Wir möchten den UTMB imaging Core Einrichtungen und Maxim Ivannikov für Mikroskop Unterstützung bedanken.
Diese Arbeit wurde unterstützt von Public Health Service gewähren, RO1AI093445 und RO1AI129198 ausgezeichnet zu SP, UTMB Engagement Fonds P84373, CH und T32 AI007526 em.

1. Vorbereitung von A549 Zellen und JUNV Infektion
<ol><li>Samen 2 x 105 menschlichen Lunge A549 Epithelzellen auf Poly-D-Lysin (PDL) beschichtet Glasdeckgläser in 12-Well Platten bei 24 Stunden vor der Infektion.</li>
	<li>Bereiten Sie Aliquote von 150 mL JUNV13 bei einer Vervielfachung der Infektion (MOI) von 1,0 Plaque bilden Einheit pro Zelle verdünnt in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) Medien ergänzt mit 2 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin und Streptomycin (P/S ).</li>
	<li>Entfernen Sie Medien aus Zellkultur. Fügen Sie Virus Inokulum auf jeder gut mit Deckglas und 1,5 h bei 37 ° c inkubieren Schütteln Sie die Platten alle 15 Minuten.</li>
	<li>Entfernen Sie das Virus-Inokulum, fügen Sie 1 mL DMEM ergänzt mit 5 % FBS und 1 % P/S. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für gewünschten Zeitpunkt.</li>
</ol>2. Fixierung und immunostaining
<ol><li>Aspirieren Sie die Medien. Spülen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ergänzt mit Calcium und Magnesium in jede Vertiefung.</li>
	<li>PBS zu entfernen. Fügen Sie 1 mL Methanol (MeOH) vorab bei-20 ° C gekühlt und bei-20 ° C oder auf Trockeneis für 15 min inkubieren.</li>
	<li>MeOH zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL PBS in jede Vertiefung und waschen Proben bei 4 ° C mit sanftes Schaukeln für 5 min. Waschen für insgesamt 4-Mal wiederholen.</li>
	<li>Waschen Sie die festen Zellen auf Deckgläsern in 1 mL 0,2 % t-Octylphenoxypolyethoxyethanol für 5 min bei 4 ° C, mit sanften Schaukeln.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL PBS in jede Vertiefung. Waschen Sie die Proben bei 4 ° C für 5 min mit sanftes Schaukeln. Wiederholen Sie die Waschschritt für insgesamt 4-Mal.</li>
	<li>DsRNA MDA5 zu um erkennen, und inkubieren Sie Proben in 200 mL Primärantikörper in 3 % Rinderserumalbumin (BSA) verdünnt. Den Anti-DsRNA 9 5-Antikörper bei einer Verdünnung von 1:2 verdünnen und verdünnen des Antikörpers Anti-MDA-5 in 1: 250. Inkubieren Sie mit sanftes Schaukeln bei 4 ° C über Nacht.</li>
	<li>Primäre Antikörper zu entfernen und waschen jeweils gut mit 1 mL PBS für 5 min mit sanften Schaukeln bei RT Repeat dieses waschen noch viermal.</li>
	<li>Fügen Sie 200 mL Sekundärantikörper (1:2, 000 Verdünnung) mit 3 % BSA verdünnt und 1 h bei RT inkubieren.</li>
	<li>Sekundäre Antikörper zu entfernen und waschen jeweils gut mit 1 mL PBS für 5 min mit sanften Schaukeln bei RT Repeat dieses waschen noch viermal.</li>
	<li>JUNV Nucleoprotein (NP) zu erkennen und RIG-I, fügen Sie 200 mL von konjugierten Antikörpern in 3 % BSA verdünnt. Verdünnen Sie die konjugierten Anti-JUNV NP (AG-12) bei 1:1,000 und inkubieren Sie Proben für 2 h bei RT mit sanftes Schaukeln. Verdünnen des konjugierten anti-RIG-ich-Antikörpers bei 1: 500 und inkubieren Sie bei 4 ° C über Nacht mit sanftes Schaukeln.</li>
	<li>Konjugierte Antikörpern zu entfernen und waschen jeweils gut mit 1 mL PBS für 5 min mit sanften Schaukeln bei RT Repeat dieses waschen noch viermal.</li>
	<li>Counterstain Deckgläsern mit DAPI (1:1, 000) für 3 min mit sanftes Schaukeln bei RT</li>
	<li>Waschen Sie die Deckgläsern 3 Mal, jedes Mal für 5 min in 1 mL 0,5 % t-Octylphenoxypolyethoxyethanol mit sanftes Schaukeln bei RT</li>
	<li>Waschen Sie zweimal in 1 mL PBS für 5 min jedes Mal mit sanftes Schaukeln bei RT</li>
	<li>Einmal in 1 mL DdH2O für 1 min bei RT, Schaukeln sanft waschen.</li>
	<li>Mount Deckgläsern auf Glasobjektträger mit Montage Media. Lassen Sie die Kur über Nacht.</li>
	<li>Die Folien mit Nagellack versiegeln und an der Luft trocknen für 1 h.</li>
	<li>Bild auf confocal Mikroskop mit dem 60 X / 1,42 numerische Apertur Öl eintauchen Objektiv mit dem gleichen Laser Emissionen für jede Probe.</li>
	<li>Bei der Analyse der Daten, ggf. Anpassungen Sie für Helligkeit und Kontrast mit der gleichen lineare Anpassung für alle Proben.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jensen, S., Thomsen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+RNA+viruses:+a+review+of+innate+immune+receptors+involved+in+recognizing+RNA+virus+invasion.">Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion.</a> Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).</li><li>Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+is+produced+by+positive-strand+RNA+viruses+and+DNA+viruses+but+not+in+detectable+amounts+by+negative-strand+RNA+viruses.">Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 80, 6 (2006).</li><li>Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+of+direct+interaction+of+MDA5+and+the+dsRNA+replicative+intermediate+form+of+positive+strand+RNA+viruses.">Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses.</a> Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).</li><li>Onomoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+an+antiviral+stress+granule+containing+RIG-I+and+PKR+in+viral+detection+and+innate+immunity.">Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity.</a> PLoS One. 7, e43031 (2012).</li><li>Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+is+detected+by+immunofluorescence+analysis+in+RNA+and+DNA+virus+infections,+including+those+by+negative-sense+RNA+viruses.">Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses.</a> Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).</li><li>Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+double-stranded+RNA+colocalizing+with+pattern+recognition+receptors+in+arenavirus+infected+cells.">Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells.</a> Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251 (2018).</li><li>Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arenavirdae:+The+viruses+and+their+replication.">Arenavirdae: The viruses and their replication.</a> Fields Virology. 2, (2006).</li><li>Levis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+interferon+in+Argentine+hemorrhagic+fever.">Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever.</a> The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).</li><li>Levis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+endogenous+interferon+and+the+clinical+evolution+of+patients+with+Argentine+hemorrhagic+fever.">Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever.</a> Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pathogenic+new+world+and+old+world+human+arenaviruses+induce+distinct+interferon+response+in+human+cells.">Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells.</a> Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junin+virus+infection+activates+the+type+I+interferon+pathway+in+a+RIG-I-dependent+manner.">Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659 (2012).</li><li>Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pathogenic+new+world+arenavirus+infection+activates+the+pattern+recognition+receptor+protein+kinase+R+without+attenuating+virus+replication+in+human+cells.">Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells.</a> Journal of Virology. 91, 20 (2017).</li><li>Emonet, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+from+cloned+cDNAs+and+in+vivo+characterization+of+recombinant+pathogenic+Romero+and+live-attenuated+Candid#1+strains+of+Junin+virus,+the+causative+agent+of+Argentine+hemorrhagic+fever+disease.">Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease.</a> Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).</li><li>Child, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+the+protein+kinase+R+pathway+in+human+cells+by+Rhesus+Cytomegalovirus.">Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus.</a> Journal of Virology. 92, 6 (2018).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Für positiv-Sense-RNA-Viren und Viren DsDNA wird DsRNA leicht mit dem weit verbreiteten J2 Anti-DsRNA Antikörper erkannt. Allerdings sind negativ-Sense-RNA-Viren vermutlich DsRNA auf einem niedrigen oder unter die Nachweisgrenze mit dem gleichen Antikörper2zu produzieren. So sind viele Aspekte der viralen RNA und PRR Interaktion für negativ-Sense-RNA-Viren weitgehend unklar. Wir färben für DsRNA Arenavirus Infektion mit der J2-Antikörper versucht aber die Fluoreszenz-Signale wurden nicht di...

