SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.

1. 96-Well-Lange Primer PCR <ol><li> Pre-freeze 96-Well PCR-Kühler in -80 ° C Gefrierschrank. </li><li> In einem 10 - ml - Tube, Vorbereitung Master Mix A: 2.100 ul ddH 2 O, 105 &amp; mgr; l PCR - Klasse DMSO, 105 &amp; mgr; l 10 mM dNTPs, 105 &amp; mgr; l pPot - Vorlage (25 ng / ul) 9, für ein Gesamtvolumen von 2.415 ul pro Platte . </li><li> Aliquot 23 ul in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte. </li><li> In 2 ul 100 uM gepoolt Primer an jeder geladen und ein P20 12-Kanal Mehrkanal-Pipette. Dichtung mit Film, Platz Platte auf der vorgekühlte PCR-Kühler und lassen für mindestens 20 min bei -80 ° C einzufrieren. </li><li> In einem 10 - ml - Tube, Vorbereitung Master Mix B: 2.048 ul ddH 2 O, 525 ul 10x - Puffer, 52,5 ul Polymerase für ein Gesamtvolumen von 2.626 ul pro Platte. </li><li> Entfernen Sie Platte und PCR-Kühler von -80 ° C-Gefrierschrank. </li><li> Mit der Platte noch auf dem PCR-Kühler, fügen Sie 25 ul Master Mix B auf der Oberseite des gefrorn Master Mix A für eine Gesamtreaktionsvolumen von 50 &amp; mgr; l. Dies ist zeitkritisch und sollte abgeschlossen sein, bevor Mix A auftauen kann. Dichtungsplatte mit Folie. </li><li> Eingestellt Thermocycler wie folgt: 94 ° C für 10 min, dann 30 Zyklen von 94 ° C für 15 sec, 65 ° C für 30 sec, 72 ° C für 2 min, gefolgt von einem letzten Verlängerungszeitraum von 72 ° C für 7 min . </li><li> Laden Sie die PCR-Platte, nachdem der Block 94 ° C erreicht hat. </li></ol> 2. Validierung von 96-Well-Lang Primer PCR <ol><li> Guss eine große 1% (w / v) Agarosegel in Tris-Acetat-EDTA (TAE) Laufpuffer mit 4 x 28-well Kämme ein Gel mit 4 Reihen von Vertiefungen zu geben. Richten abwechselnde Zähne des Kamms mit den Spitzen eines 12-Kanal-Mehrkanalpipette. versenken Sie vorsichtig das Gel in TAE-Puffer laufen, nachdem die Bahnen geladen werden. </li><li> Last 1 kb DNA - Leiter in der 1. und 28. Vertiefung jeder Reihe. </li><li> Unter Verwendung eines P20 12-Kanal Mehrkanal-Pipette 2 ul PCR-Produkt direkt auf jede Spur des Gels (1A). Tun Sie dies schnell die Möglichkeit einer Verunreinigung der Amplikons zu reduzieren. <ol><li> Laden Sie die PCR-Produkte aus der Zeile A der PCR-Platte in die ungeraden Bahnen der ersten Reihe des Gels (A1 - Spur 3, A2 - Bahn 5 ...... A11 - Spur 23, A12 - Spur 25) und laden Sie die PCR-Produkte von Zeile B der PCR - Platte in den geradzahligen Spuren der 1. Zeile des Gels (B1 - Spur 4, A2 - Spur 6 ...... B11 - Spur 24, B12 - Spur 26). </li><li> Laden Sie die PCR-Produkte von Zeile C und D der PCR-Platte das gleiche Muster wie oben beschrieben, mit der Zeile C in die ungeraden Bahnen und Reihe D in den geradzahligen Spuren. Wiederholen Sie diesen Lademuster, bis jede Vertiefung der PCR-Platte auf das Gel geladen wird. DNA-Ladepuffer ist nicht erforderlich, um dieses Gel zu laden. </li></ol></li><li> Legen Sie das Gel in den Lauftank und füllen Sie den Tank mit TAE-Laufpuffer, bis das Gel eingetaucht ist. Laufen bei 100 V für 30 min undunter Verwendung eines UV-Transilluminator sichtbar zu machen. Siehe 1B für ein Beispiel - Gel. Hinweis: Die PCR-Produkte können bei -20 ° C für mehrere Wochen vor der Transfektion gelagert werden </li></ol> 3. 96-Well-Transfection <ol><li> Verwenden Sie die T. brucei prozyklischen Form Zelllinie SMOXP9 10 für dieses Verfahren und wachsen in SDM-79 - Medium , das 10% FCS 10. </li><li> Verwenden 1 x 10 7 Zellen pro Transfektion (insgesamt 1,1 x 10 9 Zellen) , wenn auf dem N - Terminus des Proteins und 2 x 10 7 Zellen pro Transfektion (insgesamt 2,2 × 10 9 Zellen) etikettieren , wenn am C - Terminus Tagging von das Protein. Aufrechterhaltung der Zellen in mid-log (1,2 x 10 &amp; sup6 ; -1 · 10 &amp; sup7 ; Zellen / ml) für einige Tage vor der Transfektion geerntet und die Zellen für die Transfektion in einer Dichte von 5-8 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Erlauben frozen PCR-Produkte für die Transfektion bei Raumtemperatur auftauen. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämocytometer oder automatische Zellzähler. </li><li> Pellet erforderliche Anzahl von Zellen in mehrere 50 ml-Röhrchen bei 800 xg für 10 min. </li><li> Nach Zentrifugation discard Überstand und Resuspendieren der Zellen in 10 ml modifizierte cytomix (0,8 mM EGTA, 24 mM KCl, 0,15 mM CaCl 2, 10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,6, 25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 2,6 mM MgCl 2, 0,5% (w / v) Glucose, 100 ug / ml BSA, 1 mM Hypoxanthin, 144 mM Saccharose) pro Röhrchen. Übertragen Sie alle Zellenlösungen zu einem einzigen Rohr und drehen wieder bei 800 × g für 10 min. </li><li> Nach dem Zentrifugieren der Überstand verwerfen und die Zellen in 23 ml modifizierter cytomix für eine Endkonzentration von 5 x 10 7 Zellen / ml resuspendieren. </li><li> Während Zellen drehen, 1 ml SDM-79-Medium zu jeder Vertiefung von 4 x 24-well Gewebekulturplatten. Beschriften Sie die Platten AD und zeichnen einen Ring um gut A1 auf jeder Platte in Permanentmarker Plattenorientierung zu helfen. </li><li> Schließen Sie den Plattenhandhabungs zum -Elektroporator. Auf der electroporator Einheit eingestellt, die Spannung auf 1500 V, bis 500 msec die