Die Untersuchung der Tumormikroumgebung ist aufgrund ihrer Komplexität schwierig. Wir haben Mikroumgebungsmikroarrays entwickelt, die aus einfachen kombinatorischen Mikroumgebungen bestehen, die die Identifizierung wichtiger Treiber von Tumorzellphänotypen ermöglichen. Der hauptvorteil der MEMA-Plattform besteht darin, dass es aufgrund der definierten Mikroumgebungsbedingungen einfach ist, Mikroumgebungsfaktoren zu identifizieren, die Phänotypen von Interesse antreiben.
Die MEMA-Plattform ist in anderen Nicht-Krebs-Systemen, einschließlich Primärzellstämmen und Stammzellen, weit verbreitet. Es gibt eine Reihe von technischen Tricks und Schritten, die wir entwickelt haben, um die Arbeit an der nassen Bank zu beschleunigen und das Protokoll zu vereinfachen. Verwenden Sie zunächst einen Touch-Pin-Drucker, um extrazelluläre Matrixdruckmischungen an fiduzialen Flecken in Acht-Well-Platten zu drucken.
Verwenden Sie Pins mit 350 Mikrometern Durchmesser, die in einer vierfach siebendruckigen Druckkopfkonfiguration angeordnet sind, um die extrazelluläre Matrix für die Mikroumgebungsmikroarrays zu drucken. Der Kollagenblock wird als Raster auf MEMAs gedruckt. Die PBS-gefüllten Brunnen bieten zusätzliche Feuchtigkeit, um ein Austrocknen der extrazellulären Matrix-Druckmischungs-Quellplatte zu verhindern.
Drucken Sie die Arrays in den Acht-Well-Platten als 20 Spalten in 35 Reihen, für insgesamt 700 Punkte. Nach dem Drucken Platten mindestens drei Tage vor der Verwendung in einem Trockenschrank lagern. Entwerfen Sie zunächst ein 96-Well-Plattenlayout mit Abstand, das den Einsatz einer Mehrkanalpipette mit vier Abstandsspitzen ermöglicht, so dass die Behandlung vieler MEMA-Platten gleichzeitig erfolgen kann.
Dann holen Sie die Liganden aus dem Gefrierschrank, und tauen in Eis in einer laminaren Strömung haukapuze. Kurz streichen und drehen Sie jede Röhre nach unten. Verwenden Sie den vom Hersteller empfohlenen Puffer, um die Liganden auf einen 200-fachen Arbeitsbestand zu verdünnen.
Pipette 10 Mikroliter von jedem 200-fachen Ligandenbestand in den entsprechenden Brunnen innerhalb der 96-Well-Platte. Verwenden Sie Dichtungsfolie, um die Platten zu versiegeln und bei minus 20 Grad Celsius zu lagern. Erstellen Sie Ligandenbehandlungsplatten in Chargen und erfassen Sie alle Metadaten für die nachgelagerte Analyse.
Blockieren Sie vor der Kultivierung von Zellen die MEMAs mit zwei Millilitern pro Bohrkörper des nicht störenden Blockierpuffers für 20 Minuten. Verwenden Sie einen Y-Splitter mit zwei Pasteur Pipetten, um den Sperrpuffer in mehreren Brunnen gleichzeitig zu aspirieren, und waschen Sie dann die Brunnen dreifach mit PBS. Um die Austrocknung zu verhindern, lassen Sie das endgültige Volumen von PBS in den Brunnen, bis sie für die Zellbeschichtung bereit sind.
Optimieren Sie vor einem vollständigen MEMA-Experiment die MCF7-Zellsaatkonzentration, indem Sie ein Zelltitrationsexperiment durchführen. Ein idealer Ort, wie hier gezeigt, hat genügend Zellzahlen, um Daten zu extrahieren, aber nicht so viele, dass der Spot übermäßig konfluent ist. Im MEMA die verbleibenden PBS- und Saat-MCF7-Zellen bei 30 000 bis 35 000 Zellen pro Brunnen in zwei Millilitern Sämedium ansaugen.
Stellen Sie das MEMA bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator. Nach der Haftung über Nacht im Inkubator, aspirieren Sie das Medium und ersetzen Sie durch zwei Milliliter reduzierten Wachstumsmedium, um die stimulierende Wirkung von bestimmten Liganden zu isolieren. Dann eine zuvor gefrorene Ligandenbehandlungsplatte auf Eis auftauen.
