Wir danken Alejandro Brun von KAG-INIA für die Bereitstellung von Anti-Virus Rift Valley Fieber Seren. Die Arbeit in unseren Labors wird durch Forschungsförderung gem unterstützt. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Gießen und Marburg, die Leibniz Graduate School für Schwellen-Viruserkrankungen (EIDIS), dem DFG-Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, und die DFG-Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

1. Seeding von A549 Zellen für Infektions <ol><li> Eine T75-Flasche von A549-Zellen zu kultivieren, auf 37 ° C und 5% CO 2 in Zellkulturmedium (DMEM, ergänzt mit 10% FCS, 526,6 mg / l L-Glutamin, 50.000 U / l Penicillin und 50 mg / l Streptomycin). </li><li> Vor dem Start, um die Zellen zu ernten, Aufwärmen Zellkulturmedium, PBS und 0,05% Trypsin-EDTA in einem Wasserbad auf 37 ° C erhitzt, </li><li> Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS. Entfernen Sie das PBS wieder. </li><li> 3 ml Trypsin-EDTA und ebenso in dem Kolben zu verteilen. Übertragen Sie die Flasche in einem Inkubator mit 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Wenn alle Zellen abgelöst werden, 7 ml Zellkulturmedium resuspendieren, und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 g für 5 min bei RT, entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 10 ml frischem Zellkulturmedium. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. </li><li> Add 2,5 x 10 6 Zellen in 5 ml Zellkulturmedium in zwei T25-Kolben mit jeweils. Inkubation für 16 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. Ein Kolben dient der Scheinkontrolle und eine für Cl 13-Infektion. </li></ol> 2. Infektion mit Rift-Valley-Fieber-Virus Clone 13 (Cl 13) <ol><li> HINWEIS: Cl 13 ist eine abgeschwächte Virus-Mutante, die in Deutschland unter BSL-2-Bedingungen behandelt werden. Bitte auf die jeweiligen nationalen Richtlinien. Weitere typische IFN-Induktoren würde Sendai Virus (Stamm Cantell) oder Newcastle-Krankheit Virus sein. </li><li> Vorwärmen PBS, Serum-freien Medium und Zellkulturmedium mit 5% FCS. </li><li> Planen 1,25 x 10 7 PFU / ml Cl 13 in serumfreiem Medium auf 2,5 x 10 6 A549-Zellen mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 5 infiziert. Vorbereiten einer leicht (etwa 10%) größeren Menge als nötig, um Rechenschaft Pipettenfehler. </li><li> Waschen der Zellen mit PBS, wie unter 1.3 beschrieben. </li><li> 1 ml der Verdünnung oder Cl 13Serum-freies Medium (infizierte Kontroll, mock) zu den Zellen und Inkubation für 1 h bei 37 ° C und 5% CO 2. 15 min bewegen den Kolben sorgfältig zu Gleichverteilung der Cl 13 Verdünnung und serumfreien Medium zu gewährleisten sind. </li><li> Nach 1 Stunde der Infektion, entfernen Sie die Inokula, 5 ml vorgewärmten Zellkulturmedium mit 5% FCS und Inkubation für 5 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 3. Herstellung von Zelllysaten <ol><li> Vorbereitung PBS / 0,5% Triton X-100 bei 4 ° C Fügen Sie nicht Serin-Protease-Inhibitoren. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit kaltem PBS und 10 ml frischem PBS. </li><li> Kratzen Sie die Zellen aus, übertragen Sie die Zellsuspension in einem Falcon-Röhrchen und-Zentrifuge bei 800 g für 5 min bei RT. </li><li> Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 30 &amp;mgr; l PBS / 0,5% Triton X-100. Übertragen Sie das Lysat in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen und Inkubation für mindestens 10 min bei 4 ° C </li><li> Zentrifugieren Sie das Lysat um 10.00 Uhr0 g für 10 min bei 4 ° C und übertragen die geklärte Zelllysat (Überstand) in ein frisches Röhrchen. </li><li> Bestimmen Sie die Proteinkonzentration nach Bradford, wie an anderer Stelle 33 beschrieben. </li><li> Lagerung bei -20 ° C oder fahren Sie mit Trypsin-Verdauung (4.1) oder native PAGE (5.1). </li></ol> 4. Bestimmung von Konformationsänderungen von Pattern Recognition Receptors <ol><li> TPCK-Trypsin-Behandlung von Zelllysaten <ol><li> Verdünnen L-1-tosylamido-2-phenylethyl-chlormethylketon behandelt (TPCK)-Trypsin in PBS bis zu einer endgültigen Arbeitskonzentration von 2 ug / ul. </li><li> Einstellen in zwei neue Schläuche eine Protein-Endkonzentration von 25 &amp;mgr; g jedes Proteins Lysat (mock oder Cl 13) in einem Endvolumen von 9 ul mit PBS. Daher sollte es vier Röhrchen mit je 25 ug Lysat zweimal Mock und zweimal Cl 13-Infektion. Ein als Eingangskontrolle (unbehandelt) und ein Satz für die Behandlung mit TPCK-Trypsin gesetzt. </li><li> 1 &amp;mgr; l PBS (unbehandelt)oder 1 &amp;mgr; l 2 &amp;mgr; g / &amp;mgr; l Trypsin-TPCK (Endkonzentration: 0,2 ug / ul) zu den Zelllysaten und mischen die Reaktionen durch Pipettieren. Einfrieren und auftauen TPCK-Trypsin-Aliquots, denn es wird die Effizienz der Verdauung beeinträchtigen. </li><li> Die Lysate bei 37 ° C für 25 min. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 5x denaturierenden Probenpuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% Glycerin, 25% β-Mercaptoethanol, 0,5% Bromphenolblau) und durch Kochen für 5 min bei 95 ° C. Es ist wichtig, nicht das Trypsin Inkubationszeit verlängern. Falls keine Protease-resistenten Fragmente nachweisbar sind, muß die Zeit der Trypsin-Verdau verkürzt werden. </li><li> Nach dem Kochen können die Proben bei -20 ° C gelagert werden </li></ol></li><li> SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Western Blotting <ol><li> Laden der Proben auf einem Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gel mit einem 5% igen Sammelgel in einem 12% Trenngel. Trennen Sie die Proteine ​​bei 25 mA pro Gel, bisdie Bromphenolblau abläuft. </li><li> Aktivieren einer Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran für 30 Sekunden mit Methanol und steckte es in Transferpuffer (48 mM Tris, 39 mM Glycin, 1,3 mM SDS, 20% Methanol). </li><li> Vorbereitung der Blot mit einem halbtrockenen Blotting-Systems und erlauben den Transfer der Proteine ​​bei 10 V für 1 Stunde. Nehmen Sie die Membran aus, spülen Sie es kurz mit Wasser und trocknen lassen. </li><li> Reaktivieren Sie die Membran kurz in Methanol übertragen. Für 5 min mit TBS waschen. Block mit 10% Magermilch in TBS für 1 h bei RT oder bei 4 ° CO / N Für jeden mit TBS 5 min Waschen Sie die Membran 3x. </li><li> Antikörperverdünnung herzustellen, wie in Tabelle 1 empfohlen und Inkubation der Membran für 1 h bei RT oder bei 4 ° CO / N </li><li> Für jeden mit TBS-T 10 min Waschen Sie die Membran 3x. Fügen Sie den