Glioblastome sind verheerende Hirntumoren mit einem hohen invasiven Profil. Dieses Co-Kultursystem ahmt die Migration von Glioblastomzellen auf Neuronen nach, um einen der bei Patienten beobachteten invasiven Wege zu rekapitulieren. Die Geometrie und Zusammensetzung unseres Co-Culture-Modells wird präzise gesteuert.
Es ermöglicht eine bessere Reproduzierbarkeit und auch eine einfache Quantifizierung komplexer biologischer Prozesse. Diese Methode kann an die klinische Diagnose angepasst werden, indem frisch dissoziierte Glioblastomzellen und Neuronen co-kultiviert werden. Es definiert einen klinischen Index, der als klinisches Ergebnis sehr wichtig ist.
Unsere Methode kann auch verwendet werden, um andere wandernde Zellen wie Fibroblasten oder Immunzellen zu quantifizieren. Das Verfahren wird von Joris Guyon, einem Doktoranden aus meinem Team, demonstriert. Um ein Substrat für die Mikrostrukturierung herzustellen, behandeln Sie 18 Millimeter kreisförmige Glasabdeckungen fünf Minuten lang durch Luft- oder Plasmaaktivierung, bevor Sie die Abdeckschichten eine Stunde lang in einen Aussicker mit 100 Mikrolitern Triethoxysilan legen und dann eine Lösung von PEG-SVA mit 100 Milligramm pro Milliliter für eine Stunde inkubieren.
Für die Gelabscheidung fügen Sie am Ende der Inkubation drei Mikroliter PLPP und 50 Mikroliter absolutes Ethanol auf die Mitte des Objektträgers hinzu und warten Sie, bis er vollständig trocknet. Für die Mikrostrukturierung von Glasobjektträgern montieren Sie den Abdeckrlip in einer Ludin-Kammer und legen Sie die Kammer auf die Bühne eines Mikroskops, das mit einem Autofokussystem ausgestattet ist. Laden Sie nach der Bildgebung die Mikromusterbilder in die Software.
Nach der automatischen UV-Beleuchtungssequenzierung verwenden Sie eine Pipette, um das PLPP vom Abdecklappen ausgiebig mit PBS zu waschen. Dann inkubieren Sie den Coverlip mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Laminin für 30 Minuten, gefolgt von einer weiteren Wäsche mit PBS, wie gezeigt. Um eine embryonale Ratten-Hippocampus-Neuronenkultur auf den Mikromusterabdeckungen einzurichten, rehydrieren Sie die Glasobjektträger nach der letzten Wäsche mit neuronalem Zellkulturmedium.
Samen Sie fünfmal 10 bis zur vierten Ratte Hippocampus-Neuronen, die in neurobasalem Medium suspendiert sind, angereichert mit 3% Pferdeserum pro Quadratzentimeter auf jede mikrostrukturierte Abdeckung für eine 24-stündige Inkubation in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie dissoziierte Glioblastomzellen für fünf Minuten bei 1.000 U / min und resuspend das Pellet in Glioblastom-Zellkulturmedium, dann lagern Sie einmal 10 bis die dritten GBM-Zellen über die mikrostrukturierten Neuronen ab. Für die Live-Cell-Bildgebung der Zellen legen Sie die Co-Kultur auf die Bühne eines invertierten Mikroskops, das mit einer 37-Grad-Celsius-Thermostatkammer ausgestattet ist, und wählen Sie das 20X-Objektiv.
Verwenden Sie dann die multidimensionale Erfassungs-Toolbox in der Mikroskopsoftware, um alle zwei Minuten live Hellfeld- und Epifluoreszenz-GFP-Tomatenbilder für 12 Stunden in 16 verschiedenen Positionen zu erfassen, basierend auf der Anzahl der Muster mit Neuronen. Für die neuronale Netzwerkanalyse wählen Sie nach der Bildgebung ein Bild aus dem Stapel aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Netzwerkwerkzeug, um das entsprechende Optionsdialogfeld zu öffnen und die Einstellungen anzupassen, um eine präzise Segmentierung der Bilder zu erzeugen.
Klicken Sie auf OK. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Netzwerkwerkzeug, um das ausgewählte Bild zu duplizieren und das Bild in die farblichen Kanäle Rot, Grau und Grün aufzuteilen. Wählen Sie den Graukanal aus und führen Sie eine Kontrastdehnungsverbesserung durch, um die Trennung zwischen den verschiedenen Bereichen zu verbessern. Verwenden Sie den Sobel-Kantendetektor, um die 2D-Signalverarbeitungsfaltung durchzuführen, die unter dem Befehl "Kantensuche" gruppiert ist.
Für die doppelte Filterung wenden Sie Gaußsche Unschärfe und einen Medianfilter an, um das Rauschen zu reduzieren und das Objektsignal zu glätten. Um in Maske zu konvertieren, führen Sie angepasste Schwellenwertalgorithmen aus, um ein binäres Bild mit Schwarzweißpixeln zu erhalten. Als nächstes skelettieren Sie den Zellbereich in ein einfaches Netzwerk und verwenden Filterpartikel, um kleine nicht vernetzte Partikel in den Ergebnissen zu entfernen.
