Name: rapid nanoprobe signal enhancement by in situ gold nanoparticle synthesis
Uploaded: 2018-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis at JoVE.com

Finanzierung durch den Europäischen Forschungsrat unter dem siebten Rahmenprogramm der Europäischen Union (FP/2007-2013) / ERC-Grant Agreement Nr. 615458, der schwedischen Forschungsrat und Pronova Excellence center für Proteintechnologie (VINNOVA - Schwedisch Staatliche Agentur für Innovationssysteme) ist dankbar anerkannt.

Humanem Serumproben wurden in Übereinstimmung mit den rechtlichen und ethischen Anforderungen des Landes, Sammlung, dherhalten. mit der Zustimmung einer Ethikkommission (oder ähnlich) und mit schriftlicher Einwilligung des Spenders.
1. Verbesserung Vorbereitung der Lösung:
<ol><li>Bereiten Sie einen 10 mM MES pH 6 Puffer die Aussetzung von MES Natriumsalz in entionisiertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 6 mit einem 4 M NaOH-Lösung.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 5 mM HAuCl4 Lösung in 10 mM MES pH 6 Puffer (Lösung 1).</li>
	<li>Bereiten Sie eine 1,027 M H2O2 Lösung in 10 mM MES pH 6 Puffer (Lösung 2). Hinweis: Die Volumen der Lösung 1 und Lösung 2 richtet sich nach der Anzahl und Größe der Microarrays verbessert werden. Beispielsweise erfordert ein Microarray von 10 x 10 mm 100 μl Gesamtvolumen (Lösung 1 + 2-Lösung) um sicherzustellen, dass die Microarray befindet sich in Kontakt mit der Verbesserung Lösung. Nach Verdünnung sollte H2O2 innerhalb von ca. 30-45 Tagen verwendet werden.</li>
</ol>(2) Nanopartikel Zubereitung:
<ol><li>Bereiten Sie 40 nm AuNPs wie von Bastús Et al.beschrieben. Spritzen Sie 16 kurz, 1 mL wässerige 25 mM HAuCl4 Vorläufer in einer kochenden Lösung von 2,2 mM Natriumcitrat (149 mL). Warten Sie, bis eine Rotwein Farbe beobachtet wird. Verwenden Sie diese Lösung von Nanopartikeln als Samen für Samen Wachstumsschritte.</li>
	<li>Spritzen Sie bei 90 ° C 1 mL 60 mM Natriumcitrat gefolgt von 1 mL 25 mM HAuCl4 in den Samen, die Lösung enthalten. Nach 30 min ist die Reaktion abgeschlossen. Wiederholen Sie den Samen-Wachstum Schritt fünf Mal bis 40 nm Nanopartikel erhalten werden, wie von Bastús Et al.beschrieben. 16
</li>
	<li>Messen Sie die Absorption von UV-Vis der endgültigen Lösung der Nanopartikel zur Bestimmung der Größe der Nanopartikel. 17 Alternativ Transmission Electron Mikrographen (TEM) erworben und verwendet werden können zur Bestimmung der Größe der Nanopartikel.</li>
	<li>Bereiten Sie 90 nm AgNPs wie von Rivero Et al.beschrieben. 18 kurz, Dimethylaminoborane (DMAB) einer kräftig gerührt Projektmappe hinzufügen von Poly (Acrylsäure, Natriumsalz) (PAA) und AgNO3. Der letzte Band der Lösung ist, 50 mL und die Endkonzentration von DMAB, PAA und AgNO3 sind 1,6 mM, 10 mM und 3,33 mM bzw.. Hinweis: 100 nm IONPs modifiziert mit Carboxylgruppen und 50 nm SiNPs mit Carboxylgruppen modifiziert wurden gekauft.</li>
	<li>Funktionalisieren Sie die AuNPs mit Antikörpern nach dem Protokoll von Puertas Et al.beschrieben. 19 kurz, 1 mg COOH-PEG-SH (5000 G·mol−1) einer Projektmappe hinzufügen der 1.2x10-9 M AuNPs (10 optische Dichte, OD). Stellen Sie den pH-Wert auf 12 mit einer Lösung von 4 M NaOH.<ol>
<li>Lassen Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur (~ 22 ° C), brüten unter milden Bedingungen rühren.</li>
		<li>Entfernen Sie das überschüssige PEG durch die Lösung bei 13800 X g für 15 min zentrifugieren.</li>
		<li>Das Pellet mit 500 μL deionisiertes Wasser Aufschwemmen.</li>
		<li>Inkubieren der PEG-modifizierte AuNPs mit 5 μmol N-(3-Dimethylaminopropyl)-n '-Ethylcarbodiimide-Hydrochlorid (EDC) und 7,5 μmol von N-Hydroxysulfosuccinimide-Natriumsalz (Sulfo-NHS) in 10 mM MES pH 6 Puffer für 30 min bei 37 ° C.</li>
		<li>Entfernen Sie das überschüssige EDC und Sulfo-NHS durch die Lösung bei 13800 X g für 5 min zentrifugieren.</li>
		<li>Das Pellet in 500 µL 10 mM MES pH 6 Puffer Aufschwemmen und 100 G·mL-1 des Antikörpers hinzufügen. Lassen Sie die Lösung für 2 h bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Entfernen Sie das überschüssige Antikörper durch zweimal die Lösung bei 13800 X g für 10 min Zentrifugieren und aufzuwirbeln Sie das Pellet in 500 μl 10 mM Natriumphosphat pH 7.5, 0,3 M NaCl Puffer. Lassen Sie die Lösung für 30 min bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Entfernen des unspezifischen gebundenen Antikörpers durch Zentrifugieren die Lösung bei 13800 X g für 10 min. zweimal und das Pellet in 500 μl 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in 10 mM MES pH 6 Puffer aufzuwirbeln. Über Nacht inkubieren Sie die Proben bei 4 ° C.</li>
		<li>Waschen Sie den Überschuss der BSA zweimal die Lösung bei 13800 X g für 10 min Zentrifugieren und das Pellet in 500 μl 10 mM MES pH 6 Puffer resuspending.</li>
		<li>Folgen Sie den Schritten 2.5.1 durch 2.5.9 für die Modifikation von 5 M AgNPs, 0,5 mg IONPS und 0,5 mg SiNPs mit Antikörper, die Mengen an EDC und Sulfo-NHS entsprechend anpassen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. vertikale Strömung papierbasierte Tests:
<ol><li>Bereiten Sie die Microarrays durch die Hinterlegung einer Gradienten Konzentration des Proteins G auf Nitrozellulose-Papier-Membran mit einem Roboter-Drucker. Lassen Sie nach dem Drucken der Microarrays über Nacht trocknen bei Raumtemperatur (~ 22 ° C).</li>
	<li>Führen Sie die vertikale Strömung Assay mit der Membran eingeschlossen in einen Filterhalter. Fließen Sie eine 8 M Lösung von IgG-modifizierte AuNPs mit einer Ultra-Spritze-Pumpe mit einer Rate von 1 mL·min−1. Wiederholen Sie diesen Schritt mit einer Lösung aus 17 M IgG-modifizierte AgNPs, 0,1 Mg·mL−1 IgG-modifizierte SiNPs und 0,1 Mg·mL−1 IgG-modifizierte IONPs.</li>
	<li>Lassen Sie die Microarrays für 30 min bei Raumtemperatur (~ 22 ° C) trocknen und in einen Flachbett-Scanner mit 4800 dpi Auflösung scannen. Speichern Sie die Bilder als 24-Bit-Farbe-TIFF-Dateien.</li>
</ol>4. verweisen Sie kommerzielle Glas basierende Assays:
<ol><li>Inkubieren Sie zwei Glas-Objektträger für 120 min. für die Erkennung von Allergenkomponenten mit 4 verschiedenen menschlichen Serumproben bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Spülen Sie die Microarrays mit entionisiertem Wasser.</li>
	<li>Inkubation eine Folie mit einer fluoreszierenden konjugiert Anti-Human-IgE-Antikörper bei Raumtemperatur (~ 22 ° C) für 30 min Inkubation der zweiten Folie mit Anti-Human-IgE Antikörper veränderte AuNPs für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Spülen Sie die Microarrays mit entionisiertem Wasser.</li>
	<li>Messen der Fluoreszenzintensität von Microarray, die mit einem Laser-scanning-Apparat mit dem fluoreszierenden Anti-Human-IgE-Antikörper inkubiert wurde. Digitalisieren Sie die Microarray, die mit der Anti-Human IgE Antikörper-modifizierte AuNPs mit einem Table-Top-Scanner für farbmetrische Signalerfassung inkubiert wurde.</li>
	<li>Inkubieren Sie nach der Digitalisierung Microarray mit Verbesserung Lösung bei Raumtemperatur (~ 22° C) für 5 Minuten.</li>
	<li>Den Sensor mit entionisiertem Wasser spülen und für 10 min bei Raumtemperatur (~ 22 ° C) trocknen lassen.</li>
	<li>Die Microarray mit einer Tischplatte Scanner mit 4800 dpi Auflösung für farbmetrische Signalerfassung zu digitalisieren. Speichern Sie die Bilder als 16-Bit-Graustufen TIFF-Dateien.</li>
