Wir danken Dr. William Cashdollar, und der Northwestern Mutual Foundation Imaging Center an der Blut-Research Institute of Wisconsin für die Hilfe bei den bildgebenden Untersuchungen. Wir danken auch Dr. Daria Ilatovskaya für die kritische Durchsicht des Manuskripts und hilfreiche Diskussionen. Diese Studie wurde vom National Institutes of Health Grants HL108880 (AS) und DP2-OD008396 (AMG) unterstützt.

Die im folgenden beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) am Medical College of Wisconsin genehmigt und waren in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Isolierung von Rattenaorta, <ol><li> Betäuben Ratten mit Isofluran (5% Induktion, 1,5 bis 2,5% Wartung) oder einem anderen IACUC genehmigten Methode. </li><li> Legen Sie die Ratte in Rückenlage. Um die Bauchorgane aussetzen, einen kleinen ventralen Mittellinie Schnitt durch die Haut und das Unterhautgewebe Bauch. Verwendung Gazekompressen leicht abzulenken den Darm, die Aorta und die Vena cava freizulegen, wie in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Kurz, stumpf sezieren die Aorta vom Bindegewebe und aus der Vena cava. Verwendung Naht, binden Sie die Aorta so nah wie möglich an die Nieren. Sezieren etwa 1-2 cm von Aorta und legen Sie sie in einem 15 ml konischen tusein enthält normale physiologische Kochsalzlösung (PSS; in mM: 140 NaCl, 1,2 MgCl 2, 2 CaCl 2, KCl 4,5, 6 Glucose, 10 HEPES) auf Eis. </li><li> Sobald der Aorta wird isoliert, das Tier einschläfern nach anerkannten IACUC Protokolle. Bei Beendigung aller nicht-Überlebens Verfahren einschläfern tief narkotisierten Tiere durch Thorakotomie induzieren Pneumothorax, um die humane Ableben des Tieres zu gewährleisten. 3 </li><li> Mit Hilfe eines Dissektionsmikroskop, spitzen Pinzette und Mikroschere sezieren das Fett und Bindegewebe aus der Aorta. Sobald der Aorta ist sauber, schneiden Sie die Aorta in Längsrichtung und legen Sie sie in PSS auf Eis für später. </li></ol> 2. Dye Loading und Incubation <ol><li> Pipette 7 ul 1 mM Fluo-4.00 Farbstoff, der in DMSO basierenden Lösung zugeführt wird, in einzelne 500 ul Röhrchen, die mit Aluminiumfolie bedeckt worden. Lagern Sie im Gefrierschrank bei -20 ° C, um die Farbstoffeigenschaften mit der Zeit zu bewahren. Hinweis: Diese aliquotiert sosungen sollte für mindestens sechs Monate stabil sein. </li><li> Vor dem Einsatz, damit die Farbstofflösungen zum Aufwärmen auf RT vor dem Öffnen. Bereiten Sie Arbeitslösungen unmittelbar vor der Verwendung. Bewahren Sie die verdünnte Reagenz für die spätere Verwendung. </li><li> In 7 ul fertiger 1 mM Fluo-04.00 Farbstoff in DMSO-Lösung zu 450 ul der PSS, die kein Calcium aufgelöst. Dann werden 40 &amp; mgr; l DMSO nicht anhand 10% Pluronic Säurelösung zu der Lade Cocktail um die Dispersion der Acetoxymethyl- (AM) Ester und verbessern Beladung des Calcium-Farbstoff. </li><li> Legen Sie die seziert Aorten in die 500 ul Röhrchen, die das Laden Cocktail (wie in 2.3) für 1 h. Decken Sie alle Rohre mit Folie und Platz auf einem rotierenden Schüttler bei RT. </li><li> Um die NO-Produktion in das Gefäßsystem zu überwachen, verwenden Sie DAF-FM-diacetat Farbstoff. Inkubieren der Aorta in einer Lösung, die 450 ul PSS 40 ul Pluronsäure und 5 ul 10 mM DAF-FM-diacetat. Ähnlich wie bei der Kalzium Inkubationsprotokoll (in 2.3), legen Sie die Aortain einem 500 ul Röhrchen mit dem in der Folie und auf einem rotierenden Schüttler für 30 min bei 4 ° C, gefolgt von nächsten 30 min bei RT, abgedeckt NO-Farbstofflösung. </li><li> Wenn die NO-Produktion gemessen wird, verwenden Sie die endotheliale NO-Synthase-Blocker, L-NAME, um die NO-Produktion als ein Steuerungsblock, wie in 4B gezeigt. Für dieses Verfahrens in den Cocktail (Stand 2.5 beschrieben), 100 nM L-NAME für die letzten 30 Minuten Inkubation (bei RT). </li></ol> 3. Laser Scanning Zwei-Photonen-Mikroskopie Protocol <ol><li> Nach 1 h Inkubation, Waschen der Aorta 2 - 3 mal in saubere PSS an extrazelluläre Farbstoff zu entfernen. </li><li> Übertragen die Aorta in eine silikonbeschichtete Schale, die entweder normal PSS oder Ca 2+ -freiem Puffer (abhängig von der experimentellen Protokoll). Pin die Aorta nach unten auf die Silikonbeschichtung mit der Adventitia in Kontakt mit dem Silicon (dh endothelial Lumen zu der Schale Öffnung freigelegt) mit μ-förmigen Stiften. Alternativ können Sie einen Slice-AnchorGitter oder Klebstoff, um das Gewebe zu reparieren. Anmerkung: Um Stress und mögliche mechanische Artefakte, Übertragung zu reduzieren und zu beheben Aorta in Ca 2+ -freien Lösung und warten Sie 5 - 10 min vor dem Start des Experiments. </li><li> Verbinden eine peristaltische Pumpe oder eine Spritze zu der silikonbeschichteten Platte für die automatische oder manuelle Anwendung von Arzneimitteln oder zur Veränderung der extrazellulären Lösung. </li><li> Die Schale unter dem Mundstück des aufrechten Zwei-Photonen-Mikroskop, und installieren Sie und positionieren Sie eine 25 × (NA 1,05 und Arbeitsabstand 2 mm) Wasser-Immersions Objektivlinse über der Probe. Hinweis: Wenn diese spezifische Linse nicht verfügbar ist, verwenden Sie ein Objektiv speziell für Zwei-Photonen-Imaging hergestellt, weil es Signalauflösung drastisch im Vergleich zu einem regulären Ziel zu erhöhen. </li><li> Aktivieren Sie die Zwei-Photonen-Laser mit Hilfe der Software (der Laser beginnt zu pumpen und schalten Sie). Tune die Laseranregung zu 820 nm. </li><li> Verwendung Epifluoreszenz, suchen Sie die Aorta und konzentrieren sich auf das Ziel,die endotheliale Oberfläche mit Grobeinstellung. </li><li> Schaltet das Mikroskop in zwei Photonen-Laser-Scanning-Modus, so dass die Anregungslaser-Modus gesperrt ist, die nichtdescannten Detektoren aktiviert, und die entsprechenden mit dem erwarteten Emissionsspektren Emissionsfilter installiert sind. Hinweis: Hier wird die FV10-MRL / R (495-540 nM) wurden verwendet. </li><li> Starten Sie Live-Scannen mit ca. 5% der Laserleistung und fein fokussieren das Ziel, um die Endothelzellen zu visualisieren. Hinweis: Die Endothelzellen ein starkes Fluoreszenzsignal aufweisen, wenn sie in normalen PSS inkubiert. Dies wird deutlich schwächer sein, wenn die Schiffe in calciumfreien Puffer inkubiert. Die Endothelzellen auf der Oberseite der geöffneten Aorta und die glatten Muskelzellen unterhalb der Endothelzellen (siehe Figur 2) zu sehen ist anwesend sein wird. Da die Blutgefäße sind weder glatt noch einmal, wird es Orte, an denen sowohl glatten Muskelzellen und Endothelzellen vorhanden sind. &lt;/ Li&gt; <li> Sobald die Zellen im Fokus sind, programmieren Sie die Mikroskop-Software aufeinanderfolgenden Bildern in Fast-Scan-Modus (Raster-Scan, 512 x 512 Pixel-Fenster mit einem Rahmen Sammlung Frequenz von 1,1 s) zu sammeln. Parallel Fluo-04.00 Fluoreszenz, sammeln, um Veränderungen in der Gefäßkontraktion zu erfassen und die Versuchsbedingungen besser sichtbar zu Durchlichtbilder. </li><li> Nach der Erfassung der grundlegenden Signalbilder, ändern Sie die Ca 2+ Ionen-Konzentration in der Außenlösung oder langsam gelten pharmakologischen Reiz Agenten mit Hilfe der Schlauchpumpe, während Bildgebung. Beobachten Sie das Fluoreszenzsignal Anstieg innerhalb der beladenen Zellen. Hinweis: Die Endothelzellen reagieren auf Änderungen der Strömungs, empfiehlt es sich daher, um laminare Nieder Anwendungen und Fahrzeugtests vor der Anwendung von pharmakologischen Aktivatoren von Ca 2+ oder keine Signalisierung zu verwenden. Um intrazellulären Calcium zu nM Konzentrationswerte in Gefäße mit Fluo-4 (Dissoziationskonstante für Fluo-4 i geladen wird neu berechnets 345 nm) konnten Fluoreszenzintensität bei der Grundlinie und nach der Zugabe von Ionomycin und MnCl 2 aufgezeichnet. 