Netzwerkfilterpartikel in einem Netzwerkabbild. Um rote und grüne Kanäle zu erhalten, führen Sie eine doppelte Filterung durch und konvertieren Sie sie in eine Maske, wie mit der angepassten Schwellenwertmethode demonstriert. Verwenden Sie Analysepartikel, um die Zellmorphologie im binären grünen Bild zu bestimmen.
Verwenden Sie den Operator oder , um alle Kanäle mit ihren interessengebieten zusammenzuführen und ihre Anfangsfarbe in ein einfaches RGB-Bild anzupassen. Um eine Einzelzellmotilitätsanalyse durchzuführen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Einzelzellen-Tracking-Tool, um das entsprechende Optionsdialogfeld zu öffnen und die Einstellungen anzupassen, um eine präzise Segmentierung der Bilder zu erzeugen. Klicken Sie auf OK und klicken Sie mit der linken Maustaste auf Einzelzellenverfolgung, um den grauen Kanal zu entfernen.
Um ein Bild zu generieren, das einem Bildstapel entsprechend der Zeit entspricht, wenden Sie Z-Projektion und Doppelfilter an und konvertieren Sie, um die von den Zellen hinterlassenen Spuren zu maskieren. Entfernen Sie die kleinen Partikel aus dem binären roten und grünen Bild, wie gezeigt. Verwenden Sie das Werkzeug "Region of Interest", um jede Kontur der Zellablaufverfolgung auszuwählen, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Kantenerkennung überspringen im Dialogfenster Optionen.
Isolieren Sie den roten Kanal auf dem ursprünglichen Stapel und wählen Sie einen gewünschten Bereich aus. Filtern Sie alle Bilder doppelt und konvertieren Sie sie in eine Maske, damit die Zentroid-XY-Position jedes binarisierten Kerns bestimmt werden kann. Die XY-Positionen können verwendet werden, um die mittlere quadratische Verschiebung, das Richtungsverhältnis und die durchschnittliche Geschwindigkeit für die Zelle zu berechnen.
Für die Tracking-Analyse mehrerer Zellen klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Tracking-Tool, um das entsprechende Optionsdialogfeld zu öffnen und die Einstellungen anzupassen, um eine präzise Segmentierung der Bilder zu erzeugen. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Tracking-Tool, um den grauen Kanal zu entfernen. Teilen Sie die roten und grünen Kanäle auf, filtern Sie doppelt und konvertieren Sie sie in Maske.
Verwenden Sie dann den Befehl bildrechner mit dem und-Operator, um die Kanäle zusammenzuführen, wobei sich nur das Kernsignal in den Membranen befindet, und berechnen Sie das Trajektoriendiagramm, die mittlere quadratische Verschiebung, das Richtungsverhältnis und die durchschnittliche Geschwindigkeit für die Zellen, wie gezeigt. Fluoreszierendes GBM, das mit gemusterten Neuronen kokulturiert wird, modifizieren schnell ihre Form und zeigen eine Migration entlang neuronaler Erweiterungen in einer zufälligen Bewegung. GBM-Zellen, die auf Neuronen gesät sind, zeigen eine längliche Form mit mehreren Vorsprüngen, die den Neuronenspuren folgen, während die Zellen ihre abgerundete Form behalten, wenn sie auf Laminin kultiviert werden.
In späteren Stadien der Kultur können dünne Vorsprünge beobachtet werden, die mit Zellen in GBM-neuronalen Co-Kulturen verbunden sind. GBM-Zellen, die auf Neuronen ausgesät sind, zeigen eine größere Migrationskapazität als GBM-Zellen, die auf Laminin gesät werden, wie in diesen Trajektoriendiagrammen beobachtet. Die Analyse des fluoreszierenden Zusammenflusses der Zellen zeigt, dass über einen Beobachtungszeitraum von 500 Minuten mehr Zellmigration beobachtet wird, wenn die Sphäroide mit Neuronen kokuliert werden, als wenn die Zellen nur auf Laminin kultiviert werden.
Tatsächlich ist am Ende der Analyse fast die Hälfte des Musters mit GBM-Zellen bedeckt, während die auf Laminin kultivierten Sphäroide nicht an der Abdeckungslippe hafteten. Abhängig von den biologischen Fragen, die man beantworten möchte, sollte man darauf achten, dass das Musterdesign und auch die Zelldichte repräsentativ für die in vivo Bedingungen sind. Die Zellen können durch konfokale Mikroskopie fixiert und abgebildet werden.
Live-Imaging ist auch möglich, da unsere Methode die Bildgebungsmöglichkeiten nicht beeinträchtigt. Diese Technik eignet sich gut für die Untersuchung molekularer Interaktionen, wie z.B. des metabolischen Austauschs zwischen Glioblastomzellen und Neuronen. Es ermöglicht die Erforschung funktionsbiologischer Prozesse.
Hochdurchsatzexperimente können auch für klinische Zwecke durchgeführt werden.