Der erste Schritt der Induktion der angeborenen Immunantwort ist Host Anerkennung der Doppelstrang-RNA (ds) durch die Muster-Anerkennung-Rezeptoren (PRRs) wie die Retinsäure (RIG-ich) wie Rezeptoren (RLRs) RIG-I und Melanom Differenzierung verbunden Eiweiß 5 (MDA-5)1. Für positiv-Sense-RNA-Viren DsRNA in der Regel leicht zu erkennen mit dem J2 oder K1 Anti-DsRNA monoklonaler Antikörper (Mab)2. Interaktion zwischen DsRNA und PRRs in positiv-Strang-RNA-Viren, wie z. B. Picornavirus, wurde mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie3gekennzeichnet. Jedoch für negativ-Sense RNA-Virus, hat Visualisierung und Charakterisierung der PRR und DsRNA Interaktion behindert worden durch das Fehlen von sensiblen Antikörpern gegen DsRNA. RNA Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) wurde auf die Visualisierung der viralen RNA und PRRs4angewendet. Dennoch, die Fisch-Methode erfordert die Kenntnis des Ziels RNA-Sequenz und möglicherweise nicht kompatibel mit PRR Co beflecken. Vor kurzem, 9 5 Mab, die ursprünglich für die Diagnose von Pan-Enterovirus-Infektionen entwickelt wurde, wurde festgestellt, dass viel empfindlicher als die J2 Mab und kann ohne weiteres erkennen DsRNA in negativ-Sense RNA-Virus-Infektion5,6. Mab 9 5 ist eine neuartige und nützliches Werkzeug, um die virale Replikation und die Interaktion zwischen PRR und virale RNA für negativ-Sense RNA-Virus zu studieren.
Arenaviruses sind eine Familie von einsträngige, negativ-Sense RNA-Viren, darunter mehrere humanpathogene Erreger wie Lassa Virus (LASV), Junin-Virus (JUNV) und Machupo-Virus (MACV), die schwere hämorrhagische Fieber Krankheiten im Menschen7verursachen. Klinische Daten von schwere und tödliche Fälle von argentinischen hämorrhagisches Fieber verursacht durch die neue Welt Arenavirus JUNV weisen ungewöhnlich hohe Serum IFN-α8,9. Wir haben gezeigt, dass die pathogenen NW-Arenaviruses (JUNV und MACV), aber nicht die pathogenen alten Welt Arenavirus, LASV, eine Art induzieren ich Interferon (IFN) Antwort in menschliche Monocyte-abgeleitete dendritische Zellen10. Darüber hinaus RIG-I ist einer der Sensoren Vermittlung Typ I IFN Antwort im JUNV-infizierten Zellen11. Wir fanden auch, dass der Protein Kinase R (PKR) Rezeptor, die traditionell für DsRNA Anerkennung bekannt ist, in pathogenen NW Arenavirus Infektion12aktiviert ist. Um den Mechanismus des Virus-spezifischen IFN Antwort während Arenavirus Infektion besser zu verstehen, wollten wir ein Protokoll, um die Interaktion zwischen viralen DsRNA und zytoplasmatischen PRRs visualisieren zu entwickeln.
Infektions-Experimente mit pathogenen JUNV, MACV und LASV in biologische Sicherheit erfüllt werden müssen Stufe 4 (BSL-4) Einrichtungen. So ist neben der vermutlich geringen DsRNA Arenavirus Infektion gegründet, den biologischen Anforderungen eine weitere Technik Herausforderung bei bildgebenden Untersuchungen für diese hoch pathogenen Viren. Durch die Verwendung der 9 5 Antikörper und die Candid1 # Impfstamm des JUNV, einem konfokalen Mikroskopie-basiertes Protokoll ist beschrieben in diesem Bericht wurde erfolgreich zur DsRNA, virale Proteine und PRR in durch Arenavirus in infizierten Zellen gleichzeitig visualisieren BSL2 Labs. Das Protokoll ist auch geeignet für die Visualisierung der intrazelluläre Verteilung von DsRNA und PRR während Pathogene Arenavirus Infektion in BSL4 Einrichtungen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4083</td>
			<td>1:1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11058</td>
			<td>1:2,000 dilution; Lot #: 1454437</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Bio</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>1:2000 dilution; Lot #: 1874804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lung epithelial A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MAb anti-JUNV NP</td>
			<td>BEI</td>
			<td>NA05-AG12</td>
			<td>Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>3361</td>
			<td>ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS supplemented with Ca and Mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDL Coated coverslips</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>H-12-1.5-pdl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit MAb MDA-5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab126630</td>
			<td>1:250 dilution; Lot #: GR97758-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombiant Candid#1 strain of JUNV</td>
			<td>Lab generated</td>
			<td>Lab generated</td>
			<td>As previously described in reference 13.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-376845</td>
			<td>1:1000 dilution; Lot #: AO218</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal imaging of double-stranded rna and pattern recognition receptors in negative-sense rna virus infection