4 </li></ol> 4. Bildverarbeitung und Berechnungen <ol><li> Downloaden und installieren Sie Fiji Bildverarbeitungspaket. </li><li> Öffnen Sie die Bilddatei in Fidschi. Nach dem Importieren der Datei, teilen Sie die Kanäle (Durchlicht und Fluoreszenzsignal), wenn Sie dazu aufgefordert. Verwenden Sie nur das Fluoreszenzsignal für die Datenanalyse. </li><li> Innerhalb der Fiji-Programm, klicken Sie auf der Registerkarte Analyse und unten scrollen, um die Option Tools. Unter der Option Tools, finden Sie auf die Registerkarte, die ROI-Manager sagt, und klicken Sie darauf; Ein neues Fenster wird angezeigt. </li><li> Danach klicken Sie auf Set-Messungen auf der Registerkarte Analyse. Wählen Sie die spezifischen Messungen von Interesse. Für die Kalzium transienten Messungen, verwenden Sie den mittleren Grauwert-Option. </li><li> Mit der Kreis Trace-Tool, damit beginnen, die Regionen von Interesse (ROI) zu verfolgen und klicken Sie auf &quot;Hinzufügen&quot; auf der ROI-Manager-Bildschirm für jeden ROI. Sobald alle Zellen von Interesse verfolgt worden, in der Manager-Fenster ROI, wählen Sie Multi Measure unter der Registerkarte &quot;Mehr&quot;. Denken Sie daran, entweder speichern Sie die Messungen direkt oder Kopieren und Einfügen alle diese Messungen in eine Tabellenkalkulation. </li><li> Öffnen * .txt-Datei oder Excel-Tabelle aus Fidschi und übertragen Sie die Zahlen auf ein neues Origin-Arbeitsblatt. Hinweis: Alternativ können Sie ein beliebiges Programm wie Sigma Plot oder Prism für die weitere Analyse. </li><li> Innerhalb der Origin-Programm verwenden Plot → Line + Symbol-Menü, um einen Überblick über alle vorübergehenden Reaktionen zu beobachten. Deaktivieren Sie die nicht reagierenden Zellen. </li><li> Neu berechnen Spurennummer Zeitskala (X-Achse), verwenden Spalte → Spaltenwerte errechnen und multiplizieren Sie die Spur-Nummer Spalte, um die Fotosammlung Frequenz (in unserem Fall 1,1 s). </li><li> Verwenden Sie Analysis → Zeilenstatistik für alle ausgewählten Aufnahmen auf Mittelwert (Y-Achse) und Standardfehler Spur zu berechnen. Plot endgültige Graph zur aktuellen Gruppe von Zellen Plot → Line + Symbol. </li><li> Die MEAn Calciumtransienten Berechnung wird beschrieben, wie gefolgt. <ol><li> Für Gesamtcalciumfreisetzung innerhalb des Origin-Programm, klicken Sie auf Graph, dann verwenden Sie Menü → Analysis Infinitesimalrechnung → integrieren. Gesamtintegral der Fläche unter der Kurve erscheint im Ergebnisprotokoll. </li><li> Für transiente Kinetik, klicken Sie auf Graph, dann verwenden Menü: Analyse → Nichtlineare Kurvenanpassung → Wählen Sie Data Set (wählen X-Achse reichen von maximal bis zum Ende der Übergangsfunktion). Starten Fitting → Select Function → Exponential Decay 1 → Done. Hinweis: Exponential Einbau in Grafikfenster angezeigt und Ergebnisprotokoll. Erhaltenen Daten (Werte), die den Gesamtcalciummenge freigegeben wird, und die Kinetik der Kanäle vermittelt das Einschwingverhalten. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+2-photon+microscopy+to+understand+albuminuria.">Using 2-photon microscopy to understand albuminuria.</a> Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).</li><li>Burford, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+podocyte+calcium+in+glomerular+injury+and+disease.">Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease.</a> J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).</li><li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H(2)O(2)+release+in+freshly+isolated+kidneys.">Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).</li><li>Ilatovskaya, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+analysis+and+calcium+imaging+in+the+podocytes+of+the+freshly+isolated.">Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated.</a> J Vis. Exp. In Press, (2015).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+superoxide+and+angiotensin+II+suppression+in+salt-induced+changes+in+endothelial+Ca2++signaling+and+NO+production+in+rat+aorta.">Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).</li><li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Plekha7+attenuates+salt-sensitive+hypertension+in+the+rat.">Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).</li><li>Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2.">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318, 558-561 (1985).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elastin+network:+its+relationship+with+collagen+and+cells+in+articular+cartilage+as+visualized+by+multiphoton+microscopy.">The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy.</a> J. Anat. 215, 682-691 (2009).</li><li>Sathanoori, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+modulates+endothelial+KLF2+through+activation+of+P2X4.">Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4.</a> Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).</li><li>Hall, A. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Multiphoton+Microscopy:+Focusing+Light+on+Acute+Kidney+Injury.">Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury.</a> Physiology. 29, 334-342 (2014).</li><li>Campese, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+sensitivity+in+hypertension.+Renal+and+cardiovascular+implications.">Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications.</a> Hypertension. 23, 531-550 (1994).</li><li>Cowley, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+nongenetic+determinants+of+salt+sensitivity+and+blood+pressure.">Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure.</a> Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).</li><li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hypertension+susceptibility+loci+on+rat+chromosome+12.">Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12.</a> Hypertension. 60, 942-948 (2012).</li><li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+multiple+causative+genes+at+a+single+GWAS+locus.">Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus.</a> Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).</li><li>Mattson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mutation+of+recombination+activating+gene+1+in+Dahl+salt-sensitive+rats+attenuates+hypertension+and+renal+damage.">Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).</li><li>Rudemiller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD247+modulates+blood+pressure+by+altering+T-lymphocyte+infiltration+in+the+kidney.">CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney.</a> Hypertension. 63, 559-564 (2014).</li><li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXM+-+a+new+tool+for+mapping+breast+cancer+risk+in+the+tumor+microenvironment.">CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment.</a> Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Experimental Übersicht. Um besser zu verstehen, vaskuläre Physiologie des Beitrags von Kalzium und NO wurde eine neuartige Methode zur Messung entwickelt [Ca 2+] i und NO in glatten Muskelzellen und Endothelzellen isolierter intakter Aorta. Zusammen, dieses Protokoll besteht aus diesen kritischen Schritte: 1) Mechanische Isolierung und Herstellung (nicht enzymatische Verdauung) des Schiffes. Es ist wichtig, das Gewebe gesund und intakt, so viel wie möglich, um eine optimale physiologisc...