Zentrifuge aufgetaut Platte bei 200 mal g für eine Minute. 200 Mikroliter Medium von jedem Brunnen in der MEMA-Kulturplatte auf den entsprechenden Brunnen in der Ligandenbehandlungsplatte übertragen. Rohrleitung nach oben und unten, um den Liganden mit dem Medium zu mischen, und diese Mischung zurück in den entsprechenden Brunnen in der MEMA-Kulturplatte übertragen.
Leicht von Hand schaukeln und die MEMA-Platten zum Inkubator zurückbringen, um die Liganden-ECM-Kombination bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zu bewirtschaften. Nach 71 Stunden 100-mal EdU in die MEMA-Bohrungen geben, um eine Endkonzentration von 10 Mikromolaren zu erreichen. Inkubieren Sie es für eine weitere Stunde bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Nach der letzten Inkubation, aspirieren Sie die Brunnen. Fix MEMAs in zwei Milliliter pro Brunnen von 2%PFA für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Dann die PFA aus den Brunnen aspirieren.
Permeabilisieren Sie mit zwei Millilitern pro Brunnen von 0,1% nichtionisches Tensid für 15 Minuten. Das Tensid ansaugen und dann die Brunnen mit zwei Millilitern PBS und PBS-T nacheinander waschen. Danach fügen Sie 1,5 Milliliter EdU-Erkennungsreaktionsreagenzien zu jedem Brunnen hinzu.
Eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, schaukeln und vor Licht schützen. Dann die Reaktion mit 1,5 Milliliter kommerziellequench Puffer pro Brunnen zu löschen. Wieder aspirieren und mit PBS-T waschen, bevor sie mit optimierten Konzentrationen von Flecken oder Antikörpern inkubiert werden.
MeMA-Brunnen mit primären Antikörpern im Färbepuffer inkubieren, die über Nacht bei vier Grad Celsius schaukeln. Nach der primären Antikörperinkubation, waschen Brunnen mit PBS gefolgt von PBS-T. Fügen Sie sekundäre Antikörper in 0,5 Mikrogramm pro Milliliter DAPI hinzu, verdünnt in Einem Färbepuffer.
Inkubieren, eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln schaukeln. Waschen Sie Brunnen zweimal mit zwei Millilitern pro Brunnen PBS, und lassen Sie sie in den letzten zwei Milliliter PBS. Um meMA abgebildet zu zeigen, stellen Sie es auf die Mikroskopstufe eines automatisierten Bildgebungssystems mit geeigneten Fluoreszenzdetektionskanälen.
Ausgabe resultierender Bilddaten an ein Bildverwaltungssystem. Segmentieren Sie Zellen und berechnen Sie Intensitätsstufen mit CellProfiler. In diesem Protokoll zeigen Zellzyklusprofile von binned DAPI-Intensitätswerten im Vergleich zu Zellzahlen von einer Acht-Well-Platte Zellen in g1 im Vergleich zur G2-Zellzyklusphase an.
Dies entspricht zwei nDNA-Gehalt in Zellen in der frühen Wachstumsphase und vier nDNA-Gehalt in Zellen, die kurz vor der Mitose stehen. Die Auswirkungen der Mikroumgebung von Liganden und ECM auf die Zellzahl und die EdU-Einarbeitung werden gezeigt. Rot gibt eine höhere Zellenzahl an, und blau ist die niedrigere Zellennummer.
Viele der Effekte sind Liganden-gesteuert, da die ECM-Bedingung die Zellzahl oder EdU-Positivität nicht stark beeinflusst hat. Natagen 1 ist eine klare Ausnahme, da das Vorhandensein dieses ECM-Moleküls die Zellbindung und das Wachstum von MCF7 hemmt. Liganden wie FGF6 und Neuregulin-1 alpha erhöhen die Zellzahl und haben hohe Raten der EdU-Inkorporation, während Liganden wie Amphiregulin und Neuregulin-1 SMDF die Zellbindung und das Wachstum von Zellen hemmen.
Ein Beispiel für MCF7-Zellen, die an einem meMA-Spot wachsen, der mit Neuregulin-1 alpha behandelt wird, zeigt hohe Raten der EdU-Inkorporation, die durch rosa Kerne angezeigt werden. In diesem Bild ist grüner Fleck eine Zellmaske und blau DAPI. Da ein vollständiges MEMA-Experiment teuer ist, ist es sehr wichtig, Optimierungsschritte wie Zell- und Serumtitrationen durchzuführen, bevor das vollständige Experiment durchgeführt wird.
Sobald mit der MEMA-Plattform mikroökologische Bedingungen von Interesse identifiziert wurden, können die spezifischen Liganden und extrazellulären Matrixproteine mit herkömmlichen 2D- und 3D-Zellkultursystemen eingehender untersucht werden.