Impulslänge auf 100 &amp; mgr; s und die Anzahl der Impulse bis 12 und des Impulsintervalls. Auf der Platte Handler, stellen Sie die Pulszahl auf 1. Dadurch wird sichergestellt, dass die -Elektroporator einen einzigen Impuls zu jeder der 12 Spalten der Elektroporation Platte gelten. </li><li> Unter Verwendung eines P200 12-Kanal-Mehrkanalpipette, übertragen Sie die PCR-Reaktionen aus der PCR-Platte auf den 96-Loch-Einweg-Elektroporation Platten, 4 mm Spalt. </li><li> Wenn die Zellen versponnen und werden bis zu einer Endkonzentration von 5 x 10 7 Zellen / ml (Schritt 3.7) resuspendiert, Transfer in ein Reaktionsmittelreservoir. Je 200 ul der Zelllösung in jede Vertiefung der Elektroporation Platte mit einer P200 12-Kanal-Multikanal-Pipette, mit PCR-Produkt durch Pipettieren mischen. </li><li> Mit Gewebe entfernen Sie alle Tröpfchen von der Oberseite der Platte um Kurzschlüsse zu vermeiden. </li><li> Tragen Sie die Dichtungsfolie in der Platte Verpackung an die Spitze der Elektroporation Platte, pos bereitgestelltitioning es, um die Löcher für die Elektroden an der Oberseite und Unterseite jeder Spalte freigelegt zu lassen. Vermeiden Sie die angesprochenen Punkte Abdeckung verwendet, um den Film zu führen. </li><li> Legen Sie die Elektroporation Platte in den Plattenhandhabungs und den Deckel schließen. Drücken Sie &#39;Pulse&#39; auf der -Elektroporator Einheit. </li><li> Nach der Elektroporation übertragen schnell die Zellen von der 96-Well-Platte Elektroporation auf die 4 x 24-well Gewebekulturplatten. Um die Zellen zu übertragen, verwenden Sie einen P200 12-Kanal-Mehrkanalpipette mit jeder anderen Spitze fehlt, so dass die restlichen 6 Tipps Linie mit den sechs Reihen auf einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Übertragen Sie die elektroporierten Zellen in den 96-Well - Platten electroporations in vordefinierten Muster auf die 24-Well - Gewebekulturplatten (2A). </li><li> Bereiten Sie die P200 Pipettenspitzen - für jede 96-Well-Transfektion 2 Boxen mit 96 Spitzen mit jeder anderen Spalte entfernt vorzubereiten. <ol><li> Transfer Brunnen A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 auf der 96-Loch-Elektroporation PlatteEine Reihe A der 24-Well-Gewebekulturplatten Platte, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 in Reihe B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 in Reihe C und D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 in Reihe D. nach der Übertragung eines jeden Satzes von 6 Vertiefungen von der 96-Well-Platte mit der 24-Well-Platte werden die Vertiefungen in der 96-Well-Platte dann mit Medien aus den entsprechenden Vertiefungen in der 24- gewaschen Well-Platte und die Waschlösung wird dann zurück in die Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen überführt. </li><li> Transfer Brunnen E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 auf der 96-Loch-Elektroporation Platte bis 24-Well-Platte B Reihe A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 in Reihe B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 in Zeile C und H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 in Reihe D. nach der Übertragung eines jeden Satzes von 6 Vertiefungen von der 96-Well-Platte mit der 24-Well-Platte, die Vertiefungen in der 96 -Wanne Platte werden dann mit Medien aus den entsprechenden Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen gewaschen und die Waschlösung wird dann zurück in die Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen überführt. </li><li> Transfer Brunnen A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 auf der 96-Loch-Elektroporation Platte bis 24-Well-Platte C Reihe A, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 in Reihe B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 in Reihe C und D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 in Reihe D. Nach der Übertragung eines jeden Satzes von sechs Brunnen aus dem 96 -Wanne Platte an der 24-Well-Platte, die Vertiefungen in der Platte mit 96 Vertiefungen werden dann mit Medien aus den entsprechenden Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen gewaschen und die Waschlösung wird dann zurück in die Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen überführt. </li><li> Transfer Brunnen E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 auf der 96-Loch-Elektroporation Platte bis 24-Well-Platte D Reihe A, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 in Reihe B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 in Reihe C und H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 in Reihe D. nach der Übertragung eines jeden Satzes von 6 Vertiefungen von der 96-Well-Platte mit der 24-Well-Platte, die Vertiefungen in der 96 -Wanne Platte werden dann mit Medien aus den entsprechenden Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen gewaschen und die Waschlösung wird dann zurück in die Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen überführt. </li></ol></li><li> Unter Verwendung eines invertierten Phasenkontrastmikroskop untersuchen 1 gut aus jeder Spalte, die Zellen zu überprüfen. Es wird mit einem eine Mischung aus lebenden und toten Zellen seinbeträchtliche Menge an Zelltrümmern. Lebende Zellen können von toten