Calcium ist ein Grund second messenger in vaskulären Zellen wie Endothelzellen und glatten Muskelzellen. Es ist der primäre Stimulus für die vaskuläre Kontraktion und spielt eine wichtige Rolle bei der Gefäßerweiterung, einschließlich der Auswirkungen unverErzeugung innerhalb des Endothels. Aufgrund der Beschränkungen von Imaging-Technologien, hat es praktisch unmöglich gewesen, Kalzium Handhabung innerhalb des intakten Schiffes zu beobachten. Die Entwicklung der Zwei-Photonen-Imaging-Systeme und die Schaffung neuer Calcium oder keine Kennzeichnung Farbstoffe, macht bei einer ausreichenden Tiefe und Auflösung es möglich, Bild zu beginnen, um Kalziumdynamik und NO-Produktion innerhalb des Gefäßsystems zu verstehen. Zwei-Photonen-Mikroskopie hat vor kurzem in Gewebe, Organe und sogar ganze Tierstudien wegen seiner überlegenen Fähigkeit, tief Gewebe mit geringer Hintergrundfluoreszenz und hohe Signalempfindlichkeit eindringen angewendet. 1,2 Der schmale Spektrum des Zwei-Photonen-Anregung bei der illuminatIonen Brennpunkt und die Verwendung nichtdescannten Detektoren sind die Gründe, warum zwei Photonen-Mikroskopie ist den herkömmlichen konfokalen Mikroskopie. Konfokale Mikroskopie kann qualitativ hochwertige Bilder zu erzeugen an der notwendigen Gewebetiefe aufgrund der Autofluoreszenz und die Streuung von out-of-focus Licht in die konfokale Lochblende. Folglich haben wir ein Verfahren unter Verwendung eines Zwei-Photonen-Mikroskop zur Messung von [Ca 2+] i-Signalisierung und die NO-Produktion in intakten, einzelnen Zellen von Blutgefäßen mit hoher Auflösung und niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis entwickelt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DAF-FM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-23842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo 4 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F14217</td>
			<td>500&#181;l in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68 solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Name</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Fluoview FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai HP DeepSee-OL&#160;</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td>Ti:sapphire laser 690nm &#8212; 1040nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV10-MRL/R&#160;</td>
			<td>495 to 540 nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25&#215; water-immersion objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPL25XWMP</td>
			<td>N.A. 1.05 and working distance 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Anchor grid&#160;</td>
			<td>Warner Instrument&#160;</td>
			<td>SHD-27LH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other basic reagents&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon imaging of intracellular ca2+ handling and nitric oxide production in endothelial and smooth muscle cells of an isolated rat aorta