</ol>(5) Microarray Inkubation mit Verbesserung Lösung:
<ol><li>Mischen Sie die gleiche Menge an Lösung 1 und Lösung 2 oder mischen sie direkt auf der Oberfläche des Sensors, und sicherzustellen Sie, dass die Fläche des Interesses auf dem Microarray mit der Mischung der Lösung bedeckt ist.</li>
	<li>Lassen Sie den Sensor Inkubation bei Raumtemperatur mit der Erweiterung-Lösung für bis zu 5 min. länger Inkubation Zeit verbesserte Empfindlichkeiten sowie höhere Rausch-/Signalverhältnis, vor allem für papierbasierte Microarrays Ausbeute kann.</li>
	<li>Waschen Sie die Microarray durch Eintauchen in entionisiertem Wasser einmal für 5 s. bei Raumtemperatur trocknen lassen. Hinweis: Die Zeit der Trocknung hängt das Material der Microarray. Für eine Papier-basierte Microarray erfordert den Trocknungsschritt ca. 30 min. Für ein Glas-basierte Microarray erfordert dem Trocknungsschritt ca. 5-10min.</li>
</ol>6. Bildgebung Analyse:
<ol><li>Die Fluoreszenz-Intensitäten mit Software-Tool zu analysieren. Betrachten Sie alle Ergebnisse, die gleich oder größer als 0,3 Isac standardisieren Einheiten (ISU), folgen Sie den Hinweisen der Nutzung (DfU) der Sensorhersteller sind.</li>
	<li>Analysieren Sie die farbmetrischen Intensitäten mit einem Softwaretool. Invertieren Sie die Bilddateien, Messen Sie die Intensität von jedem Fleck und berechnen Sie die mittlere Pixel-Intensität. Verwenden Sie die Werte der dreifacher Spots um den Schlusssignal Wert als Mittelwert der drei mittleren Ort Pixelintensität zu berechnen.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Derzeit Signal Verbesserung Techniken für Assays mit Nanoprobe-basierte Erkennung sind entweder Enzymbasis12, erfordern eine zweite Reihe von Nanopartikeln auf die Erkennung Nanosonden21 oder, im Falle der Färbetechniken, sind beschränkt auf die Verwendung von AuNPs oder AgNPs als Erkennung Sonden. 22 , wird hier eine einfache, schnelle und Enzym-freie Methode für Signal-Verbesserung der Nanoprobe Erkennung basierende Assays bezeichnet. Mit dieser Methode war es möglich, das farbmetrische Signal von 4 Arten von Nanosonden zu erweitern: AuNPs, AgNPs, IONPs und SiNPs.
Die beobachteten Verstärkungsfaktor für jeden Satz von Nanosonden war 100fach, mit Ausnahme der SiNPs wo Quantifizierung des Faktors Erweiterung nicht möglich, da Mangel an Pre-Erweiterung Signale war. Diese Verstärkung Faktor legt nahe, dass die Effizienz des Protokolls über alle Arten von Nanosonden ähnlich ist. Wenn die Erweiterung Protokoll auf einem Papierträger durchgeführt wurde wo eine Verdünnungsreihe einer Aktie AuNPs Suspension gedruckt wurde, wurde darüber hinaus ein 10000-fold Verstärkungsfaktor beobachtet. Vorherigen zur Verbesserung, die sichtbaren Flecken mit der niedrigsten Anzahl von AuNPs wurden, wo etwa 10000 Nanopartikel gedruckt wurden, wurde nach Verbesserung die Plätze beherbergen weniger als 10 Nanopartikel sichtbar. 20
Die Bedingungen für die Erweiterung Protokoll hier vorgestellt haben erlaubt, unter Ausnutzung der Verringerung der Au3 + Au0 für das Signal verbessern und gleichzeitig die Geräuschkulisse auf ein Minimum. Die Verstärkung kann durchgeführt werden, gleich nachdem der Test durchgeführt wird, sowie auf Microarrays, die für gespeichert wurden, bis zu mehrere Monate nach der Test durchgeführt wurde. Die Verbesserung Lösung besteht aus einer 1:1 Mischung der Lösung 1 und Lösung 2. Beide Lösungen können zuvor gemischt oder direkt gemischt, wenn auf die Microarray pipettiert werden. Der Unterschied zwischen Vormischen oder direkte Vermischung betrifft nur die Haltbarkeit der Verbesserung Lösung. Bei vorgemischten die Haltbarkeit von 5-7 Tagen Erhöhung auf 30-45 Tage, wenn nicht vorgemischt.
Weitere Analysen der Ergebnisse hat gezeigt, dass die Quantitative Analyse der Biosensor der Erweiterungsmethode nicht stört. Eine lineare Korrelation zwischen der Intensität beobachtet und die Konzentration des Analyten konnte gehalten werden (Tabelle 1). Die Daten für 4 Pre charakterisierten klinischen Proben mit der Glas-basiert Allergen Komponente Microarray Immunoassay mit standard Fluoreszenz-Detektion und farbmetrische Erkennung, zeigte eine gute Übereinstimmung zwischen zwei Nachweismethoden. Vergleich der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) und die mittlere farbmetrischen Intensität (MCI), eine durchschnittliche R2 = 0,79 + 0,08 / wurde erreicht, wenn die Daten auf beiden Achsen 10 angemeldet. Dieses Experiment hat gezeigt, dass der Erweiterungsmethode zu einem kommerziellen Kit angewendet werden kann, wenn es die Nanosonden zur Erkennung nutzt oder für Nanoprobe-basierte Erkennung angepasst werden kann.
Die Erweiterung Methode Wirksamkeit stützt sich auf zwei wichtige Aspekte. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Mischung der Lösung 1 und Lösung 2 ist homogen. Ohne eine homogene Mischung wird der Sensor, in Kontakt mit Bruchteilen von Verbesserung Lösung wo ist Lösung 1 oder 2 vorherrschende relativ zu den anderen. Das verringert die Leistung der Verringerung der Au3 + Au0, damit eine Beschädigung der Effizienz der Erweiterung. Es ist auch wichtig, das gesamte Gebiet des Interesses der Microarray in Kontakt mit der Verbesserung Lösung während der Inkubationszeit zu haben.
Um Gromer Verstärkung eines Signals zu erreichen, wird eine längere Inkubationszeit (ca. 5 min) mit der Verbesserung Lösung erforderlich sein. Um die Entwicklung von Hintergrundgeräuschen zu vermeiden, die die Signalerfassung stören können, sollte die Microarray Oberfläche zuvor blockierte (z.B. BSA, PEG), schnelle unspezifische Ablagerung von Au0 und daraus resultierende Bildung von Gold zu verhindern Schicht.
Eine Einschränkung der Erweiterungsmethode ist die innere Wirksamkeit des Assays. Der Test erfordert mit negativen und positiven Kontrollen sicherzustellen, dass die Signal-Verbesserung beobachtet wahr-Positive Ergebnisse zugeordnet werden kann. Wenn es eine unspezifische Interaktion von der Nanosonden mit dem Ziel, erworben Signale nach der Erweiterung nicht gültig werden.
Weitere Verbesserung Techniken sind basierend auf entweder Nanopartikel Aggregation oder Färbung der Nanopartikel mit einem Material, das verbesserte Signalerfassung ermöglicht. Durch die Förderung der Versammlung der Anzahl von Nanopartikeln bei der Erkennung, der Signalerfassung werden entweder visuell oder UV-Vis-Messungen. 5 diese Signal-Verbesserung-Techniken beruhen auf ein zweistufiges Detection System, der ersten Erkennung des Analyten von Interesse und in einem zweiten Schritt, wo die Reporter erforderlich ist, um an der ersten Erkennung Konstrukt zu binden. Solche Strategien fehlen Universalität aufgrund des spezifischen Erweiterung Protokoll Optimierung für jede Art von Test.
Die Färbung Verbesserung Techniken wie Silber-Färbung, viel wie das Protokoll hier dargestellt, ermöglichen die direkte Verbesserung des Signal-Erkennung-Konstrukte. Jedoch anders als das Protokoll, das hier gezeigt wird, silberne Färbung nur nachweislich auf AuNPs oder AgNPs angewendet werden. 6 , 7 , 8 , 9
Die Anwendbarkeit dieser Methode könnte wahrscheinlich jeder Assay erstrecken, die AuNPs, AgNPs, IONPs oder SiNPs als Erkennung Agenten verwendet. Weitere Arbeit wird durchgeführt, um die Anwendung der Methode in Sensoren bestehend aus anderen Materialien zu studieren.

