Dieses Protokoll befasst sich mit der möglichen Verwendung von Blutplättchen als hochempfindlicher Stickstoffmonoxid-Sensor sowohl in vitro als auch in vivo im Blut. Erhöhte Phosphorylierte Vasodilatator-stimulierte Phosphoprotein oder P-VASP Serin 239 in Thrombozyten Stickstoffmonoxid hat einige Vorteile, einschließlich der Fähigkeit, das Vorhandensein von Stickstoffmonoxid in nanomolaren Linien zu erkennen. Innerhalb von zwei Stunden nach dem Sammeln von 30 bis 50 Milliliter Vollblut von einem gesunden Spender, fügen Sie fünf Milliliter Aliquots des Blutes in die entsprechende Anzahl von 15 Milliliter konischen Röhren für zentrifugation.
Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um das plättchenreiche Plasma sorgfältig aus dem oberen Teil der Überräube zu sammeln. Pellet die plasmareichen Blutplättchen mit einer zweiten Zentrifugation und waschen Sie die Pellets vorsichtig in fünf Milliliter CGS Puffer. Zentrifuge bei 400 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Am Ende der Zentrifugation die Pellets in drei Milliliter modifizierten Tyrode-Puffer wieder aussetzen. Verwenden Sie ein Hämozytometer zum Zählen und passen Sie die Dichte der Thrombozytensuspensionen auf dreimal 10 bis zu den achten Zellen pro Milliliter in frischem Tyrode-Puffer an. Dann die Thrombozytensuspensionen für eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren.
In der Zwischenzeit sammeln Sie die roten Blutkörperchen aus den plattenfreien Plasmaschichten der Vollblutproben durch Zentrifugation, gefolgt von vier Wäschen in fünf Millilitern PBS pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche die Überstande entsorgen und die roten Blutkörperchen mit einem Milliliter der plasmareichen Blutplättchen an der entsprechenden experimentellen Hämatokrit in Polypropylenflaschen mit Gummistopfen geschlossen mischen. Setzen Sie eine Nadel, die mit einem Helium-Gastank verbunden ist, in jede Septa ein und setzen Sie 26-Spur-Nadeln ein, um Gasaustritte herzustellen.
Dann wirbeln Sie die Flaschen langsam bei Raumtemperatur und messen Sie mit einem Oximeter den teilweisen Sauerstoffdruck zur Überwachung des Desoxygenierungsprozesses. Die Sauerstoffabnahme rate hängt von der Heliumdurchflussrate und der Rührgeschwindigkeit ab. Daher sollte die Zeit der Sauerstoffversorgung vor Beginn eines Experiments optimiert werden, da dies stark von der Geometrie des Versuchsaufbaus abhängt.
Zur Reduktion der roten Blutkörperchen nitrit verwenden Sie eine Mikrospritze, um Nitrit durch das Septum in die desoxygenierten Proben von PRP und RBCs zu injizieren, so dass eine endgültige Konzentration von 10 Mikromolaren erreicht wird. Inkubieren Sie die Proben mindestens 10 Minuten bei 37 Grad Celsius und übertragen Sie einen Milliliter jeder Probe zur Zentrifugation in ein Mikrozentrifugenrohr. 300 Mikroliter Thrombozytensuspension aus dem oberen Teil der Überstande in neue Mikrozentrifugenröhrchen geben und säurezitratdextrose in einem Verhältnis von eins zu neun in jedes Rohr geben.
Zentrifugieren Sie die Blutplättchen erneut und setzen Sie die Pellets in 80 Mikrolitere eiskaltelyse Puffer mit Protease-Hemmer-Cocktail drei zu jeder Röhre wieder auf. Als nächstes laden Sie 15 Mikrogramm Protein aus jeder Probe auf zwei separate 10%SDS-PAGE Gele. Führen Sie die Gele bei 120 Volt für 1,3 Stunden.
Übertragen Sie die Gele am Ende des Laufs auf einzelne Lachgas-Zellulosemembranen und blockieren Sie jede unspezifische Bindung mit einem entsprechenden Volumen von 5% fettfreier Trockenmilch. Inkubieren Sie die Membranen mit den entsprechenden Primärantikörpern über Nacht bei vier Grad Celsius, gefolgt von der Kennzeichnung mit einem geeigneten sekundären Pferderettichperoxidase-Antikörper für 45 Minuten bei Raumtemperatur. Setzen Sie dann die Membranen mit einem Imager aus, um die Banddichte mit einem geeigneten Bildanalyseprogramm zu quantifizieren.
Gesunde venöse Blutproben haben teilweise Sauerstoffdruckwerte zwischen 50 und 80 Millimeter Quecksilber. Die Deoxgenation durch Helium verringert den Teildruck von Sauerstoff innerhalb von 10 Minuten schnell auf 25 Millimeter Quecksilber. Eine weitere Abnahme des partiellen Sauerstoffdrucks kann mit einer erhöhten Deoxygenierungszeit erreicht werden.
Erhöhte Deoxygenierung führt zu erhöhten Hämolyse, wie durch zunehmend rote Farbe Plasma angezeigt. Dies ist eine Auswirkung der Deoxygenierung und wird nicht durch Rühren selbst verursacht, wie durch das Fehlen von Hämolyse in Proben ohne Helium gerührt angezeigt. Sowohl Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein oder VASP- als auch Phosphorylierte-VASP-Expressionskonzentrationen in Thrombozyten verringerten sich mit zunehmender Hämatokrit in deoxygenierten Proben, wie sie von Western Blot nachgewiesen wurden.
Die Behandlung mit einem kurzlebigen Stickstoffmonoxidspender erhöht die phosphorylierte, vasodilatatorstimulierte Phosphoproteinexpression in Blutplättchen innerhalb von 10 Sekunden nach der Behandlung. Darüber hinaus blieben die Konzentrationen von Phosphoryliertem-VASP oder P-VASP bis zu 10 Minuten nach der Inkubation des NO-Spenders mit plättchenreichem Plasma stabil, was darauf hindeutet, dass genügend Zeit für die Trennung von RBCs von Thrombozyten zur Folge bleibt, ohne die bestehenden P-VASP-Spiegel zu beeinflussen. Nitrit erhöht auch die P-VASP-Spiegel von Thrombozyten in Gegenwart von desoxygenierten RBCs.
Hier hängt das Verhältnis von P-VASP zu Gesamt-VASP vom Hematokrit-Niveau ab. VASP ist stark in Thrombozyten exprimiert und wird in Gegenwart von Stickstoffmonoxid schnell phosphoryliert. Daher bietet dieses Protokoll eine Methode zur Untersuchung der Induktion von Stickstoffmonoxid durch verschiedene physiologische Reize.
Mit dieser Methode haben wir erfolgreich erhöhte P-VASP in Thrombozyten als Marker der Stickstoffmonoxidstimulation durch inhaliertes Nitrit in vivo eingesetzt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Thrombozyten mit einer biologischen Probe immer mit der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung durchgeführt werden sollte.