entsprechenden sekundären Antikörper bei einer 1:20.000 Verdünnung in 1% Magermilch in TBS, gekoppelt mit Meerrettich-Peroxidase. Inkubieren 45 min bei RT. </li><li> Für jeden mit TBS-T 10 min Waschen Sie die Membran 3x, und one zusätzliche Zeit mit TBS. </li><li> Für Signalerkennung verwenden Kommerzielle Chemilumineszenz-Kit und eine digitale Gel Imaging System. </li></ol></li><li> Coomassie Brilliant Blue G-250 Färbung <ol><li> Führen SDS-PAGE, wie in 4.2.1 beschrieben. Laden Sie die Proben auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel und führen Sie das Gel bei 25 mA pro Gel, bis Bromphenolblau abläuft. </li><li> Führen Coomassie Brilliant Blue G-250-Färbung bei RT. Haben alle Inkubationen unter ständigem Schütteln. </li><li> Übertragen des Gels an der Fixierungslösung, die 40% Methanol und 10% Essigsäure für 30 min. </li><li> Tauschen Sie den Puffer in Entfärbelösung (25% Ethanol und 8% Essigsäure) und Inkubation für 5 min. </li><li> Flecken des Gels mit 0,2% Coomassie Brillant-Blue G-250 in 40% Methanol und 10% Essigsäure für 1 Stunde. </li><li> Entfärben des Gels mit der Entfärbelösung und Austausch des Puffers nach 10 min, 30 min und 60 min. </li><li> Speichert das Gel in 25% Ethanol, 8% Essigsäure und 4% Glycerin bei 4 ° C. </li&gt; <li> Führen Abbildung und Analyse wie unter 4.2.8 beschrieben. </li></ol></li></ol> 5. Analyse der Oligomere Staaten von Pattern Recognition Receptors <ol><li> Native PAGE <ol><li> Vorbereitung 50 &amp;mgr; g Zelllysat in einem Endvolumen von 10 ul mit PBS und mit 5 × nativen Probenpuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 1% Natriumdeoxycholat, 50% Glycerin, 0,5% Bromphenolblau) auf eine Endkonzentration von 1x. </li><li> Laden Sie die Proben sofort auf einem nativen Polyacrylamid-Gel mit 5%, wie das Stapeln und 8% Trenngel. Jede Verzögerung wird zu einem Verlust der nativen Komplexe 34 führen. </li><li> Die Elektrophorese bei 20 mA pro Gel bei 4 ° C mit 50 mM Tris-NaOH pH 9,0, 384 mM Glycin als Anode und als 50 mM Tris pH 8,3, 384 mM Glycin, 1% Natriumdesoxycholat als Kathodenpuffer. Nach 1,5-2 h (Bromphenolblau Band hat das Gel ca. 45 min früher links) die Elektrophorese beendet. </li></ol></li><li> Western-Blotting <ol><li> Aktivieren Sie einen polyvinylidene (PVDF)-Membran für 30 Sekunden mit Methanol und sie in Towbin-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, 20% Methanol). </li><li> Montieren Sie einen nassen Fleck Kammer gemäß den Anweisungen des Herstellers und füllen den Tank mit Towin Puffer. </li><li> Führen die Blotting mit 250 mA für 1,5 h bei 4 ° C. </li><li> Beim Lösch wird, gehen Sie wie von 4.2.3 beschrieben beendet. </li></ol></li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Erfassen der Anwesenheit von Viren und die Aktivierung des antiviralen Typ I IFN-Systems sind entscheidend für eine erfolgreiche angeborenen Immunantworten 22. Virenerkennung wird dabei durch Erreger recognition receptors (PRR), wie RIG-I und PKR vermittelte, was eine schnelle Reaktion und Aktivierung der antiviralen Abwehrmechanismen. Hier beschreiben wir zwei Methoden, um den Aktivierungsstatus des RIG-I und PKR direkt auswerten. Begrenzte Proteaseverdau als Werkzeug, um Konfor...