Die Verwendung von Nanomaterialien wie gold-Nanopartikeln (AuNPs) oder Eisenoxid-Nanopartikeln (IONPs) hat die Anwendungen in Biosensoren mit verbesserte Empfindlichkeit und Vielseitigkeit erlaubt. 1 die Fülle der Methoden für die Dekoration der Oberfläche von Nanopartikeln mit verschiedenen Liganden, ihre hohe Fläche zum Volumenverhältnis, nutzen haben das Design der Sensoren mit verbesserter Empfindlichkeit ermöglicht. 2 doch ist ein Biosensoren Werkzeug hängt von der Anzahl der Nanosonden erforderlich um ein nachweisbares Signal zu erzielen. Z. B. bei 40 nm AuNPs ein Signal durch UV-Vis-Spektroskopie, ca. 90 × 106 Nanosonden zu erwerben ist erforderlich, um effektiv das Ziel von Interesse zu erkennen. 3 diese Nanoprobe Dichte Einschränkung kann durch den Einsatz von Signalverstärkung umgangen werden. Solche Strategien4 können anhand Oberflächenkräfte Aggregation oder Agglomeration, wo die Dichte der ersten Nanosonden erhöht wird, durch die Anhäufung einer zweiten Reihe von Nanosonden auf den ersten. 5 die Zahl der Nanopartikel an einer bestimmten Position auf einer Sensorfläche ermöglicht, Seh- oder UV-Vis-Signalerfassung. Die Empfindlichkeit des Tests wird jedoch von Natur aus mit targeting Kapazität des zweiten Satzes von Nanopartikeln in Richtung der Anfangssatz von Nanosonden verknüpft werden. Andere Strategien verlassen sich auf die Färbung der entweder gold und Silber Nanosonden. 6 , 7 die Färbung entsteht durch den Abbau von Silber-Ionen auf die Oberfläche der Nanopartikel, ermöglicht eine visuelle oder UV-Vis-Erkennung. 8 diese Methoden verbessern das Signal des bestehenden gold oder silberne Nanosonden von potenzierende Oberfläche Resonanz Plasmon-signal, nicht abhängig von sekundären targeting Ereignissen wie Oberflächenkräfte Agglomeration Methoden. Silberne Färbung Methoden sind jedoch nur mit Verwendung von gold oder Silber Nanosonden berichtet worden. 8 , 9
Im Jahr 2005 Zayats Et Al. 10 berichtet die Reduzierung der Au-Ionen auf die Oberfläche des gold Nanosonden um Oberflächen Plasmon Resonanzsignal zu erhöhen. In diesem Enzym-abhängige Arbeit wurde Wasserstoffperoxid durch Glukose-Oxidase-Katalyse und zusammen mit Cetyltrimethylammonium-Chlorid erlaubt die Reduzierung der Chlorogoldsäure generiert.
Vor kurzem Wang Et Al. eine Erweiterungsmethode wo eine Goldschicht entsteht berichtet auf der Oberfläche des bestehenden Nanosonden. 11 diese erweiterten Nanosonden angezeigt Peroxidase-ähnliche katalytische Aktivität gegen das Substrat 3′, 5, 5 '-Tetramethylbenzidine (TMB) ermöglicht die Visualisierung von eine leuchtend blaue Farbe mit bloßem Auge.
Stevens Et al. die Entwicklung eines plasmonische ELISA basierende Assays berichtet. 12 nach der Erkennung von einer Prostata-spezifischen Antigens (PSA) durch eine traditionelle ELISA-Strategie, wurde ein sekundärer Antikörper mit Katalase beschriftet mit dem Sensor nach dem der Sensor war eingebettet in eine Lösung mit Wasserstoffperoxid inkubiert und Chlorogoldsäure. Das Vorhandensein von der Katalase-modifizierte Sekundärantikörper (positives Ergebnis) würde die Förderung des Verbrauchs von Wasserstoffperoxid, Verlangsamung Chloroauric Säure Reduktion und nachgiebig quasi-sphärische Prozess AuNPs mit einer roten Farbe. Das Fehlen der Katalase-modifizierte Antikörper (negativ) erlaubt die Wasserstoffperoxid-Konzentration zu bleiben intakt, fördert damit die rasche Chloroauric Reduktion und nachgiebig AuNPs mit unklaren Morphologien verantwortlich für eine blau/lila Farbe . Die Konzentration von Wasserstoffperoxid, bestimmt durch die Aktivität der Katalase, wurde gezeigt, um die Konzentration des Analyten von Interesse korreliert werden. Die Notwendigkeit einer Katalase-modifizierte Sekundärantikörper und die Kontrolle über die Bedingungen der katalytischen Aktivität sind zwei Faktoren, die die Universalität dieser Methode zu behindern. Darüber hinaus kann die Bildung von Goldclustern, unabhängig von den bestehenden AuNPs Hintergrund Lärmprobleme Verstärkung Strategie vorstellen.
Die oben genannten Techniken, wie auch mehrere andere13,14,15, haben es möglich gemacht für Nanoprobe-basierte Biosensoren, Nachweisgrenzen auf Augenhöhe mit traditionellen Techniken zu erreichen.
Hier eine neuartige gold Erweiterungsmethode gezeigt hat, wo das Signal von einer vorhandenen Nanoprobe wird durch potenzierende oder Einführung ein Surface Plasmon-Resonanz-Signal verstärkt. Nach der Erkennung mit dem Einsatz von Gold, Silber, Silizium oder Eisenoxid-Nanopartikeln erfolgt, darf der Sensor mit einer Lösung aus einer Mischung von Wasserstoffperoxid und Chlorogoldsäure in 2-(N-Morpholino) inkubieren Ethanesulfonic Säure (MES) pH 6-Puffer. Die Konzentrationen der Komponenten in die Verbesserung Lösung wurden optimiert, um die Ablagerung von Au0 auf der Oberfläche des bestehenden Nanosonden begünstigen. Für alle untersuchten Nanoprobe Arten, dh. AuNPs, silberne-Nanopartikeln (AgNPs), Silica-Nanopartikel (SiNPs) und IONPs, die Bildung einer vagen Schicht ergab oder ergänzt die Streuung von Licht nachweisbar oder erhöhte sichtbares Zeichen geführt. Eine Erhöhung der Signal mit einem 100-fold Verstärkungsfaktor für Nanosonden in Papier und Glas-basierten Microarrays erreicht wurde und der Vorgang dauert weniger als 5 min, ein Signal zu erwerben. Die Signalerfassung getan werden könnte, mit bloßem Auge, UV-Vis Spektroskopie oder Low-End-Tools wie z. B. eine Digitalkamera oder einen Scanner Tischplatte imaging. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass diese Erweiterung Protokoll ohne weiteres in einem handelsüblichen Allergie-Diagnostik-Assay angewendet werden kann, ohne gezielte Optimierung.