Zellen unterschieden werden, weil sie unter dem Phasenkontrastmikroskopie hell sein wird und sich bewegen. </li><li> Legen Sie die 24-Well-Platten in einem sauberen, Kunststoff-Box mit einem Deckel, der eine dichte Abdichtung bildet. Legen Sie die Box in einem 28 ° C Inkubator. </li><li> Zwischen 6-8 Stunden später 1 ml SDM-79 mit FCS 10% gut 2x selektive Antibiotikum jeweils. In unserer Erfahrung, wo Zellinien die Gene am N-Terminus markiert sind, sind widerstandsfähig gegen höhere Konzentrationen des selektiven Arzneimittels. Daher erfordert / ml auf eine Endkonzentration von 20 ug verwendet Blasticidin als Beispiel am N-Terminus Tagging am C-Terminus Blasticidin und Etikettieren in einer Endkonzentration von 10 ug erfordert / ml Blasticidin. Hinweis: Transgene Zelllinien 9-10 Tage nach der Transfektion sichtbar werden. </li><li> Passage mindestens zweimal in frischem Arzneimittel- und Medien vor der Analyse. 2B zeigt die Ergebnisse aus einem typischen 96-well transfection für 96 verschiedene Proteine ​​am N-Terminus etikettieren. Beurteilen Sie jede Vertiefung durch Phasenkontrastmikroskopie zu bestimmen, ob es gesund enthält, arzneimittelresistenten Zellen. Eine gesunde und enthält überwiegend (&lt;95%) hochaktive Zellen, die in der Phase Vertrag Mikroskopie hell sind. Anschließende Analyse durch Epifluoreszenzmikroskopie oder Western-Blot ist erforderlich, um festzustellen, ob das Protein erfolgreich markiert ist. </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei:+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci.">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li><li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. 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M., MacGregor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+dissection+of+the+quorum+sensing+signalling+pathway+in+Trypanosoma+brucei.">Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).</li><li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., S&#233;raphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration+:+Abstract+Nature+Biotechnology.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology.</a> Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Los, G. V., Encell, L. 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M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei.">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dramatische Verbesserungen in der Empfindlichkeit der Proteomik und Transkriptomik Methoden in den letzten 5-10 Jahren auf Tausenden von Genen und ihren Produkten wertvolle Daten zur Verfügung gestellt. Allerdings sind die Werkzeuge die Funktion dieser Proteine ​​Adresse haben nicht Schritt gehalten. Tagging ein Protein erleichtert zahlreiche Versuche, seine Funktion zu bestimmen. Zum Beispiel kann ein Protein in einer Vielzahl von verschiedenen Farben zu einem fluoreszierenden Protein fusioniert werden Studien Lokalisation und Co-Lokalisierung zu erleichtern. Stichworte für die Elektronenmikroskopie entwickelt, wie APEX2 oder miniSOG 11,12 erlauben ultrastrukturelle Lokalisierung des markierten Proteins. Tags für die Biochemie, wie dem TAP - Tag und ProtC-TEV-ProtA (PTP) -Tag 7,13 Reinigung von Komplexen ermöglichen , mit dem Protein zur Identifizierung von Bindungspartnern oder in vitro biochemische Assays verbunden. Die spezifischen Schritte, die für den Erfolg der Protoc kritischol, sind: der Einbau von DMSO in die PCR Master Mix 1, Gefrieren des PCR Master Mix 1 vor der Zugabe des Master Mix 2, die Verwendung des handelsüblichen Polymerase in Master Mix 2 und der Modifikation des cytomix Elektroporationspuffer. Nach unserer Erfahrung ist es notwendig, die doppelte Anzahl von Zellen für die C-terminalen Markierungs Transfektionen wie für N-Terminal-Tagging Transfektionen verwendet werden, um einen ähnlichen Anteil an positiven Vertiefungen zu erreichen. Daher sollten alle Schritte wie beschrieben durchgeführt. Diese Technik ist wahrscheinlich nur erfolgreich sein, wenn das Insekt prozyklischen Form Trypanosomen transfizieren. Blutstrom Formen haben eine geringere Transfektionseffizienz 14, zudem sind sie wahrscheinlich aufgrund von Dichteabhängigen Toxizität bei der Auswahl zu sterben, die mit dem selektiven Medikament nicht in Beziehung steht. Daher stellt unsere bisherigen Protokoll die aktuelle beste Technologie für 9 von Blutformen Trypanosomen - Tagging. Es ist auch wahrscheinlich, dass die transfection Effizienz hängt von der spezifischen Trypanosomen-Isolat variieren. Dieses Protokoll wurde mit 927 SMOX prozyklischen Formen optimiert - andere Stämme zusätzliche Optimierung erfordern. Maßnahmen, welche die Erfolgswahrscheinlichkeit erhöhen können, umfassen: die Menge des PCR-Amplikons, Erhöhung der Anzahl von Zellen in der Transfektionseffizienz eingeschlossen. Wir stellen eine Methode, in der Hunderte von Proteinen können parallel markiert werden. Dies wird, groß angelegte Studien über die Lokalisierung und Interaktion zu erleichtern, die Ergänzung bestehender großer Datensätze und wertvolle Informationen für die Allgemeinheit erbringen. Primer-Vorlagen sind auf Anfrage erhältlich und eine Liste von Plasmiden Vorlagen finden Sie unter: http://www.sdeanresearch.com/

