Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur umfassenden, unvoreingenommenen molekularen Charakterisierung einer einzelnen Probe unter Verwendung sowohl der Massenspektrometrie, der Metabolomik, Proteomik und Lipidomik als auch der Kernspinresonanzspektroskopieplattformen. Die Bedeutung dieses Ansatzes besteht darin, dass wir ein biologisches System charakterisieren können, das dem Genom nachgelagert ist, indem wir verschiedene Arten von Molekülen identifizieren, so dass wir Stoffwechsel- und Zersetzungswege ableiten können. Sequential Extraction Technique, ermöglichen die Extraktion von bioverfügbaren, polaren Verbindungen mit Wasser, gefolgt von MPLEx, um alle zusätzlichen polaren Verbindungen oder Metaboliten sowie Proteine und Lipide aus einer einzigen Probe zu erfassen.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da sie den Wissenschaftler durch die Trennung der drei Ebenen während des zweiten Extraktionsschritts und die Aufteilung der Extrakte auf verschiedene Analyseinstrumente führt. Integrative multi-omische Analysen ermöglichen effektivere Untersuchungen und ein vollständiges Verständnis komplexer biologischer Systeme. Diese robuste Methode extrahiert eine große Vielfalt an Molekülen und ist auf verschiedene Probentypen anwendbar.
Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Sammlung und Vorbereitung der Proben, wie im Textprotokoll beschrieben. Mit einem Ethanol gewaschen, Edelstahl-Utensil, aliquot 50 Milligramm jeder der getrockneten Proben in einzelnen zwei Milliliter Glasröhren. Fügen Sie jeder Probe einen Milliliter destilliertes, entgastes Wasser hinzu.
Dann die Fläschchen kappen und zwei Stunden lang auf einem Shaker-Tisch schütteln. Zentrifugieren Sie die Proben mit 15 Tausend Mal Schwerkraft für 30 Minuten. Und dann lassen Sie die Lösungen bei Raumtemperatur für 20 Minuten stehen.
Dekant und speichere den Überstand aus jeder Probe. Führen Sie eine MPLEx-Extraktion auf den nun wasserextrahierten Rückständen durch Wiederholung dieser Extraktionsschritte durch. Außer ein minus 20 Grad Celsius vier bis drei Chloroform zu Methanolgemisch für das destillierte, entgaste Wasser zu ersetzen.
Trennen Sie sorgfältig die beiden resultierenden Lösungsmittelschichten, die durch das Entfernen der obersten Schicht durch sorgfältiges Pipetieren visuell unterscheidbar sind. Trocknen Sie die untere nichtpolare Schicht im Gefriertrockner. Sobald es trocken ist, fügen Sie fünf Mikroliter Chloroform und 195 Mikroliter Methanol, wenn sie innerhalb der nächsten tage.
Zur Verbesserung der Elektrospray-Ionisationseffizienz für die Vierier-Transform-Ionen-Zyklon-Resonanzmassenspektrometrie, abgekürzt FTICR-MS durch Direkteinspritzung. Den Chloroform-Extrakt eins zu eins in Methanol verdünnen und das Wasser zwei zu eins in Methanol extrahieren. Kalibrieren Sie das FTICR-Spektrometer, indem Sie direkt 100 Mikroliter einer Tuning-Lösung in den FTICR-MS in einen Massenbereich von etwa 100 bis 1.300 Daltons einspritzen.
Direkte Injektion von 100 Mikrolitern des Suwannee River Fulvic Acid Standards in die Elektrospray-Ionisationsquelle. Gekoppelt mit dem FTICR-Spektrometer durch eine Spritzenpumpe, die auf eine Durchflussrate von 3,0 Mikroliter pro Minute eingestellt ist. Stellen Sie die Nadelspannung auf positive 4,4 Kilovolt ein.
Warteschlange eins bis 100 Masse-Zu-Lade-Verhältnis und die Glaskapillare bei 180 Grad Celsius. Überprüfen Sie die resultierenden Spektren mit der Analysesoftware, um die Qualität der Daten zu bestätigen. Bringen Sie nun 100 Mikroliter jedes Extrakts per Direkteinspritzung in die Elektrospray-Ionisationsquelle ein, gekoppelt an das FTICR-Spektrometer durch eine Spritzenpumpe, die auf eine Durchflussrate von 3,0 Mikroliter pro Minute eingestellt ist.
Legen Sie die Parameter wie zuvor fest. Passen Sie die Ionenakkumulationszeit für jede Probe oder Gruppe von Proben an, um die Variation der Kohlenstoffkonzentration zu berücksichtigen. Sammeln Sie 144 Scans für jede Probe, durchschnittlich die Scans und führen Sie dann eine interne Kalibrierung mit einer homologen CH2-Serie durch.