Calcium ist ein wichtiger Regulator von vielen physiologischen Prozessen in vaskulären Geweben. Esten Endothel- und glatten Muskelfunktionen hängen stark von Änderungen der intrazellulären Calcium ([Ca 2+] i) und Stickstoffmonoxid (NO). Um zu verstehen, wie [Ca 2+] i, NO und Downstream-Moleküle werden durch ein Blutgefäß in Reaktion auf Vasokonstriktoren und Vasodilatatoren behandelt, eine neue Technik, die Kalzium-Kennzeichnung gilt (oder No-Kennzeichnung) entwickelten wir Farbstoffe mit zwei Photonen-Mikroskopie Kalzium Handhabung (oder NO-Produktion) in isolierten Blutgefäße zu messen. Hier beschrieben ist eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Verfahren, die, wie man eine Aorta einer Ratte, Etikett Calcium oder NO in den Endothelzellen oder glatten Muskelzellen zu isolieren und Bild Calciumtransienten (oder NO-Produktion) mit Hilfe eines Zwei-Photonen-Mikroskop folgenden physiologischen demonstriert oder pharmakologische Reize. Die Vorteile der Verwendung des Verfahrens sind mehrfach: 1) es ist möglich, gleichzeitigely messen Calciumtransienten sowohl in Endothelzellen und Zellen der glatten Muskulatur als Antwort auf verschiedene Stimuli; 2) es erlaubt, Bild Endothelzellen und glatten Muskelzellen in ihrer Muttereinstellung; 3) Diese Methode ist sehr empfindlich gegenüber intrazellulären Calcium oder keine Änderungen und erzeugt Bilder mit hoher Auflösung für präzise Messungen; und 4) beschriebene Vorgehensweise kann auf die Messung von anderen Molekülen, beispielsweise reaktive Sauerstoff-Spezies angewandt werden. Zusammenfassend Anwendung der Zwei-Photonen-Mikroskopie Laseremission zu Calciumtransienten und NO-Produktion in den Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Blutgefäß hochwertige quantitative Daten zur Verfügung gestellt und förderte unser Verständnis der Mechanismen, die Gefäßfunktion zu überwachen.