Trypanosoma brucei ist ein einzelliger Parasit, der bei Rindern menschlichen afrikanischen trypanosomasis und Nagana verursacht. T. brucei ist ein idealer Organismus für die Analyse von Proteinfunktion aufgrund der Kombination von hoher Qualität Genoms, zahlreiche Proteomik und Transkriptomik Datensätze und gut entwickelte molekulare Werkzeuge 1-3. Die Fortschritte in der Proteomik und Sequenzierung haben in großen Datensätzen geführt , die potentiell interessante Gene 4-6 hervorzuheben; Allerdings haben viele Gene minimale Informationen mit ihnen in den vorhandenen Datenbanken verbunden. Es besteht daher ein Bedarf für ein Hochdurchsatzverfahren Protein funktionelle Charakterisierung zu unterstützen. Expression eines markierten Proteins kann eine Vielzahl von Einsichten in ein Protein der Funktion geben. Zum Beispiel ist ein Protein mit einem fluoreszierenden Protein oder epitopmarkiert kann durch Fluoreszenzmikroskopie lokalisiert werden, die Informationen darüber, wo die prot gibtein könnte seine biologische Wirkung werden ausübt. Alternativ kann ein Protein mit einer TAP getaggt 7, HaloTag 8 oder His - Tag kann für biochemische Assays und Identifizierung seiner Interaktionspartner , gereinigt werden. Wir entwickelten kürzlich eine robuste Tagging Methodik für T. brucei 9. Benutzten langen Primer PCR die DNA für die Transfektion zu erzeugen und das Tagging von Dutzenden von Proteinen in parallel erlaubt - eine wesentliche Verbesserung bestehender Protokolle. Wir haben nun die Skalierbarkeit dieses Protokolls in prozyklischen Formen durch eine Größenordnung verbessert. Hier stellen wir unsere Methode, wo wir die PCR und Transfektion in 96-Well-Platten durchzuführen, wobei die Rückgewinnung und Auswahl auftretenden in Platten mit 24 Vertiefungen. Wie Hunderte von Proteinen können nun parallel markiert bietet dieses Verfahren eine kostengünstige und praktikable Methode für die gesamte Trypanosomen Genom-Tagging.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligonucleotide</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">na</td>
			<td style="width:167px;">desalt only (do not use additional purification)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:115px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">Included with the Expand HiFi pack</td>
			<td>Must be PCR grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP</td>
			<td style="width:115px;">any reputable</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Expand HiFi polymerase</td>
			<td style="width:115px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11759078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BTX ECM830</td>
			<td style="width:115px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HT-200 plate handler</td>
			<td style="width:115px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">HT-200</td>
			<td>Handles the 96-well eletroplates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MOS 96 ELECTROPLATE 4mm</td>
			<td style="width:115px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">45-0452</td>
			<td>Electroplate for the 96-well electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin S Hydrochloride</td>
			<td>Melford</td>
			<td style="width:119px;">3513-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hygromycin b Gold</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td style="width:119px;">ant-hg-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phleomycin</td>
			<td style="width:115px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">P0187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">225cm TC Flask, canted neck, phenolic cap</td>
			<td style="width:115px;">Appletonwoods</td>
			<td style="width:119px;">BC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">24 well culture plates</td>
			<td style="width:115px;">Appletonwoods</td>
			<td style="width:119px;">BC017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Eppendorf&#174; PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z606634-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well Multiply&#174; PCR plate with lateral skirt</td>
			<td style="width:115px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.1979.203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput gene tagging in trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