Trocknen Sie die Extrakte mit einem Konzentrator und speichern Sie den Rest der Extrakte für die anschließende Gaschromatographie-Massenspektrometrie, flüssige Chromatographie-Massenspektrometrie und Kernspinresonanzspektroskopie-Analyse. Zur Vorbereitung auf GC-MS bereiten Sie zunächst leere Kontrollbeispiele vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Zum Schutz von Carbinolgruppen fügen Sie 20 Mikroliter 30 Milligramm pro Milliliter Methoxaminhydrochlorid in Paradyne zu jeder der Proben hinzu, einschließlich der Methanolextrakte, der Wasserextrakte, der Rohlinge und der FAME-Kalibrierungsproben.
Versiegeln Sie die Fläschchen mit Kappen. Wirbeln Sie die Extrakte für 20 Sekunden, dann beschallen Sie die Extrakte für 60 Sekunden. Zentrifugieren Sie die Extrakte bei 37 Grad Celsius für 90 Minuten bei 100-facher Schwerkraft.
Fügen Sie 80 Mikroliter MSTFA mit 1%Trimethylchlorsilan zu jeder Probe hinzu. Nach dem Wirbeln und Beschallen der Extrakte wie bisher zentrieren Sie die Extrakte wieder bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten bei 100-facher Schwerkraft. Nach dem Abkühlen der Extrakte auf Raumtemperatur in GC-MS Autosampler-Fläschchen übertragen.
Fahren Sie mit der GC-MS-Analyse und -Datenverarbeitung fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Um sich auf die NMR-Analyse im Flüssigzustand vorzubereiten, verdünnen Sie den Rest der Wasserextrakte mit einem internen Standard von fünf Millimolaren DSS um 10 %. Übertragen Sie das Gemisch in ein hochwertiges Borosilikatglas NMR-Rohr mit einem Außendurchmesser von drei Millimetern.
Fahren Sie mit der NMR-Analyse und -Datenverarbeitung fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die LC-MS-Lipidomik-Analyse durchzuführen, injizieren Sie 10 Mikroliter jedes Extrakts in ein Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographiesystem, gekoppelt mit einem Orbitrap-Massenspektrometer mit einer umgekehrten Phasen-geladenen Oberflächenhybridsäule. Legen Sie einen 34-minütigen Farbverlauf fest, der im Textprotokoll mit einer Durchflussrate von 250 Mikrolitern pro Minute aufgeführt ist.
Verwenden Sie sowohl negative als auch positive Ionisationsmodi mit höherer Energiekollisionsdissoziation und kollisionsinduzierter Dissoziation. Um die Proteomikanalyse durchzuführen, extrahieren Sie zunächst Proteine gemäß dem MPLEx-Protokoll für den Rest der Methanolphase, wie im Textprotokoll beschrieben. Torf wurde mit der Tiefe im S1-Moor am Spruce and Peatlands Response Under Changing Environments oder SPRUCE-Standort in Minnesota, USA, verglichen.
3, 312 Enzyme wurden in der Proteomik-Analyse identifiziert. Eine Analyse der Enzymaktivitäten mit Tiefe zeigt, dass die Anzahl der Enzyme im SPRUCE Bog zwischen 15 Zentimetern und 45 Zentimetern stark zurückgeht. Um zu zeigen, wie sich die Standorte bei Metaboliten- und Enzymaktivitäten unterscheiden können, werden die SPRUCE-Ergebnisse mit denen eines Permafrost-Moores und Fens in Nordschweden verglichen.
Insgesamt wurden 67 040 Metaboliten in allen SPRUCE Peat Proben aus der Kombination von FTICR-MS-, NMR-, GC-MS- und LC-MS-Analysen identifiziert. Hier ist der relative Anteil verschiedener chemischer Klassen dargestellt, der durch verschiedene Techniken in den verschiedenen Tiefen identifiziert wird. Während Aminosäuren und Zucker mit der Tiefe abnehmen, wird dies bei Lipiden nicht beobachtet.
Durch kreuzvalidierende Metaboliten, die in allen Analysen gegen die KEGG-Datenbank identifiziert wurden, wurde festgestellt, dass die identifizierten Verbindungen an gemeinsamen Stoffwechselwegen wie Tricarbonsäurezyklus, Glykolyse und Zuckerstoffwechsel beteiligt sind. Während dieses gesamten Verfahrens ist es wichtig, sich der potenziellen Kontaminationsquellen bewusst zu sein. Ab der Probenentnahme sollten Proben nicht mit gezischen Kunststoffen in Berührung kommen, die sich negativ auf die Ionisierung auswirken können.
Viele der während des Extraktionsverfahrens verwendeten Lösungsmittel sind gefährlich oder entzündlich. Tragen Sie immer geeignete PSA, um Haut- und Augenkontakt zu vermeiden, sowie um eine Kontamination von Proben zu vermeiden.