Ein entscheidendes Ereignis in der antiviralen Wirtsabwehr ist die schnelle Nachweis des Erregers durch die so genannte Mustererkennungsrezeptoren (PRR) 1,2. Intrazellulären Nachweis von RNA-Virus-Infektion ist abhängig von zwei cytoplasmatischen RNA-Helikasen, RIG-I (Retinsäure-induzierbares Gen-I) und MDA5 (Melanomdifferenzierung-assoziiertes Protein 5) 3-5. RIG-I besteht aus zwei N-terminalen Caspase-Rekrutierungsdomänen (Karten), einer zentralen DECH-box Typ-RNA-Helikase-Domäne und einer C-terminalen Domäne (CTD) 4,6 zusammen. Während die CTD und die Helikase-Domäne für die Anerkennung von Nicht-Selbst (viral) RNAs erforderlich, die Karten vermitteln nachgeschalteten Signal der zur Schaffung eines antiviralen Wirts Status. Wenn RIG-I im stillen Zustand, dh in Abwesenheit von einem bestimmten RNA-Liganden interagiert der zweiten Karte mit der zentralen Helikasedomäne und hält RIG-I in einem Auto-hemmende Konformation 11.07. RIG-I bindet an kurze doppelsträngigeStrang (ds) RNA trägt ein 5&#39;-Triphosphat (5&#39;PPP), lange dsRNA und PolyU / UC-reiche RNA, klassische Unterschrift Strukturen, die auf die Genome vieler RNA-Viren 12-16 vorhanden sind. Zwei wichtige Eigenschaften von RIG-I-Aktivierung sind ein Schalter in eine geschlossene Konformation 6,17 und der Homo-Oligomerisierung 6,18,19. Die Konformationsänderung Schalter erhöht RNA-Bindung, macht die Karten für nachgeschalteten Signal und rekonstruiert eine aktive ATPase Website 8,9,11,20. Die Bildung von oligomeren RIG-I-Komplexe führt zu verbesserten Einstellung nachgeschalteten Signaladaptermoleküle, um eine Plattform für antivirale Signaltransduktion 11 zu bilden. Das RIG-I-regulierten Signalkette schließlich aktiviert den Transkriptionsfaktor IRF-3 für die Hochregulierung von Interferon (IFN-alpha/beta)-Gene und damit die Genexpression von Interferon-stimulierten Gene (ISG) für eine volle antivirale Antwort 21,22 . Eines der am besten charakterisierten ISG ist die RNA-aktivierten Protein-Kinase (PKR) 23. PKR gehört zur Familie der eukaryontischen Translationsinitiationsfaktors 2 Alpha (eIF2a)-Kinasen und ist aus einem N-terminalen Doppelstrang-RNA-Bindungsdomäne und einer C-terminalen Kinase-Domäne zusammengesetzt. Die Kinasedomäne bildet die Dimerisierung wichtig für PKR-Aktivierung und führt die katalytische Funktion des Proteins. Die Bindung von PKR, um virale dsRNA führt zu dessen Konformationsänderung ermöglicht die Dimerisierung und Auto-Phosphorylierung an Thr 446 unter anderem Rückstände. PKR vermittelt dann die Phosphorylierung von eIF2a, wodurch die Translation viraler mRNAs 23-27 blockieren. Sowohl RIG-I und PKR unterziehen großen strukturellen Umlagerungen, bilden oligomere Komplexe und posttranslational durch Phosphorylierung / Dephosphorylierung und Ubiquitinierung 10,11,19,23,24,26-29 modifiziert. Für ein besseres Verständnis von der viralen RNA-Strukturen Aktivierung RIG-I und PKR (und in welchem ​​Stadium viralen Antagonisten könnte be stören), ist es wichtig, den Aktivierungszustand genau zu bestimmen. Für beide KFVs wurde zuvor beschrieben, dass die Aktivierung führt zur Entstehung von Trypsin-resistenten Proteinfragmente 6,17,30 und Oligomeren höherer Ordnung 6,18,19. Doch angesichts der Fülle von Literatur über diese Schlüsselfaktoren der Reaktion der antiviralen Wirts 1,2,24, Anwendung der direkten Methoden scheint vergleichsweise selten. In der Hoffnung auf anregende breitere Nutzung, bieten wir bequeme und sensible Protokolle robust analysieren die Aktivierungszustände von RIG-I und PKR. Die IFN zuständigen menschlichen Zelllinie A549 ist mit einem etablierten Aktivator von RIG-I und PKR, der gedämpft Rift-Valley-Fieber-Virus-Mutante Klon 13 (Cl 13) 31,32 infiziert. Nach einer einfachen Lyseverfahren sind die Extrakte aus infizierten Zellen durch Trypsin-Verdauung begrenzt / Western-Blot-Analyse getestet, um Konformationsänderungen Schalt bewerten und durch blaue nativen Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) / Western Blot analysist, um die Bildung von Oligomeren zu messen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td class="xl66" height="43" style="height:32.25pt;width:60pt" width="80">Name</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Company</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Catalog Number</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">cell culture</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">21969-035</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">OptiMEM</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">31985-47</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">L-glutamine</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25030-024</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl72" height="61" style="height:45.75pt;width:60pt" width="80">penicillin-streptomycin</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">15070-063</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl73" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">fetal calf serum (FCS)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">10270</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25300-054</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">chemicals</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="190" style="height:142.5pt">
			<td class="xl73" height="190" style="height:142.5pt;width:60pt" width="80">L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">T1426</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">antibodies</td>
			<td class="xl78" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td>
			<td class="xl74" style="width:60pt" width="80">Enzo Life Sciences</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">ALX-804-849-C100</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-PKR (B10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-6282</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Epitomics</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">1120-1</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">rabbit polyclonal anti-IRF-3</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-9082</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">IBL</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">og-413</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="126" style="height:94.5pt">
			<td class="xl81" height="211" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 height:158.25pt;border-top:none;width:60pt" width="80">rabbit anti-RVFV hyperimmune serum &#34;C2&#34; (MP-12)</td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl75" style="width:60pt" width="80">Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA)</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl65" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Cell Signalling</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">3700</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">0031460 1892914</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl64" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">0031430 1892913</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page

