Dieser Test wurde entwickelt, um Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Plasmamembranbiologie zu behandeln und festzustellen, wie effizient geschädigte Zellen ihre Plasmamembran wieder versiegeln können. Diese Technik kann verwendet werden, um die Effizienz der Plasmamembran-Resealing in einer hohen Durchsatzkapazität zu messen und spezifische Proteine und entsprechende Wege zu identifizieren, die die Neuversiegelung der Plasmamembran vermitteln. Beginnen Sie mit 20 Millilitern einer 2,5 mal 10 zu den fünften HeLa-Zellen pro Milliliter Wachstumsmedium Suspension in ein steriles Pipettenbecken und verwenden Sie eine 10 Milliliter serologische Pipette, um die Zellen gründlich zu mischen.
Als nächstes verwenden Sie eine Mehrkanal-Mikropipette, um 100 Mikroliter Zellen pro Brunnen in Dreifache in einer 96-gut flachen, klaren, schwarzen Polystyrol-Gewebekultur behandeltPlatte auszusäen. Denken Sie daran, dass eine homogene Zellverteilung der Schlüssel zu einem erfolgreichen Experiment ist, da Vergleiche zwischen allen experimentellen Bedingungen gleichwertige Zellzahlen erfordern. Nach 24 Stunden im befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 den Plattenleser auf 37 Grad Celsius vorwärmen und die optische Konfiguration auf Monochromator, den Lesemodus auf Fluoreszenz und den Lesetyp auf kinetisch einstellen.
Wählen Sie unter den Wellenlängeneinstellungen einen Neun-Nanometer-Anregungs- und einen 15-Nanometer-Emissionsbandpass aus. Für Assays mit Propidiumjodid stellen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlängen auf 535 Nanometer bzw. 617 Nanometer fest. Wählen Sie unter Plattentyp 96-Bohrungen für das Plattenformat aus, und wählen Sie eine voreingestellte Plattenkonfiguration aus, die einer schwarzen wandklaren Bodenplatte entspricht.
Markieren Sie unter Lesebereich die Brunnen, die während des kinetischen Assays analysiert werden. Stellen Sie unter PMT und Optik die Blitze pro Lesegang auf sechs vor und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für das Lesen von unten. Geben Sie unter Timing null Stunden 30 Minuten und null Sekunden in die Gesamtlaufzeit für einen 30-minütigen kinetischen Test ein und geben Sie null Stunden fünf Minuten und null Sekunden für das Intervall ein.
Bestätigen Sie die angegebenen Einstellungen in den Einstellungen, und klicken Sie auf OK. Klicken Sie dann auf Lesen, um den kinetischen Lauf zu initiieren. Um die Bildparameter im Einstellungsmodus festzulegen, legen Sie MiniMax für die optische Konfiguration, die Bildgebung für den Lesemodus und den Endpunkt für den Lesetyp fest. Wählen Sie unter Wellenlängen das übertragene Licht und die entsprechenden Fluoreszenzboxen aus, die den experimentellen Anregungs- und Emissionswellenlängen entsprechen.
Legen Sie den Plattentyp und den Lesebereich als gerade demonstriert fest und legen Sie unter der Brunnenbereichseinstellung die Anzahl der Standorte innerhalb eines zu bebildernden Brunnens fest. Legen Sie unter den Bildaufnahmeeinstellungen für GFP das Gerät so ein, dass der gesamte Brunnen mit einer Belichtungszeit von 20 Millisekunden pro Bild ababgebildet wird. Bei durchgehendem Licht ein einzelnes Bild der Mitte jedes Brunnens mit einer Belichtungszeit von acht Millisekunden erfassen.
Für Propidiumjodid, erfassen Sie ein einzelnes Bild in der Mitte jedes Brunnens mit einer Belichtungszeit von 20 Millisekunden. Bestätigen Sie dann die Einstellungen in den Einstellungen, und klicken Sie auf OK und lesen Sie, um die Bildgebung zu initiieren. Um einen fluoreszenzbasierten Test mit hohem Durchsatz für die reparaturfreien Bedingungen einzurichten, waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 Mikrolitern 37 Grad Celsius M1 Medium pro Brunnen und fügen Sie 100 Mikroliter frisches 37 Grad Celsius M1 Medium hinzu, ergänzt mit 30 Mikromolar-Propidiumjodid, nachdem sie die zweite Wäsche entsorgt haben.
Für reparaturbeschränkungen Bedingungen, waschen Sie die Zellen einmal mit 200 Mikroliter 37 Grad Celsius M2 Medium ergänzt mit fünf Millimolar EGTA pro Brunnen gefolgt von einer Wäsche mit 200 Mikroliter M2 Medium allein. Nach dem Wegwerfen der zweiten Wäsche, fügen Sie 100 Mikroliter frische 37 Grad Celsius M2 Medium mit 30 Mikromolar Propidium Iodid pro Brunnen ergänzt. Dann stellen Sie die Platte unter Durchlicht, GFP und PI, wie gerade gezeigt.