In dieser repräsentativen Transfektion wurden die Primer mit der TagIt Perl - Skript 9 und synthetisiert kommerziell entwickelt. Die 96-Well - PCR wurde wie beschrieben (1A) durchgeführt und validiert; in diesem Beispiel 95/96 PCRs erfolgreich waren (1B). Nach unserer Erfahrung Wiederholen fehlgeschlagen Reaktionen entweder mit den ursprünglichen Primern oder neu synthetisierten Primer nicht in erfolgreicher PCR führt. Die Amplikons wurden in 96-well Platten transferiert Elektroporation zur Elektroporation (2A) und dann in 24-Well - Kulturplatten zur Gewinnung und Selektion transferiert. Nach ausreichender Zeit die Auswahl stattfinden zu lassen, wurden die Vertiefungen für das Überleben vor der weiteren Analyse erzielt. In diesem Beispiel 88/96 Brunnen (92%) waren nach 15 Tagen Selektion positiv. <img alt = &quot;1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; Abbildung 1: Validierung von langer Primer PCR (A) Muster für die Übertragung von PCR - Produkte von 96-Well - PCR - Platte auf dem Agarose - Gel für die Validierung von PCR.. (B) Ein repräsentativer 96-Well - PCR - Validierung Gel für 95 Gene auf dem N - Terminus - Tagging und 1 Amplikon keine 5 &#39;Targeting Homologie enthalten , als negative Kontrolle in die Transfektionseffizienz zu wirken. Die Proben werden geladen auf ein 1% (w / v) Agarose - Gel und für 30 Minuten bei 100 V aufgelöst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> Abbildung 2: 96-Well - Elektroporation und Selektion (A) Muster für elektroporierten Zellen von 96-Well - Elektroporation plat übertragen.E 24-Well-Gewebekulturplatten. (B) Ein Schema , das eine typische Live / Dead - Scoring nach 15 Tagen Selektion in 24-Well - Platten zeigt. Grün steht für eine erfolgreiche Transfektion, grau stellt ein gut mit nur tote Zellen. In diesem Beispiel 88/96 (92%) von Wells enthielten erfolgreich transfizierten Parasiten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Hochdurchsatz-Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

