erhalten die Trendlinie-Formel.</li>
	</ol></li>
	<li>Die quantitative Methode mit Excel Software Validierung<ol>
<li>Für die Validierung der Methode, die Menge der D18:1 /(D9)-18 zu quantifizieren: 1 SM und D18:1 /(D31)-16:0 SM in der QC Proben durch die Analyse jedes QC Probe mindestens dreimal in 1 Tag, und wiederholen Sie mindestens 3 Tage, wie in Schritt 2.3.1-2.3.4 beschrieben.</li>
		<li>Die Spitze Bereich Daten und berechnen Sie die Menge der D18:1 /(D9)-18:1 SM in der injizierten Probe gemäß Schritt 2.3.5 und 2.3.6.</li>
		<li>Nach der Eichkurve erhalten, berechnen die Höhe der D18:1 /(D9)-18:1 SM in der injizierten Probe.</li>
		<li>Bewertung der Genauigkeit<ol>
<li>Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung der Höhe der D18:1 /(D9)-18:1 SM erhaltenen in Schritt 2.5.3 auf das Dataset die Intra-day und Inter Tag mit Excel-Software.</li>
			<li>Der Durchschnitt in Schritt 2.5.4.1 erhaltenen ist geteilt durch die Standardabweichung und ausgedrückt als %.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bewertung der Genauigkeit<ol>
<li>Berechnen Sie die Richtigkeit der einzelnen Angaben wie folgt: [(Die berechneten Betrag im Schritt 2.5.3.) / (Nominalbetrag) - 1] × 100(%)</li>
			<li>Berechnen Sie den Mittelwert der Absolute Wert der Genauigkeit für das Dataset die Intra-und Inter Tag.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenskonflikt.

In dem vorliegenden qualitativen Verfahren, die wir erhalten, MS3 Produkt Ionen eine SPC und ein N-Acyl Glyko-. Es ist wichtig, richtig ordnen Sie eine SPC und ein N-Acyl Glyko-. Zu diesem Zweck sollte angemerkt werden, dass andere phosphorylcholin-haltige Moleküle auch als MS3 Produkt Ionen nachgewiesen werden können. Diacyl-Phosphatidylcholin (PC) und Plasmalogen-PC sind reichlich vorhanden in Säugetierzellen und ihre Hydrophobie ist ähnlich dem von SM. Daher können Diacyl-P...