Während der Abbildung der Platte eine 96 gut runde Unterseite der Polypropylen-Mikroplatte auf Eis platziert und die Platte so konfiguriert, wie gerade für die vorherige Platte gezeigt. Für die Reparatur freizügige Bedingungen, fügen Sie 100 Mikroliter eiskaltem M1-Medium hinzu, ergänzt mit 60 Mikromolar-Propidium-Iodid pro Brunnen, gefolgt von der Zugabe von 100 Mikrolitereisis M1 mit oder ohne 4X Listeriolysin O pro Brunnen. Für die Reparatur restriktive Bedingungen, fügen Sie 100 Mikroliter eiskaltem M2-Medium hinzu, ergänzt mit 60 Mikromolar-Propidium-Iodid pro Brunnen, gefolgt von der Zugabe von 100 Mikrolitereiseis M2 mit oder ohne 4X Listeriolysin O pro Brunnen.
Es ist zwingend erforderlich, Listeriolysin O bei entsprechender experimenteller Konzentration auf Eis etwa fünf Minuten vor Beginn des kinetischen Assays vorzubereiten, wenn Platte eins auf Eis und Platte zwei vorbereitet wird. Wenn die erste Platte fertig ist, übertragen Sie die Platte sofort auf eine Aluminiumfolie auf Eis. Nach fünf Minuten 100 Mikroliter von jedem Brunnen der zweiten Platte in die entsprechende entsprechende Bohrung in der ersten gekühlten Platte übertragen und die Pipettenspitzen unterhalb des Meniskus der Lösung in jedem Brunnen einsetzen, bevor das Volumen ohne Mischen für eine ordnungsgemäße Verteilung des Toxins ausgeworfen wird.
Lassen Sie das Toxin für eine Minute an die Wirtszellen binden und übertragen Sie sofort die erste Platte zum postkinetischen Assay im Spektrofluorometermodus. Am Ende des kinetischen Assays erhalten Sie sofort eine postkinetische Abbildung des Plattenbildes, wie für die vorkinetische Bildgebung demonstriert. Um die Zellzahl basierend auf der Kernfluoreszenz zu bestimmen, wählen Sie in der Mikroplattenzellaufzählungssoftware unter Einstellungen die Neuanalyse aus, und wählen Sie in den Bildanalyseeinstellungen die diskrete Objektanalyse mit 541 als Wellenlänge zum Suchen von Objekten aus.
Verwenden Sie in der Option Objekte suchen die Methode zum Suchen von Bildern, wählen Sie Kerne aus, klicken Sie auf Anwenden, klicken Sie dann auf OK, und lesen Sie, um den Zellzählalgorithmus zu initiieren. Die GFP-Expression stört nicht die Messungen der Propidiumjodidintensität in Gegenwart oder Abwesenheit einer Listeriolysin-O-Behandlung. Die Expression von Propidiumjodid kann durch GFP-Fluoreszenz bluten, wie eine Erhöhung der GFP-Fluoreszenzintensität in HeLA H2B-GFP-Zellen im postkinetischen Bildgebungstest im Vergleich zur vorkinetischen Analyse belegt.
Wichtig ist jedoch, dass diese Frequenzweiche die Zellzählung nicht beeinflusst, da der Segmentierungsprozess, der an der Aufzählung der Kerne beteiligt ist, nicht durch eine Erhöhung der GFP-Fluoreszenz beeinflusst wird. In Ermangelung von Listeriolysin O bleibt die Integrität der Plasmamembran in Gegenwart oder Abwesenheit von extrazellulärem Kalzium konstant, während die Listeriolysin-O-Behandlung in Gegenwart von Calcium-ergänzungsmittelmittel zu einer stetigen Erhöhung der Propidiumiodidfluoreszenzintensität führt. In Ermangelung von extrazellulärem Kalzium gibt es jedoch einen deutlich steileren Anstieg der Propidiumiodidfluoreszenz, was das Fehlen einer Membranwiederversiegelung widerspiegelt.
Alternativ kann ein Carbocyanin-Nukleinsäure-Bindungsfarbstoff mit Fluoreszenz im Fernrot durch Propidiumjodid ersetzt werden, um die spektrale Überlappung mit GFP zu minimieren. Darüber hinaus weist der größere Anregungskoeffizient für den weit roten Farbstoff ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis und eine bessere Auflösung zwischen den reparaturfreizügigen und reparaturrestriktiven Bedingungen auf. Beim Versuch dieses Verfahrens wird empfohlen, alle Röhren einen Tag vor dem Experiment zu kennzeichnen, da dies Sie auf die gesamte Reagenzzubereitung am Tag des Experiments vorbereitet.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Bildzytometrie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. eine Porenbildung von Toxinen, die alle Zellen gleichmäßig schädigen oder einige Zellen anfälliger als andere sind. Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik den Weg für Forscher in den Bereichen Infektionskrankheiten und Plasmamembranreparatur geebnet, um die Auswirkungen der Porengröße auf die Reparatureffizienz verschiedener Zelltypen zu erforschen.
