Das endoplasmatische Retikulum enthält eine dynamische röhrenförmige Domäne, die kontinuierlich mit dem Zytoskelett interagiert, die sich ständig bewegt und neu arrangiert. Wie der ER diese Organisation generiert und verwaltet, ist noch nicht vollständig geklärt. Hier präsentieren wir eine praktische Materie, um ein Bottom-up-Strukturorganellenmodell für den ER zu bilden, das aus einem festunterstützten proteinfreien Membransystem besteht, das auf komplexe Lipid-Nanoröhrennetzwerke übertragen werden kann.
Hydrophilie ist eine organische Verbindung für Energie. Proteinreinigung und Proteinextraktion sind nicht erforderlich. Die einzigen wesentlichen Komponenten sind das feste Substrat und Phospholipide, die das einfachste ER-Modell liefern.
Übertragen Sie die gelösten Lipidlösungen in einen 10 Milliliter invertierten birnenförmigen Kolben mit einer Gesamtmenge von 3.000 Mikrogramm Lipiden und 300 Mikroliter Chloroform. Dann verbinden Sie den Kolben mit einem Rotationsverdampfer und positionieren Sie ihn mit einer Neigung von 45 Grad. Drehen Sie den Kolben bei 24 U/min in einem Wasserbad bei 23 Grad Celsius für sechs Stunden mit reduziertem Luftdruck, um das Chloroform langsam und vollständig zu entfernen.
Beginnen Sie, den Druck direkt nach dem Beginn der Rotation durch Schritte von 20 Kilopascal alle zwei Minuten zu reduzieren, bis der Druck 20 Kilopascal erreicht. Nach sechs Stunden die Rotation stoppen und den Luftdruck schrittweise alle zwei Minuten schrittweise um 20 Kilopascal wieder erhöhen, bis 100 Kilopascal erreicht sind. Entfernen Sie den Kolben aus dem Rotationsverdampfer und fügen Sie drei Milliliter PBS und 30 Mikroliter Glycerin hinzu.
Den Kolben vorsichtig wirbeln, um das Glycerin aufzulösen. Verwenden Sie einen luftdichten Glasstopfen, um den Kolben mit den Lipiden zu versiegeln. Lagern Sie den Kolben bei vier Grad Celsius über Nacht im Kühlschrank, um die Lipidfilme zu rehydrieren und anzuschwellen.
Am nächsten Tag die Lipide mit einem Ultraschall-Wasserbad bei Raumtemperatur und 35-Kilohertz-Frequenz beschallen, bis eine gleichmäßige leicht trübe Lipidsuspension erreicht wird. Die Beschallung kann etwa 10 bis 30 Sekunden dauern. Längere Beschallung erzeugt Wärme und ist schädlich für die vesische Bildung.
Diese Schritte ergeben eine Suspension, die zwei Arten von vesikulären Strukturen enthält. Multilamellare Vesikel und riesige unilamellare Vesikel. Teilen Sie die Lipidsuspension mit insgesamt 30 Mikrozentrifugenröhren in 100 Mikroliter-Aliquots auf.
Die Aliquots in einem Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius aufbewahren. Ein Blitzeinfrieren mit flüssigem Stickstoff ist nicht notwendig. Die Lipidsuspension auftauen und ein vier Mikroliter Tröpfchen Suspension auf ein sauberes Glasmikroskop-Dia oder Deckelschlupf übertragen.
Nach 20 Minuten austrocknung bricht das Tröpfchen in einen flachen kreisförmigen Lipidfilm zusammen, der für das Auge sichtbar ist. Rehydrieren Sie den Lipidfilm mit einem Milliliter HEPES-Puffer für 3 Minuten. Bereiten Sie die Beobachtungskammer mit einer offenen Oberseite vor, um den Pufferaustausch mittels einer automatischen Pipette zu ermöglichen, die erforderlich ist, um die ER-Transformation wie im Textprotokoll beschrieben zu initiieren.
Nachdem Sie die ausgehärtete PDMS-Platte mit einem Spachtel entfernt haben, schneiden Sie den Rahmen mit einem Skalpell in die Abmessungen und Geometrie, die für die verfügbare Öffnung im Mikroskopstadium geeignet sind. Abmessungen von 1,5 mal 1,5 mal 0,5 Zentimetern sind für die meisten Setups geeignet. Bringen Sie die glatte Seite des PDMS-Rahmens in Kontakt mit der aktiven Seite der Oberfläche, auf der sich die Aluminiumoxidfolie befindet, und setzen Sie sanft Druck auf, um den Rahmen und die Oberfläche gegeneinander zu drücken, damit sie haften.