<table><tbody><tr><td>Chloroauric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254169 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylaminoborane&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>476668 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Poly(acrylic acid, sodium salt)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>416037 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Silver nitrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>204390 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>100 nm magnetic nanoparticles</td><td>Ademtech</td><td>021111</td><td></td></tr><tr><td>50 nm silica nanoparticles</td><td>Corposcular</td><td>140510-10</td><td></td></tr><tr><td>COOH-PEG-SH&amp;nbsp;</td><td>RAPP Polymere</td><td>135000-4-32</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.06462&amp;nbsp;EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&amp;rsquo;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03449&amp;nbsp;SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56485&amp;nbsp;ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95313 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>IgG antibody</td><td>Abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483&amp;nbsp;ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&amp;nbsp;SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>422351S</td><td></td></tr><tr><td>Protein G</td><td>Thermo Scientific</td><td>21193</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose paper membrane</td><td>Whatman</td><td>10402096</td><td></td></tr><tr><td>Nanoplotter 2.1 robotic printer</td><td>GeSIM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter holder</td><td>Merck</td><td>XX3001200</td><td></td></tr><tr><td>PhD2000 Ultrasyring pump</td><td>Harvard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-human IgE antibody-modified AuNPs&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser scanning LuxScan 10/K</td><td>Capital Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro</td><td>Epson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112</td><td>Thermofisher</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapid nanoprobe signal enhancement by in situ gold nanoparticle synthesis