Double-Stranded (ds) RNA wird als replikative Intermediate während RNA-Virus-Infektion hergestellt. Anerkennung von DsRNA von Host-Muster-Anerkennung-Rezeptoren (PRRs) wie die Retinsäure (RIG-ich) wie Rezeptoren (RLRs) RIG-I und Melanom Differenzierung-assoziierten Protein 5 (MDA-5) führt zur Induktion der angeborenen Immunantwort. Die Bildung und intrazelluläre Verteilung von DsRNA in positiv-Sense RNA-Virus-Infektion wurden gut charakterisiert, durch Mikroskopie. Viele negativ-Sense-RNA-Viren, einschließlich einige Arenaviruses auslöst der angeborenen Immunantwort, während Infektion. Negativ-Sense-RNA-Viren galten jedoch geringe Mengen an DsRNA, zu produzieren, die die bildgebende Untersuchung der PRR Anerkennung der viralen DsRNA behindert. Darüber hinaus müssen Infektions-Experimente mit hoch pathogenen Arenaviruses in high Containment Biosafety Level Einrichtungen (BSL-4) durchgeführt werden. Die Interaktion zwischen viralen RNA und PRRs für hoch pathogenen Virus RNA ist weitgehend unbekannt, aufgrund der zusätzlichen technischen Herausforderungen, die Forscher in den BSL-4-Anlagen stellen müssen. Vor kurzem fand ein monoklonaler Antikörper (Mab) (Klon 9 5) ursprünglich für Pan-Enterovirus-Erkennung verwendet speziell DsRNA mit eine höhere Empfindlichkeit als die traditionellen J2 oder K1 Anti-DsRNA Antikörper erkennen. Hierin, durch die Verwendung der 9 5 Antikörper, beschreiben wir ein konfokalen Mikroskopie-Protokoll, das erfolgreich verwendet wurde, um DsRNA, virale Proteine und PRR gleichzeitig in einzelnen Zellen infiziert durch Arenavirus visualisieren. Das Protokoll eignet sich auch für die bildgebenden Verfahren der DsRNA und PRR Verteilung in pathogenen Arenavirus infizierte Zellen in BSL4 Einrichtungen.