high-throughput-gene-tagging-in-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

7.9K Aufrufe.  University of Oxford. Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Serie: High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

Die Untersuchung der Telomere G-Überhang Struktur in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Forschung

Immunologie und Infektion

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Skalierbare High Throughput Auswahl aus Phagen-Antikörperbibliotheken angezeigt Synthetische

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Nachweis von<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variante Oberflächen-Glykoprotein Switching von Magnetic Activated Cell Sorting und Durchflusszytometrie

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

Hochdurchsatz-Nachweis von Respiratory Pathogens in Tier Proben durch nanoskalige PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast cancers. However, a minority of cases displays a heterogeneous distribution of HER2-positive cells, which generates major clinical challenges. To date, no reliable and standardized protocols for the characterization and quantification of HER2 heterogeneous gene amplification in large cohorts have been proposed. Here, we present a high-throughput methodology to simultaneously assess the HER2 status across different topographic areas of multiple breast cancers. In particular, we illustrate the laboratory procedure to construct enhanced tissue microarrays (TMAs) incorporating a targeted mapping of the tumors. All TMA parameters have been specifically optimized for the silver in situ hybridization (SISH) of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) breast tissues. Immunohistochemical analysis of the prognostic and predictive biomarkers (i.e., ER, PR, Ki67, and HER2) should be performed using automated procedures. A customized SISH protocol has been implemented to allow a high-quality molecular analysis across multiple tissues that underwent different fixation, processing, and storage procedures. In this study, we provide a proof-of-principle that specific DNA sequences could be localized simultaneously in distinct topographic areas of multiple and heterogeneously processed breast cancers using an efficient and cost-effective method.

Heterogeneous distribution of HER2-positive cells can be observed in a subset of breast cancers and generates clinical dilemmas. Here, we introduce a reliable and cost-effective protocol to define, quantify, and compare HER2 intra-tumor genetic heterogeneity in a large series of heterogeneously processed breast cancers.

Aufbau einer Hochdurchsatz-Screening-Plattform zu beurteilen, die Heterogenität der HER2-Gene-Verstärkung in Brust-

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune system and is not targeted by the current antiretroviral therapy (cART). Transcription and splicing have been shown to reinforce HIV-1 latency in resting CD4+ T cells. Reversal of latency by the use of latency reversal agents (LRAs) in the &#34;shock and kill&#34; approach has been studied extensively in an attempt to purge this reservoir but has thus far not shown any success in clinical trials due to the lack of development of adequate small molecules that can efficiently perturb this reservoir. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently assessing latency reversal agents (LRAs) on HIV transcription and splicing. This approach is based on the use of an LTR-driven dual color reporter that can simultaneously measure the effect of an LRA on transcription and splicing by flow cytometry. The protocol described here is adequate for adherent cells as well as the cells in suspension. It is useful for testing a large number of drugs in a high throughput system. The method is technically simple to implement and cost-effective. In addition, the use of flow cytometry allows the assessment of cell viability and thus drug toxicity at the same time.

A high throughput protocol for functional assessment of HIV efficient reactivation and clearance of latent proviruses is described and applied by testing the impact of interventions on HIV transcription and splicing. Representative results of the effect of latency reversing agents on LTR-driven transcription and splicing are provided.

Hoher Durchsatz In Vitro Bewertung der Latenz Umkehrung Agenten auf HIV Transkription und Spleißen

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...