Sphingomyelin (SM) ist eine gemeinsame Sphingolipid in Säugetierzellen. SM ist synthetisiert intrazellulär1 und Gegenwart als Vorstufe für andere Sphingolipide wie ein Sphingosine-1-Phosphat und ein Ceramid, die entscheidende Rolle im Immunsystem haben-Handel Handy und Barriere Homöostase, bzw.2Haut, 3. Daher ist die genaue Analyse des Stoffwechsels SM wichtig für die Aufklärung der physiologischen und pathologischen Rollen der Sphingolipide.
SM besteht aus einem Ceramid und ein phosphorylcholin, die mit 1-hydroxy-Gruppe von der Ceramid weiter ein Sphingosine und ein Nbesteht-Acyl Glyko-. Eine Vielzahl der Kohlenstoff- und Doppelbindung in der Sphingosine und NZahlen-Acyl Glyko-ergibt sich die Anzahl der Ceramid (und SM) Arten. Jüngste Fortschritte in der LC-ESI-MS/MS ermöglichte die quantitative und qualitative Analyse der SM4,5. In der qualitativen Analyse wurde die Anzahl der Kohlenstoff und Doppelbindungen der ein Sphingoid LCB SM identifiziert, durch die Zuordnung von Produkt Ion Spektren des LCB. Jedoch Strukturinformation der N-Acyl Glyko-wurde nicht direkt erhalten, weil die entsprechenden Produkt-Ionen nicht gemeldet worden sind, und daher N-Acyl-Moieties wurden durch differenzierte Analyse zwischen Vorläufer Ionen abgeleitet und Produkt-Ionen entsprechend LCB in sowohl positive als auch negative Ionen-Modi4,5. In diesem Bericht präsentieren wir eine Methode zur Erkennung der Produkt-Ionen des LCB und N-Acyl Glyko-gleichzeitig in MS3 -Modus mit triple Quadrupol und Quadrupol lineare Ionenfalle Massenspektrometrie, die die genaue Struktur erleichtert Spekulationen über jedes SM-Arten-6.
Die Ionen-Unterdrückung (oder Erweiterung) Auswirkungen verursacht durch die Matrix in biologischen Proben behindern die genaue Quantifizierung in LC-ESI-MS-Analyse, und daher ist es wünschenswert, Kalibrierkurven für alle Analyten von Interesse in der identischen Matrix erstellen von der biologischen Probe. Diese Strategie ist jedoch nicht zumutbar, weil es fast unmöglich, alle Arten von SM in biologischen Proben, vor allem in der umfassenden Analyse vorzubereiten. So ist es praktisch, eine Kalibrierungskurve zu konstruieren und den quantitativen Bereich mit einer repräsentativen SM Art versetzt in den biologischen Proben zu bestimmen. Wir verwendet zwei isotopischer beschriftet SM-Arten, um eine Kalibrierungskurve zu konstruieren; einer war für einen internen Standard und die andere für eine Standard-Verbindung verwendet. Wir haben eine kleine Menge SM-Art isotopischer beschriftet als standard Verbindung versetzt in biologischen Proben und erfolgreich eine Kalibrationskurve und quantitativen Bereich6festgestellt.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100 mm tissue culture dish</td><td>IWAKI</td><td>3020-100</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>IWAKI</td><td>9000-220</td><td></td></tr><tr><td>Siliconized 2.0 mL tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>Test tube</td><td>IWAKI</td><td>TST SCR 16-100</td><td></td></tr><tr><td>Teflon-lined screw cap</td><td>IWAKI</td><td>9998CAP415-15</td><td></td></tr><tr><td>Disposable glass tube</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>CAPCELL PAK C18 ACR 3 &amp;micro;m 1.5 mm I.D. x 100 mm</td><td>Shiseido</td><td>92223</td><td>Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column</td></tr><tr><td>CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE</td><td>Shiseido</td><td>12197</td><td></td></tr><tr><td>Cartridge holder</td><td>Shiseido</td><td>12415</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Wako</td><td>018-19853</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropyl Alcohol)</td><td>Wako</td><td>161-09163</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Wako</td><td>134-14523</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Wako</td><td>066-00466</td><td></td></tr><tr><td>28% Ammonia water</td><td>Wako</td><td>016-03146</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (bath type)</td><td>SHARP</td><td>UT-206H</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer for glass test tube</td><td>TAITEC</td><td>Mix-EVR</td><td></td></tr><tr><td>1.4 mL glass vial</td><td>Tomsic</td><td>500-1982</td><td>Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>8 mm septum</td><td>Tomsic</td><td>200-3322</td><td>When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum</td></tr><tr><td>Screw cap for 1.4 mm glass vial</td><td>Tomsic</td><td>500-2762</td><td></td></tr><tr><td>Screw cap with slit septum</td><td>Shimadzu GLC</td><td>GLCTV-803</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 0.22 &amp;micro;m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry</td><td>SCIEX</td><td>QTRAP4500</td><td></td></tr><tr><td>The software for data acquisition and analysis of product ion spectra</td><td>SCIEX</td><td>Analyst</td><td></td></tr><tr><td>The software for data integration in quantitative analysis</td><td>SCIEX</td><td>MultiQuant</td><td></td></tr><tr><td>HPLC system</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottle</td><td>Sansyo</td><td>85-0002</td><td></td></tr><tr><td>d18:1/24:0 sphingomyelin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860592P</td><td></td></tr><tr><td>Sphingosylphosphorylcholine</td><td>Merck</td><td>567735</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Eagle&amp;rsquo;s minimum essential medium</td><td>Sigma</td><td>M4655</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative and qualitative method for sphingomyelin by lc-ms using two stable isotopically labeled sphingomyelin species

Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse von Sphingomyelin (SM) qualitativ und quantitativ durch flüssige Chromatographie-Electrospray Ionisierung-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS). SM ist eine gemeinsame Sphingolipid bestehend aus einem phosphorylcholin und ein Ceramid als hydrophile und hydrophobe Komponente, beziehungsweise. Eine Reihe von SM-Arten sind in Säugerzellen aufgrund einer Vielzahl in der Sphingoid lange Kette base (LCB) und eine N-Acyl Glyko-in die Ceramid. In diesem Bericht zeigen wir eine Methode zur Schätzung der Zahl der Kohlenstoff und Doppelbindungen in einem LCB und eine N-Acyl Glyko-basierend auf ihren entsprechenden Produkt-Ionen in MS/MS/MS (MS3) Experimente. Darüber hinaus präsentieren wir eine Quantitative Analyse-Methode für SM mit zwei stabilen isotopisch beschriftete SM Arten, die erleichtert die Bestimmung der Reichweite in SM Quantifizierung verwendet. Das vorliegende Verfahren werden bei der Charakterisierung der SM Artenvielfalt in biologischen Proben und industrielle Produkte wie Kosmetika.

Chemisch synthetisiert D18:1 / 24:0 cm (Abbildung 1A) und D18:1 / 24:0 SM in Lipid-Proben von HeLa-Zellen (Abbildung 1B) extrahiert wurden durch LC-ESI-MS3 [M + HCOO]– und [M-CH3] analysiert- als ersten und zweiten Vorläufer Ionen, beziehungsweise. Beachten Sie, dass die Spektrum Intensität der demethylated-Sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/Z...

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Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Quantitative und Qualitative Methode für Sphingomyelin von LC-MS mit zwei stabilen isotopischer beschriftet Sphingomyelin Arten

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu quantifizieren und zu einzelnen Sphingomyelin Arten mit mehreren Reaktionskontrolle zu qualifizieren und MS/MS/MS-Modus, beziehungsweise.

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.7K Aufrufe.  Teikyo University. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu quantifizieren und zu einzelnen Sphingomyelin Arten mit mehreren Reaktionskontrolle zu qualifizieren und MS/MS/MS-Modus, beziehungsweise.

Serie: Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Cellular Lipidextraktion für Targeted Stable Isotope Dilution Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Forschung

Biotechnik

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of virion morphogenesis. Quantitative lipid droplet proteome analysis can be used to identify proteins that localize to or are displaced from lipid droplets under conditions such as virus infections. Here, we describe a protocol that has been successfully used to characterize the changes in the lipid droplet proteome following infection with HCV. We use Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC) and thus label the complete proteome of one population of cells with &#34;heavy&#34; amino acids to quantitate the proteins by mass spectrometry. For lipid droplet isolation, the two cell populations (i.e.&#160;HCV-infected/&#34;light&#34; amino acids and uninfected control/&#34;heavy&#34; amino acids) are mixed 1:1 and lysed mechanically in hypotonic buffer. After removing the nuclei and cell debris by low speed centrifugation, lipid droplet-associated proteins are enriched by two subsequent ultracentrifugation steps followed by three washing steps in isotonic buffer. The purity of the lipid droplet fractions is analyzed by western blotting with antibodies recognizing different subcellular compartments. Lipid droplet-associated proteins are then separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Coomassie staining. After tryptic digest, the peptides are quantified by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Using this method, we identified proteins recruited to lipid droplets upon HCV infection that might represent pro- or antiviral host factors. Our method can be applied to a variety of different cells and culture conditions, such as infection with pathogens, environmental stress, or drug treatment.

Lipid droplets are important organelles for the replication of several pathogens, including the Hepatitis C Virus (HCV). We describe a method to isolate lipid droplets for quantitative mass spectrometry of associated proteins; it can be used under a variety of conditions, such as virus infection, environmental stress, or drug treatment.

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Biochemie

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Here we show isolated human platelets can be used as an accessible ex vivo model to study metabolic adaptations in response to the complex I inhibitor rotenone. This approach employs isotopic tracing and relative quantification by liquid chromatography-mass spectrometry and can be applied to a variety of study designs.