Um genau zu beurteilen, den Beitrag von Calcium zu vaskulären Physiologie (Vasodilatation und Vasokonstriktion) wurde ein Protokoll entwickelt, um Calcium-Farbstoffe in beiden Endothelzellen und glatten Muskelzellen in isolierten intakten aortae laden. Die allgemeine Versuchsanordnung in 1 dargestellt ist, zeigt die grundlegende Strategie für die Isolierung und Herstellung des Schiffes vor der Bildgebung. Kurz gesagt, nach der Isolierung der Aorta der Ratte, sollte es von Fett und Bin...

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta at JoVE.com

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Transport- und Stickoxid-Produktion in Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Rattenaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

two-photon-imaging-intracellular-ca2-handling-nitric-oxide-production

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

11.2K Aufrufe.  Medical College of Wisconsin. Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta. 

Serie: Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Forschung

Biologie

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

Focal Ca 2 + Transient-Erkennung in der glatten Muskulatur

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

Isolierung humaner Nabelschnur arteriellen glatten Muskelzellen (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Die Messung der Smooth Muscle Function in den Isolated Tissue Bath-Anwendungen Pharmakologie Forschung

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

Murine Aortic Crush Injury: Eine effiziente<em&gt; In vivo</em&gt; Modell der glatten Muskelzellproliferation und Endothelfunktion

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...