Das Ziel dieses einfachen reproduzierbaren biomimetischen 3D-Zell-basierten Systems ist es, invasionskapazitätsbasierte Analysen in großer Population von Tumorsphäroid für antimetastatische setische Arzneimittelscreening zu erleichtern. Der Hauptvorteil unseres Hydrogel-Mikrokammer-Arrays ist, dass es die Produktion einer großen Anzahl einheitlicher Sphäroide ermöglicht, die die gleiche Brennebene pro Brunnen bevölkern. Die Sphäroidposition bleibt aufgrund der Hydrogel-Mikrokammer-Arraystruktur auch nach extrazellulärer Matrixaddition erhalten, was die genaue kontinuierliche Überwachung der Sphäroide und des Invasionsprozesses erleichtert.
Darüber hinaus können die morphologische Charakterisierung und fluoreszierende Färbung zahlreicher Sphäroide und eindringender Zellen vor Ort durchgeführt und zeiteffizient mit einer Ein-Element-Auflösung analysiert werden. Die Demonstration des Hydrogel-Mikrokammer-Arrays für die Herstellung von Sechs-Well-Bildplatten wird Maria Sobolev aus unserem Labor sein. Um die Hydrogel-Mikrokammer-Arrayplatten vorzubereiten, zuerst sechs Polydimethylsiloxan oder PDMS auf 70 Grad Celsius vorheizen und eine sechswellige Glasbodenplatte auf ein trockenes Bad legen, das mehrere Minuten auf 75 Grad Celsius vorgeheizt wird.
Wenn die Platte warm ist, gießen Sie einen 400-Mikroliter-Tropfen vorgeheizter, niedrigschmelzender Agarose auf den Boden jeder Bohrung der Sechs-Brunnen-Platte, und legen Sie vorsichtig einen Stempel über jeden Tropfen. Lassen Sie das Setup für fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen, gefolgt von 20 Minuten bei vier Grad Celsius für volle Agarose-Gelation. Wenn sich die Agarose verfestigt hat, schälen Sie das PDMS vorsichtig von jedem Brunnen ab und lassen Sie die Agarose-Gele mit Mikrokammern gemustert.
Nachdem die UV-Lampe ihre höchste Intensität erreicht hat, legen Sie die geprägte Platte für drei Minuten in das Lichthärtungssystem und füllen Sie die UV-sterilisierten Makrobrunnen mit sterilem PBS. Dann bedecken Sie die Platte, und wickeln Sie sie mit Parafilm für vier Grad Celsius Lagerung bis zum Gebrauch. Um die Zellen zu laden, entfernen Sie die PBS aus jedem Brunnen, und laden Sie vorsichtig 50 Mikroliter der von Interesse sindden Zellen auf jedes Hydrogel-Array.
Nachdem sie den Zellen erlaubt haben, sich 15 Minuten lang durch Schwerkraft abzusetzen, fügen Sie vorsichtig sechs bis acht Aliquots von 500 Mikrolitern frischem Medium an den Rand des Makro-Gut-Kunststoffbodens außerhalb des Ring- und Hydrogel-Arrays. Inkubieren Sie die Zellen für den entsprechenden Zeitraum bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit Feuchtigkeit für die Bildung von Sphäroiden. Dann übertragen Sie die Sphäroide für 10 Minuten in eine Biosicherheitshaube auf Eis.
Wenn die Platte abgekühlt ist, lehnen Sie eine Pipettenspitze am Rand des Makro-Gut-Kunststoffbodens neben dem Hydrogel-Array an, und entfernen Sie das gesamte Medium um das Array herum. Dann entfernen Sie das Medium aus dem Array-Tank, lehnen Sie eine Gel-Ladepipettenspitze am Rand des Array-Tanks sehr sorgfältig, wobei Sie darauf achten, die Mikrokammern und Sphäroide nicht zu stören. Als nächstes verwenden Sie eine vorgefrorene, feine Pipettenspitze, um zwei Aliquots von 150 Mikrolitern der Kollagenmischung von Interesse am Rand des Arrays nacheinander hinzuzufügen, wodurch die Mischung langsam freigesetzt wird, um Sphäroiddislokationen zu vermeiden.
Nachdem die zweite Runde von Kollagen zu jedem Brunnen hinzugefügt wurde, geben Sie die Sphäroide für eine Stunde in den Inkubator zurück, um die extrazelluläre Matrix vollständig zu gelieren. Wenn die Matrix erstarrt ist, fügen Sie 400 Mikroliter vorgewärmt1%niedrigschmelzende Agarose auf die Oberseite des Gels, und inkubieren Sie die Platte, bedeckt bei Raumtemperatur, für fünf bis sieben Minuten, bevor Sie für zwei Minuten bei vier Grad Celsius für Agarose-Gelation abkühlen. Dann, die Pipette am Rand des Makro-Gut-Kunststoffbodens lehnen, fügen Sie vorsichtig zwei Milliliter komplettes Medium zu jedem Brunnen hinzu.