Wirtsabwehr Virus-Infektion sind abhängig von einer schnellen Erkennung von Mustererkennungsrezeptoren (PRR) des angeborenen Immunsystems. Im Zytoplasma PRRS RIG-I und PKR binden an spezifische virale RNA-Liganden. Dies vermittelt ersten Konformationsänderung Schalt-und Oligomerisierung, und dann können die Aktivierung eines antiviralen Interferon-Antwort. Während Methoden zur antiviralen Wirts Genexpression zu messen sind gut etabliert, Methoden, um die Aktivierungszustände von RIG-I und PKR direkt zu überwachen sind nur teilweise und weniger gut etabliert. Hier beschreiben wir zwei Methoden, um RIG-I und PKR Stimulation bei der Infektion mit einem etablierten Interferon-Induktor, der Rift-Valley-Fieber-Virus-Mutante Klon 13 (Cl 13) zu überwachen. Begrenzte Trypsin Verdauung ermöglicht Änderungen der Proteaseempfindlichkeit zu analysieren, was auf Konformationsänderungen des PRRS. Trypsin Verdauung von Lysaten aus mock-infizierten Zellen führt zu einem schnellen Abbau von RIG-I und PKR, whereas Cl 13 Infektion führt zu der Entstehung eines Protease-resistenten RIG-I-Fragment. PKR auch eine Virus-induzierte Teilwiderstand Trypsin Verdauung, die mit ihrem Stempel Phosphorylierung an Thr 446 zusammenfällt. Die Bildung von RIG-I und PKR Oligomere wurde durch native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) bestätigt. Bei Infektion, gibt es eine starke Anhäufung von RIG-I und PKR oligomeren Komplexen, während diese Proteine ​​blieb als Monomere in mock infizierten Proben. Begrenzte Proteaseverdau und native PAGE, sowohl für Western-Blot-Analyse gekoppelt sind, erlauben eine sensible und direkte Messung von zwei verschiedenen Schritte des RIG-I und PKR-Aktivierung. Diese Techniken sind relativ einfach und schnell durchzuführen und keine teure Ausrüstung.