Die Verwendung von Nanosonden wie Gold, Silber, Silizium oder Eisenoxid Nanopartikeln als Nachweisreagenzen in bioanalytischen Assays können hohe Empfindlichkeit und bequeme farbmetrischen auslesen. Jedoch sind hohe Dichten von Nanopartikeln in der Regel für die Erkennung benötigt. Die verfügbaren Synthese-basierten Verbesserung Protokolle sind entweder beschränkt sich auf gold und Silber-Nanopartikel oder verlassen Sie sich auf präzise enzymatische Steuerung und Optimierung. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um das farbmetrische Auslesen von Gold, Silber, Kieselsäure und Eisenoxid Nanosonden zu verbessern. Es wurde beobachtet, dass die farbmetrische Signal von bis zu einem 10000-fold Faktor verbessert werden kann. Die Grundlage für solche Signal-Verbesserung-Strategien ist die chemische Reduktion von Au3 + Au0. Es gibt mehrere chemische Reaktionen, die es die Reduzierung der Au3 + Au0 ermöglichen. Im Protokoll gut Puffer und H2O2 dienen und es ist möglich, die Ablagerung von Au0 auf die Oberfläche des vorhandenen Nanosonden in Nachteil der Bildung von neuen gold-Nanopartikeln zu bevorzugen. Das Protokoll besteht aus der Inkubation der Microarray mit einer Lösung bestehend aus Chlorogoldsäure und H2O2 in 2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure pH 6 Puffer nach der Nanoprobe-basierte Erkennung-Assay. Die Verbesserung Lösung kann auf Papier und Glas-basierten Sensoren angewendet werden. Darüber hinaus kann in kommerziell erhältlichen Immunoassays verwendet werden, wie durch die Anwendung der Methode auf einen kommerziellen Allergen Microarray gezeigt. Die Signal-Entwicklung erfordert weniger als 5 min Inkubation mit Verbesserung Lösung und das Auslesen von bloßem Auge oder Low-End-Bild Erwerb Geräte wie eine Tischplatte Scanner oder eine Digitalkamera beurteilt werden kann.