Um einen Invasionstest durchzuführen, laden Sie die Hydrogel-Mikrokammer-Arrayplatte auf eine motorisierte invertierte Mikroskopstufe, die mit einem 37-Grad-Celsius- und 5%Kohlendioxid-Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre ausgestattet ist, und verwenden Sie ein vier- oder zehnfaches Objektiv, um die Positionen für die Bildaufnahme in jedem Brunnen vorab zu bestimmen, so dass der gesamte Arraybereich bewertet wird. Dann erfassen Sie hellfeldbilder alle zwei bis vier Stunden für insgesamt 24 bis 72 Stunden, um die Zellinvasion vom Sphäroidkörper in die umgebende extrazelluläre Matrix zu verfolgen. Exportieren Sie am Ende der Bildaufnahme die Zeitrafferbilder aus der Bildaufnahmesoftware zum Speichern in einem markierten Bilddateiformat in einen dedizierten Ordner.
Öffnen Sie als Nächstes die grafische Benutzeroberfläche, und klicken Sie auf Helles Feld laden. Passen Sie die Segmentierungsparameter des Bildes an, um eine präzise Segmentierung der Sphäroide und ihrer Invasionsbereiche zu erreichen, und klicken Sie auf Segmentierung region of Interest, um einen Rahmen um jedes Sphäroid zu erstellen. Wenn die automatische Segmentierung falsch ist, drücken Sie Löschen oder Hinzufügen, und nehmen Sie die entsprechenden Korrekturen manuell vor.
Klicken Sie auf Tracking, um die Sphäroide in jedem der Zeitrafferbilder zu nummeriert. Klicken Sie dann auf Messen, um eine Kalkulationstabelle mit allen Parametern zu generieren, und speichern Sie die Kalkulationstabelle in einem geeigneten Format für die Datenverarbeitung und statistische Analyse. Um den Einfluss von Hyaluronsäure auf den spontanen HeLa-Sphäroid-Invasionsprozess zu untersuchen, wurden in diesem Experiment zweitagereife Sphäroide mit Kollagen- und Hyaluronsäure-Gemischlösung überzogen und mit zweitagereifen Sphäroiden verglichen, die allein mit Kollagenlösung bedeckt waren.
Nach 50 Stunden Inkubation zeigten die in Kollagen und Hyaluronsäure eingebetteten Sphäroide eine geringere Zelldispersion in die umgebende extrazelluläre Matrix im Vergleich zu den Sphäroiden, die allein in Kollagen eingebettet waren. Tatsächlich zeigt die Analyse der Invasionsbereichskinetik im Laufe der Zeit für 99 Sphäroide mit Single-Spheroid-Auflösung deutlich, dass die Zugabe von Hyaluronsäure zum Kollagen die Zelldispersion aus dem Sphäroid hemmt, was zu kleineren Invasionsbereichen führt. Die Behandlung der HeLa-Sphäroidkultur mit einem bioaktiven Flavonoid mit zyto- und migrastatischen Eigenschaften für 24 Stunden führt zu einer gehemmten Zelldispersion um die Sphäroide im Vergleich zu unbehandelten HeLa-Sphäroiden.
Tatsächlich ergab die Analyse der Invasionsbereiche von 488 Sphäroiden am Ende des Experiments eine signifikante Hemmung nach der Behandlung mit nur 10 Mikromolaren des Arzneimittels. Aufgrund der geringen Befestigungscharakteristik des Hydrogels erleichtert diese mikrokammerbasierte Technologie die Bildung von Sphäroidauchen auch bei sehr wenigen Zellen. Dies ist insbesondere bei wertvollen, begrenzten Krebsstamm- oder Patienten-abgeleiteten Primärzellproben von Vorteil.
Die Hydrogel-Mikrokammer-Bildgebungsplatte ermöglicht die Analyse der genauen räumlichen Lage der Sphäroide bei Langzeitexperimenten zur Bewertung des Invasionsprozesses auf Ein-Elemente-Ebene und bietet ein hohes Maß an statistischer Robustheit und Genauigkeit. Zukünftige Anwendungen dieser Methode umfassen die nebeneinander liegende Multizellkultivierung von Tumor- und Stromalzellen in verschiedenen Regionen innerhalb des Makrobrunnens und das Abrufen einzelner Sphäroide für die nachgeschaltete molekulare Analyse.