Die Anerkennung eines viralen Agonist von RIG-I oder PKR Konformationsänderung löst Schalt 6,17,30 und Oligomerisierung 6,18,27. Wir haben untersucht, diese beiden Aktivierungsmarker durch begrenzte Protease-Verdau und native Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) auf. Humanen A549-Zellen wurden mit Rift-Valley-Fieber-Virus-Klon 13 (Cl 13), die durch eine Mutation des IFN-Antagonisten 35,36 NSs dadurch infiziert ist. Aufgrund der Abwesenheit von Funktions NS...

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Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

Angeborene Abwehr von Virus-Infektionen werden durch Mustererkennungsrezeptoren (PRR) ausgelöst. Die beiden zytoplasmatischen PRRs RIG-I und PKR binden an viralen RNAs Unterschrift, ändern Konformation oligomerisieren, und aktivieren antivirale Signalisierung. Es werden Methoden beschrieben, die um die Konformationsänderungen Schalten und die Oligomerisierung dieser zytoplasmatischen PRRs bequem überwachen.

Überwachung Aktivierung der antiviralen Pattern Recognition Receptors RIG-I und PKR durch begrenzte Protease Verdauung und Native PAGE

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K Aufrufe.  Philipps-University Marburg.  Angeborene Abwehr von Virus-Infektionen werden durch Mustererkennungsrezeptoren (PRR) ausgelöst. Die beiden zytoplasmatischen PRRs RIG-I und PKR binden an viralen RNAs Unterschrift, ändern Konformation oligomerisieren, und aktivieren antivirale Signalisierung. Es werden Methoden beschrieben, die um die Konformationsänderungen Schalten und die Oligomerisierung dieser zytoplasmatischen PRRs bequem überwachen. 

Serie: Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In genetically predisposed individuals, tTG2 triggers autoimmune responses that are characterized by the production of tTG2 antibodies and their direct deposition into small intestinal wall 1,2. The presence of such antibodies constitutes one of the major hallmarks of the celiac disease (CD). Epidermal transglutaminase (eTG) is another member of the transglutaminase family that can also function as an autoantigen in a small minority of CD patients. In these relatively rare cases, eTG triggers an autoimmune reaction (a skin rash) clinically known as dermatitis herpetiformis (DH). Although the exact mechanism of CD and DH pathogenesis is not well understood, it is known that tTG2 and eTG share antigenic epitopes that can be recognized by serum antibodies from both CD and DH patients 3,4.
In this study, the confocal microscopy examination of biopsy samples from skin lesions of two rhesus macaques (Macaca mulatta) with dermatitis (Table 1, Fig. 1 and 2) was used to study the affected tissues. In one animal (EM96) a spectral overlap of IgA and tTG2 antibodies (Fig. 3) was demonstrated. The presence of double-positive tTG2+IgA+ cells was focused in the deep epidermis, around the dermal papillae. This is consistent with lesions described in DH patients 3. When EM96 was placed on a gluten-free diet, the dermatitis, as well as tTG2+IgA+ deposits disappeared and were no longer detectable (Figs. 1-3). Dermatitis reappeared however, based on re-introduction of dietary gluten in EM96 (not shown). In other macaques including animal with unrelated dermatitis, the tTG2+IgA+ deposits were not detected. Gluten-free diet-dependent remission of dermatitis in EM96 together with presence of tTG2+IgA+ cells in its skin suggest an autoimmune, DH-like mechanism for the development of this condition. This is the first report of DH-like dermatitis in any non-human primate.

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Dermatitis herpetiformis (DH) is a chronic inflammatory condition characterized by an autoimmune reaction between IgA and epidermal transglutaminase (eTG). DH develops in a very small portion of gluten-sensitive and/or celiac patients. The results of this study indicate that DH can also develop in a rhesus monkey host with symptoms of idiopatic dermatitis.

Die Anerkennung der Epidermal Transglutaminase von IgA und Tissue Transglutaminase 2 Antikörper in einem seltenen Fall von Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Immunfluoreszenz, um die zelluläre Aufnahme von menschlichem Lactoferrin und die damit verbundenen antivirale Aktivität gegen das Hepatitis C Virus-Monitor

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur und Mustererkennung Rezeptor-Stimulation von Maus-Darm-Organoide

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generieren<em&gt; De Novo</em&gt; Antigen-spezifische Zellrezeptoren humanen T von Retrovirale Transduktion von Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Co-Immunopräzipitation Test zur Untersuchung funktionalen Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Verdauung der murinen Leber für eine durchflusszytometrischen Analyse der lymphatische Endothelial Zellen

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Konfokale Abbildung von Double-Stranded RNA und Muster Anerkennung Rezeptoren im negativen Sinn-RNA-Virusinfektion

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

Bildverarbeitungs-Protokoll für die Analyse der Diffusion und Cluster-Größe von Membranrezeptoren durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...