LC-MS-Analyse von menschlichen Blutplättchen als Plattform für ein Studium Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Umwelt

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Chemie

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

Massenspektrometrische Analyse Glycosphingolipid Antigene

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Immunologie und Infektion

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of biological membranes, energy storage and production, cellular signaling, vesicular transport of proteins, organelle biogenesis, and regulated cell death. Because the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a unicellular eukaryote amenable to thorough molecular analyses, its use as a model organism helped uncover mechanisms linking lipid metabolism and intracellular transport to complex biological processes within eukaryotic cells. The availability of a versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of major classes of lipids within a yeast cell is crucial for getting deep insights into these mechanisms. Here we present a protocol to use liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of major cellular lipids of S. cerevisiae. The LC-MS/MS method described is versatile and robust. It enables the identification and quantification of numerous species (including different isobaric or isomeric forms) within each of the 10 lipid classes. This method is sensitive and allows identification and quantitation of some lipid species at concentrations as low as 0.2 pmol/&#181;L. The method has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. The use of alternative mobile phase additives for electrospray ionization mass spectrometry in this method can increase the efficiency of ionization for some lipid species and can be therefore used to improve their identification and quantitation.

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry to identify and quantify major cellular lipids in Saccharomyces cerevisiae. The described method for a quantitative assessment of major lipid classes within a yeast cell is versatile, robust, and sensitive.

Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether sphingolipids are altered in a disease and investigate whether sphingolipids can be targeted clinically. However, properly powered prospective studies that acquire tissues directly from the surgical suite can be time consuming, and technically, logistically, and administratively challenging. In contrast, retrospective studies can take advantage of cryopreserved human specimens already available, usually in large numbers, at tissue biorepositories. Other advantages of procuring tissues from biorepositories include access to information associated with the tissue specimens including histology, pathology, and in some instances clinicopathological variables, all of which can be used to examine correlations with lipidomics data. However, technical limitations related to the incompatibility of optimal cutting temperature compound (OCT) used in the cryopreservation and mass spectrometry is a technical barrier for the analysis of lipids. However, we have previously shown that OCT can be easily removed from human biorepository specimens through cycles of washes and centrifugation without altering their sphingolipid content. We have also previously established that sphingolipids in human tissues cryopreserved in OCT are stable for up to 16 years. In this report, we outline the steps and workflow to analyze sphingolipids in human tissue specimens that are embedded in OCT, including washing tissues, weighing tissues for data normalization, the extraction of lipids, preparation of samples for analysis by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS), mass spectrometry data integration, data normalization, and data analysis.

Sphingolipids are bioactive metabolites with well-established roles in human disease. Characterizing alterations in tissues with mass-spectrometry can reveal roles in disease etiology or identify therapeutic targets. However, the OCT-compound used for cryopreservation in biorepositories interferes with mass-spectrometry. We outline methods to analyze sphingolipids in human tissues embedded in OCT with LC-ESI-MS/MS.

Vorbereitung von menschlichem Gewebe, eingebettet in die optimale Schnitttemperaturmischung für die massenspektrometrische Analyse

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

Krebsforschung

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

Eine quantitative Bewertung der Hefe Lipidome mit Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Biologie

Screening von Lipidstrukturen mittels stabiler Isotopenmarkierung

Tracing de novo Lipids using Stable Isotope Labeling LC-TIMS-TOF MS/MS

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable isotope labeling (SIL) offers several advantages for the study of lipid distribution, mobilization, and metabolism, as well as de novo lipid synthesis. The successful implementation of the SIL technique requires the removal of interferences from endogenous molecules. In the present work, we describe a high-throughput analytical protocol for the screening of SIL lipids from biological samples; examples will be shown of lipid de novo identification during mosquito ovary development. The use of complementary liquid chromatography trapped ion mobility spectrometry and mass spectrometry allows for the separation and lipids assignment from a single sample in a single scan (&lt;1 h). The described approach takes advantage of recent developments in data-dependent acquisition and data-independent acquisition, using parallel accumulation in the mobility trap followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. The measurement of SIL at the fatty acid chain level reveals changes in lipid dynamics during the ovary development of mosquitoes. The lipids de novo structures are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.

Autor im Rampenlicht: Quantifizierung komplexer lipidomischer Proben mittels stabiler Isotopenmarkierung

Presented here is a method for screening lipid structures through stable isotope labeling by using their retention time, mobility, and fragmentation.

De-novo-Verfolgung von Lipiden mittels stabiler Isotopenmarkierung LC-TIMS-TOF MS/MS

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable ...

Quantitative und Qualitative Methode für Sphingomyelin von LC-MS mit zwei stabilen isotopischer beschriftet Sphingomyelin Arten

Zusammenfassung

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