Füllen Sie die Beobachtungskammer sofort mit Kalzium-HEPES-Puffer. Füllen Sie nicht das gesamte Kammervolumen, um im folgenden Schritt die Zugabe der rehydrierten Lipide zu ermöglichen. Legen Sie die Kammer auf die konfokale Mikroskopstufe.
Übertragen Sie das rehydrierte Lipidmaterial, das nun eine Suspension mit riesigen Vesikeln enthält, mit einer Kunststoff-Weidepipette in die Kammer. Warten Sie 10 bis 20 Minuten, bis die Vesikel auf dem Substrat haften und sich über die Oberfläche verteilen. Die Ausbreitung beginnt unmittelbar nach der Ablagerung von Lipiden auf der Oberfläche.
Bevor sich das Lipid der Struktur ausbreitet, muss der Pufferaustausch so schonend wie möglich schnell entfernt oder schnell der Puffer zugefügt werden, der die Lipidstrukturen auf der Oberfläche stört. Nach der Beobachtung mehrerer Lipidaufstriche, entfernen Sie langsam den Umgebungspuffer über die automatische Pipette. So bleibt nur ein dünner Pufferfilm auf der Unterseite.
Achten Sie darauf, eine schnelle Entfernung zu vermeiden. Fahren Sie mit dem Umgebungspufferaustausch fort, indem Sie die Beobachtungskammer langsam mit einem Chelator-HEPES-Puffer mit einer automatischen Pipette füllen. Vermeiden Sie eine abrupte Zugabe.
Der letzte Schritt ergibt dynamische nanotubäre Netzwerke, die durch die Chelator-induzierte Depinning und Rückzug der DLBM zu den multilamellalaren Vesikeln gebildet werden. Hier sind Mikrographen der im Protokoll erhaltenen Nanoröhrchennetze zu sehen. In diesem Bild sind die kontinuierlichen leuchtend roten Bereiche der einziehbare Anteil der DLBM, der mit einer blauen gestrichelten Linie markiert ist.
Hier ist eine Mikrographie eines röhrenförmigen Netzwerks, die invertiert wurde, um den Kontrast zu erhöhen. Hierbei wird eine Reduktion der Röhrendichte auf einer Membranregion im Laufe von drei Stunden und 20 Minuten angezeigt. Die Abnahme der rohrförmigen Dichte erfolgt aufgrund der allmählichen Depinning gefolgt von Rückzug der DLBM von der Oberfläche.
Die Standorte der kalziumvermittelten Pinning-Punkte können als die Punkte festgelegt werden, an denen Die Rohre terminale oder scharfe Drehungen haben. Scharfe Kurven werden aufgrund der plötzlichen Richtungsverschiebung der Rohrausrichtung als v-Kreuzungen oder Wendepunkte bezeichnet. Der Endpunkt stellt die Endstation des Rohres dar, die ein Einziehen der Röhre verhindert.
Wenn die Ausbreitung über längere Zeiträume anhält, erhöht sich die Membranspannung, was zu Brüchen führt. Da die Lipide fluoreszierend gekennzeichnet sind, kann der Bruch direkt beobachtet werden. Ein wichtiger Indikator für den Bruch ist der signifikante Rückgang der Fluoreszenzintensität in der gebrochenen Region.
Eine vollständige Austrocknung der Probe oder ein schneller Austausch von Puffern führen zu Störungen, Bruch oder Verformung der Pflaster. Die Komplexität des Modells kann durch Hinzufügen von ER-assoziierten Komponenten wie Lipidproteinen aufgebaut werden. Und dieses Modell kann auch impliziert werden, um Selbstmontage, Nanofluidik, Marangoni-Fluss und Transportphänomene zu studieren.
Chloroform ist giftig und sehr flüchtig, es sollte immer unter einer Dunstabzugshaube und mit zugehöriger persönlicher Schutzausrüstung wie Polyvinylacetat Laborhandschuhe, Labormantel und Schutzbrille behandelt werden.