Nachdem ein Test durchgeführt wird, mit Nanosonden stellvertretend Erkennung kann der Sensor-Erfassungsbereich mit Nanosonden (Abbildung 1(eine) aufgefüllt werden. Die Anzahl der Nanosonden unter dem Grenzwert für eine visuelle Erkennung ist, wird die Erkennung des Analyten zunächst negative berücksichtigt. Über das Protokoll hier vorgestellten (Abbildung 1b), ist das Signal von der Nanosonden potenzierte durch die Einführung einer vagen Schicht von Au (Abbildung 1c).
Ein Papier-basierten Immunoassay zur Detektion von Protein G erfolgte hinsichtlich die Wirksamkeit der Erweiterung Protokoll (Abbildung 2) zu präsentieren. AuNPs, AgNPs, SiNPs und IONPs wurden geändert mit IgG-Antikörper und verwendet und Erkennung Agenten. Papier-Microarrays waren bereit, einen Verlauf einer Reihe von G-Protein-Moleküle pro Spot haben.
Nachdem der Test durchgeführt wurde, es wurde beobachtet, dass IgG modifizierte AuNPs (IgG-AuNPs) konnten so niedrig wie 2 × 105 Moleküle pro Spot (Abbildung 2eine) erkennen, IgG modifizierte AgNPs (IgG-AgNPs) in der Lage waren zu erkennen, so niedrig wie 2 × 104 Moleküle pro Spot (Abbildung 2c), IgG geändert IONPs (IgG-IONPs) waren in der Lage zu erkennen, so niedrig wie 2 × 107 Moleküle pro (Abb. 2e Spot) und IgG geändert SiNPs (IgG-SiNPs) waren nicht in der Lage, ein optisches Signal ( Abbildung 2g).
Durch Inkubation der Microarrays mit Verbesserung Lösung, war es möglich, das Signal von 100fach erhöht für alle Arten von Nanopartikeln verwendet. Im Falle von SiNPs, Verbesserung Lösung machte es möglich, ein Signal zu beobachten, wo kein optisches Signal ohne Verbesserung Lösung beobachtet wurde (Abbildung 2b, 2d, 2f und 2 h).
Die Möglichkeit der Anwendung der Methode zu einem vorhandenen kommerziellen Immunoassay wurde bewertet. Die Verbesserung wurde auf ein Glas basiert Allergen Komponente Microarray Immunoassay durchgeführt. Ein Satz von 4 validiert und Serum Proben von allergischen Patienten mit der Microarray wurden gekennzeichnet (Proben wurden gekennzeichnet als a, b, c und d). Die standard fluorometrisch Erkennung des Assays wurde im Vergleich zu beflecken mit Anti-IgE beschriftet AuNPs gefolgt von der Verstärkung des Signals (Abbildung 3). Vor der Verbesserung waren keine Flecken auf der Microarrays erkannt wo die Erkennung mit Anti-IgE beschriftet AuNPs durchgeführt wurde. Nach Verbesserung mehrere Spots waren mit bloßem Auge sichtbar und ihre Intensität durch die Bild-Digitalisierung (Abbildung 3) registriert wurde. Mit der Fluoreszenz-Detektion, eine Vielzahl von Flecken waren erkannt (Abbildung 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig1.jpg"> Abbildung 1 . Abbildung der Schritte durchläuft ein Microspot von Analyten Erkennung auf verstärkte Signal. (ein) zwei Antikörper-modifizierten Nanosonden nach der Erkennung eines Analyten unbeweglich auf einem Microspot, (b) Inkubation von Microarray mit dem Enhancement-Protokoll und das anschließende Saatgut-Wachstum der Antikörper-modifizierten Nanosonden und () ( c) Microspot wo die Nanosonden vergrößert nach Inkubation 5 min mit der Erweiterung-Lösung. Diese Zahl wurde Dapted von Dias Et Al. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig2.jpg"> Abbildung 2 . Digitalisierte Bild von Microarrays zur Detektion von Protein G. Auf der linken Seite der einzelnen Microarray sind die beobachteten Microspots vor Verbesserung der Erkennung durchgeführt mit (einem) IgG-AuNPs, (c) IgG-AgNPs, (e) IgG-IONPs und (g) IgG-SiNPs. Auf der rechten Seite der einzelnen Microarray sind die Microspots nach Verbesserung der (b) IgG-AuNPs, (d) IgG-AgNPS, (f) IgG-IONPs und (h) IgG-SiNPs. Jede Konzentration des Proteins G wurde auf die Microarray in dreifacher Ausfertigung hinterlegt. Eine Berechnung der Anzahl an Protein, die G erfolgte anhand der Konzentration des Proteins in jeder Microspot gedruckt. Diese Zahl wurde angepasst von Dias Et Al. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig3.jpg"> Abbildung 3 . Korrelation zwischen Fluoreszenz Intensität und farbmetrischen Intensität erhalten für die Tests durchgeführt mit der kommerziellen Allergie diagnostischen Test. Meine Fluoreszenzintensität (MFI) und meine farbmetrischen Intensität (MCI) gemessen zum Nachweis von Allergenen in den Proben a, b, c und d. Einsätze sind die 10 umgestaltet Protokolldaten in den Pausen, in denen eine lineare Korrelation zwischen beiden Methoden beobachtet wurde. Die Intensität der Microspots beobachtet für den Nachweis anhand der Fluorophor-modifizierte Antikörper (Fluorophor-Ab) ist Fluoreszenzemission. Die Helligkeit der Microspots beobachtet für den Nachweis anhand der Ab-AuNPs-Assay wurde nach der Digitalisierung der Microarray und invertieren das Bild mit imaging-Software erhalten. Microarrays sind so ausgelegt, dass vertikale Triplicates mit Positivkontrollen für Fluoreszenz-Detektion auf der rechten Unterseite haben. Die anderen drei Ecken dienen zur Software-Evaluation. Bilder wurden in 16-Bit-Graustufen ausgewertet. Diese Zahl wurde angepasst von Dias Et Al. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>R2 vorherige Verbesserung</td>
			<td>R2 nach Verbesserung</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-AuNPs</td>
			<td>8.70E-01</td>
			<td>7.80E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-AgNPs</td>
			<td>9.10E-01</td>
			<td>9.60E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-IONPs</td>
			<td>9.17E-01</td>
			<td>9.30E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-SiNPs</td>
			<td>-</td>
			<td>8.50E-01</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. R2 Werte für die Erkennung von Protein G, vor und nach Verbesserung, mit unterschiedlichen Sätzen von Nanopartikeln. R2 Werte stammen nach korrelieren die Intensität der Flecken mit der Konzentration des Analyten gemessen.