Dieses Protokoll wurde angewandt, um die Verteilung und Kolokalisierung zwischen den RLRs zu studieren (RIG-I und MDA-5) und DsRNA in JUNV-infizierten Zellen. Wie in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt, erhöht die Anhäufung von DsRNA im Laufe der Zeit als virale Infektion fortschreitet. Konzentriert, MDA-5 (Abbildung 1) und RIG-I (Abbildung 2) Signale wurden mit der pun...

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Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Doppelsträngige RNA produziert während der RNA-Virus-Replikation man Muster Anerkennung Rezeptoren erkennt an eine angeborene Immunantwort zu induzieren. Für negativ-Sense-RNA-Viren bleibt die Interaktion zwischen dem Low-Level-DsRNA und PRRs unklar. Wir haben eine Methode konfokalen Mikroskopie Arenavirus DsRNA und PRR in einzelnen Zellen visualisieren entwickelt.

Konfokale Abbildung von Double-Stranded RNA und Muster Anerkennung Rezeptoren im negativen Sinn-RNA-Virusinfektion

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Herkömmliche Doppelstrang-RNA-Detektionstest ist in der Regel nicht empfindlich genug, um Doppelstrang-RNA zu erkennen, die in einer negativ-sinnlichen RNA-Virusinfektion gebildet wird. Daher ist die Wechselwirkung zwischen doppelsträngiger RNA und Hostmustererkennungsrezeptoren für diese Viren weitgehend schwer fassbar. Mit diesem Protokoll sind wir in der Lage, die Wechselwirkung zwischen viralem Kernprotein, Doppelstrang-RNA zu visualisieren und zu charakterisieren und eine PRRs auf einzelliger Ebene für negativ-sinnliche RNA-Viren zu hosten. Dies ist ein Multiplex-Assay, der die gleichzeitige Färbung von doppelsträngiger RNA und zwei viralen oder Hostprotein-Targets in einzelnen Zellen ermöglicht. Im Gegensatz zum RNA-FISH-Assay ist diese Technik RNA-sequenzunabhängig und in der Regel mit dem Antikörpernachweis von Proteinzielen kompatibel. Beginnen Sie 24 Stunden vor der Infektion, indem Sie 200. 000 menschliche Lungenepithel-A549-Zellen auf poly-D-Lysin beschichtete Glasabdeckungen in 12-Well-Platten aussäen und mit 37 anbauen.

confocal-imaging-double-stranded-rna-pattern-recognition-receptors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K Aufrufe.  University of Texas Medical Branch. Herkömmliche Doppelstrang-RNA-Detektionstest ist in der Regel nicht empfindlich genug, um Doppelstrang-RNA zu erkennen, die in einer negativ-sinnlichen RNA-Virusinfektion gebildet wird. Daher ist die Wechselwirkung zwischen doppelsträngiger RNA und Hostmustererkennungsrezeptoren für diese Viren weitgehend schwer fassbar. Mit diesem Protokoll sind wir in der Lage, die Wechselwirkung zwischen viralem Kernprotein, Doppelstrang-RNA zu visualisieren und zu charakterisieren und eine PRRs auf ein...