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Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für Signal-Verbesserung der Nanoprobe-basierte Biosensoren vorgestellt. Das Protokoll basiert auf die Reduzierung der Chlorogoldsäure auf die Oberfläche des vorhandenen Nanosonden, die aus Gold, Silber, Silizium oder Eisenoxid Nanopartikeln bestehen.

Schnelle Nanoprobe Signal-Verbesserung durch In Situ -Gold-Nanopartikel-Synthese

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

rapid-nanoprobe-signal-enhancement-situ-gold-nanoparticle

Research

JoVE Journal

Chemistry

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

7.5K Aufrufe.  KTH Royal Institute of Technology. In dieser Arbeit wird ein Protokoll für Signal-Verbesserung der Nanoprobe-basierte Biosensoren vorgestellt. Das Protokoll basiert auf die Reduzierung der Chlorogoldsäure auf die Oberfläche des vorhandenen Nanosonden, die aus Gold, Silber, Silizium oder Eisenoxid Nanopartikeln bestehen.

Serie: Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, a large infrastructure of immunoassay instruments and materials can be found. For example, 96- and 384-well polystyrene plates are available commercially and have a standard design to accommodate ultraviolet-visible (UV-Vis) spectroscopy machines from various manufacturers. In addition, a wide variety of immunoglobulins, detection tags, and blocking agents for customized immunoassay designs such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) are available.
Despite the existing infrastructure, standard ELISA kits do not meet all research needs, requiring individualized immunoassay development, which can be expensive and time-consuming. For example, ELISA kits have low multiplexing (detection of more than one analyte at a time) capabilities as they usually depend on fluorescence or colorimetric methods for detection. Colorimetric and fluorescent-based analyses have limited multiplexing capabilities due to broad spectral peaks. In contrast, Raman spectroscopy-based methods have a much greater capability for multiplexing due to narrow emission peaks. Another advantage of Raman spectroscopy is that Raman reporters experience significantly less photobleaching than fluorescent tags1. Despite the advantages that Raman reporters have over fluorescent and colorimetric tags, protocols to fabricate Raman-based immunoassays are limited. The purpose of this paper is to provide a protocol to prepare functionalized probes to use in conjunction with polystyrene plates for direct detection of analytes by UV-Vis analysis and Raman spectroscopy. This protocol will allow researchers to take a do-it-yourself approach for future multi-analyte detection while capitalizing on pre-established infrastructure.

Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.

Herstellung eines UV-Vis und Raman-Spektroskopie Immunoassay-Plattform

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

Forschung

Biochemie

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Gold Nanostar Synthesis mit einem Silver Seed vermitteltes Wachstum Methode

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Biotechnik

A Simple Method for the Size Controlled Synthesis of Stable Oligomeric Clusters of Gold Nanoparticles under Ambient Conditions

Reducing dilute aqueous HAuCl4 with sodium thiocyanate (NaSCN) under alkaline conditions produces 2 to 3 nm diameter nanoparticles. Stable grape-like oligomeric clusters of these yellow nanoparticles of narrow size distribution are synthesized under ambient conditions via two methods. The delay-time method controls the number of subunits in the oligoclusters by varying the time between the addition of HAuCl4 to alkaline solution and the subsequent addition of reducing agent, NaSCN. The yellow oligoclusters produced range in size from ~3 to ~25 nm. This size range can be further extended by an add-on method utilizing hydroxylated gold chloride (Na+[Au(OH4-x)Clx]-) to auto-catalytically increase the number of subunits in the as-synthesized oligocluster nanoparticles, providing a total range of 3 nm to 70 nm. The crude oligocluster preparations display narrow size distributions and do not require further fractionation for most purposes. The oligoclusters formed can be concentrated &#62;300 fold without aggregation and the crude reaction mixtures remain stable for weeks without further processing. Because these oligomeric clusters can be concentrated before derivatization they allow expensive derivatizing agents to be used economically. In addition, we present two models by which predictions of particle size can be made with great accuracy.

We describe a simple method for producing highly stable oligomeric clusters of gold nanoparticles via the reduction of chloroauric acid (HAuCl4) with sodium thiocyanate (NaSCN). The oligoclusters have a narrow size distribution and can be produced with a wide range of sizes and surface coats.

Eine einfache Methode für die Größe kontrollierte Synthese von stabilen Oligomere Cluster von Goldclustern unter Umgebungsbedingungen

Reducing dilute aqueous HAuCl4 with sodium thiocyanate (NaSCN) under alkaline conditions produces 2 to 3 nm diameter nanoparticles. Stable grape-like ...

Chemie

Hydroquinone Based Synthesis of Gold Nanorods

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the synthetic methods for the preparation of gold nanorods are still not fully optimized. In this paper we describe a new, highly efficient, two-step protocol based on the use of hydroquinone as a mild reducing agent. Our approach allows the preparation of nanorods with a good control of size and aspect ratio (AR) simply by varying the amount of hexadecyl trimethylammonium bromide (CTAB) and silver ions (Ag+) present in the "growth solution". By using this method, it is possible to markedly reduce the amount of CTAB, an expensive and cytotoxic reagent, necessary to obtain the elongated shape. Gold nanorods with an aspect ratio of about 3 can be obtained in the presence of just 50 mM of CTAB (versus 100 mM used in the standard protocol based on the use of ascorbic acid), while shorter gold nanorods are obtained using a concentration as low as 10 mM.

This paper describes a protocol for the synthesis of gold nanorods, based on the use of hydroquinone as reducing agent, plus the different mechanisms for controlling their size and aspect ratio.

Hydrochinon-basierte Synthese von Gold-Nanostäbchen

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

Microfabrication von Nanoporöse Gold-Patterns für Zell-Material-Interaktion Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Naked-Eye Detection of Rare Point Mutations in DNA

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen application of the method is the identification of rare mutations in circulating cell-free DNA from liquid biopsies, with a relevance in cancer diagnostics and stratification of oncological patients for personalized therapy. As a proof of concept, the test has been designed to detect the BRAFV600E mutation in the BRAF gene, which is important to identify the sub-group of melanoma patients that can benefit from targeted therapies with BRAF inhibitors. However, this colorimetric test can be easily generalized to other somatic mutations of clinical relevance due to the use of universal detection probes, thus providing strong potential in oncological diagnostics.
The test detects 0.5% of BRAFV600E in an excess of BRAFWT DNA, which matches the sensitivity of some commercial instrumental assays. Such sensitivity is clinically relevant for diagnostic purposes, allowing the early identification of drug-sensitive patients. In contrast to commercial assays based on real-time PCR, this test requires minimal instrumentation and processing, as it can be performed on DNA amplified with a standard PCR (or isothermal techniques) and provides a naked-eye readout with a one-tube reaction of a few steps in only one hour. At present, the test has been used only on synthetic DNA samples. However, the latter have been designed to mimic a real sample amplified from circulating cell-free DNA, to favor the translation of the test to clinical diagnostics.

This protocol permits the naked-eye identification of point mutated DNA in a 200-fold excess of wild type DNA molecules, by exploiting gold nanoparticles and paramagnetic microparticles.

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen ...

Gold Nanoparticle Synthesis

Gold nanoparticles (Au nanoparticles) that are ~12 nm in diameter were synthesized by rapidly injecting a solution of 150 mg (0.15 mmol) of tetrachloroauric acid in 3.0 g (3.7 mmol, 3.6 mL) of oleylamine (technical grade) and 3.0 mL of toluene into a boiling solution of 5.1 g (6.4 mmol, 8.7 mL) of oleylamine in 147 mL of toluene. While boiling and mixing the reaction solution for 2 hours, the color of the reaction mixture changed from clear, to light yellow, to light pink, and then slowly to dark red. The heat was then turned off, and the solution was allowed to gradually cool down to room temperature for 1 hour. The gold nanoparticles were then collected and separated from the solution using a centrifuge and washed three times; by vortexing and dispersing the gold nanoparticles in 10 mL portions of toluene, and then precipitating the gold nanoparticles by adding 40 mL portions of methanol and spinning them in a centrifuge. The solution was then decanted to remove any remaining byproducts and unreacted starting materials. Drying the gold nanoparticles in a vacuum environment produced a solid black pellet; which could be stored for long periods of time (up to one year) for later use, and then redissolved in organic solvents such as toluene.

A protocol for synthesizing ~12 nm diameter gold nanoparticles (Au nanoparticles) in an organic solvent is presented. The gold nanoparticles are capped with oleylamine ligands to prevent agglomeration. The gold nanoparticles are soluble in organic solvents such as toluene.

Gold-Nanopartikel-Synthese

Gold nanoparticles (Au nanoparticles) that are ~12 nm in diameter were synthesized by rapidly injecting a solution of 150 mg (0.15 mmol) of ...

Einzelmolekül-SERS-Messungen durch Origami-Nanoantennen aus plasmonischer DNA

Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) has the capability to detect single molecules for which high field enhancement is required. Single-molecule (SM) SERS is able to provide molecule-specific spectroscopic information about individual molecules and therefore yields more detailed chemical information than other SM detection techniques. At the same time, there is the potential to unravel information from SM measurements that remain hidden in Raman measurements of bulk material. This protocol outlines the SM SERS measurements using a DNA origami nanoantenna (DONA) in combination with atomic force microscopy (AFM) and Raman spectroscopy. A DNA origami fork structure and two gold nanoparticles are combined to form the DONAs, with a 1.2-2.0 nm gap between them. This allows an up to 1011-fold SERS signal enhancement, enabling measurements of single molecules. The protocol further demonstrates the placement of a single analyte molecule in a SERS hot spot, the process of AFM imaging, and the subsequent overlaying of Raman imaging to measure an analyte in a single DONA.

Autor im Rampenlicht: Einzelmolekül-oberflächenverstärkte Raman-Streuungsmessungen durch plasmonische DNA-Origami-Nanoantennen  

This protocol demonstrates single-molecule surface-enhanced Raman scattering (SERS) measurements using a DNA origami nanoantenna (DONA) combined with colocalized atomic force microscopy (AFM) and Raman measurements.

Einzelmolekül-oberflächenverstärkte Raman-Streuungsmessungen durch plasmonische DNA-Origami-Nanoantennen ermöglicht

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) has the capability to detect single molecules for which high field enhancement is required. Single-molecule (SM) ...

Schnelle Nanoprobe Signal-Verbesserung durch In Situ -Gold-Nanopartikel-Synthese

Zusammenfassung

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Herstellung eines UV-Vis und Raman-Spektroskopie Immunoassay-Plattform

Gold Nanostar Synthesis mit einem Silver Seed vermitteltes Wachstum Methode

Eine einfache Methode für die Größe kontrollierte Synthese von stabilen Oligomere Cluster von Goldclustern unter Umgebungsbedingungen

Hydrochinon-basierte Synthese von Gold-Nanostäbchen

Microfabrication von Nanoporöse Gold-Patterns für Zell-Material-Interaktion Studies

Naked-Eye Detection of Rare Point Mutations in DNA

Gold-Nanopartikel-Synthese

Einzelmolekül-oberflächenverstärkte Raman-Streuungsmessungen durch plasmonische DNA-Origami-Nanoantennen ermöglicht

Einzelmolekül-oberflächenverstärkte Raman-Streuungsmessungen durch plasmonische DNA-Origami-Nanoantennen ermöglicht

Einzelmolekül-oberflächenverstärkte Raman-Streuungsmessungen durch plasmonische DNA-Origami-Nanoantennen ermöglicht