Dieses Protokoll bietet zwei Methoden, um C.Elegans zu mobilisieren, um in vivo Kalzium-Bildgebung der Körperwandmuskeln durchzuführen. Diese Methode kann helfen, Fragen im Zusammenhang mit Kalziumhomöostase und Kalziumhandhabung zu beantworten, und eine zugängliche Synapse in genetisch beweglichen Organismen. Diese Technik kann ein besseres Verständnis der Mechanismen zur Regulierung der Muskelkalziumhomöostase bieten und kann daher wichtig sein, um Bedingungen oder molekulare Wege zu identifizieren, die die Anregungskontraktion sondieren, die durch die Fehlregulation des Kalziumkreislaufs beeinflusst werden.
Diese Methoden können Einblicke in Forschungsbereiche geben, einschließlich, aber nicht auch, Neurobiologie, Entwicklungsbiologie und Zellbiologie. Diese Techniken könnten angepasst werden, um eine Vielzahl von Zelltypen und C.elegans, andere verwandte Nematoden sowie Filsafatlarven zu untersuchen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, damit der Experimentator die Seziertechnik verstehen und Kalziumtransienten von richtig immobilisierten Tieren genau einschätzen kann.
Beginnen Sie mit der Einrichtung des Mikroskops für die Fluoreszenz-Bildgebung. Verwenden Sie eine wissenschaftliche CMOS-Kamera, die in der Lage ist, eine Vollbildgebung mit 100 Hertz zu erstellen, um schnelle Veränderungen des Kalziumspiegels zu verfolgen. Steuern Sie die Kameraaufnahme und LED-Fluoreszenzanregung mit einer Micromanager-Software, die in ImageJ läuft.
Verwenden Sie ein Open-Source-Plug-In für elektronische Plattformen, das mit einem externen Open-Source-Mikrocontroller-Board verbunden ist, um die externen Timing-Impulse zu verwalten, die fluoreszierende Anregungen steuern. Um die Timing-Logik zu steuern, aktivieren Sie das Micromanager-Erfassungsprotokoll in der Software gemäß Herstelleranleitung. Verwenden Sie zwei LEDs, um Kanal Rhodopsin mit blauem Licht zu stimulieren und RCaMP-Änderungen aufzuzeichnen.
Aktivieren Sie Kanal rhodopsin mit am LED mit der Spitzeneintrittswellenlänge von 470 Nanometern und einem Bandpassfilter und begeistern Sie RCaMP mit einer LED mit einer Spitzeneintrittswellenlänge von 594 Nanometern und einem Bandpassfilter. Beleuchten Sie beide LEDs und übertragen Sie das Licht mit einem dichroitischen Strahlkombinator auf denselben optischen Pfad. Steuern Sie das Timing der LED-Beleuchtung mit einem Solid-State-Schalter, der von TTL-Signalen nach Manuskriptrichtungen gesteuert wird, und stellen Sie die LED-Intensität mit den stromgesteuerten Lastrauschen-Linearnetzteilen ein, und programmieren Sie dann das Blaulichtsimulationsprotokoll in einen Simulator.
Schalten Sie in diesem Experiment die Blaulichtsimulation nach zwei Sekunden nur rCaMP-Fluoreszenz ein und verwenden Sie einen Zug von fünf, zwei Millisekunden blauen Lichtimpulsen mit 50 Millisekunden-Intervallen, um Kanal rhodopsin zu aktivieren. Wenn Sie das Dissektionspräparat verwenden, führen Sie C.elegans-Sektion bei schwachem Licht durch. Legen Sie die Tiere in die Sezierschale mit der silikonbeschichteten Deckslipbasis, die mit einer ein Millimole Calcium extrazelluläre Lösung gefüllt ist, die nach Manuskriptanweisungen zubereitet wird.
Kleben Sie die Tiere mit dem flüssigen topischen Hautkleber mit blauer Färbung entlang der dorsalen Seite des Wurms. Und machen Sie einen seitlichen Cuticle-Inzission entlang der Leim- und Wurmschnittstelle mit Glasnadeln. Verwenden Sie eine Mundpipette, um die innere Eingeweide aus der Wurmhöhle zu löschen, und kleben Sie dann die Nagelhautklappe des Tieres herunter, um die ventralen medialen Körperwandmuskeln für die Bildgebung freizulegen.
Bei Verwendung der Nano-Perlen-Präparation eine geschmolzene 5%Agra-Lösung mit destilliertem Wasser bis zu einem Endvolumen von 100 Millilitern herstellen. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um einen Tropfen geschmolzener-Agra-Lösung auf eine Glasrutsche zu legen und sofort eine zweite Glasrutsche über die Oberseite zu legen, indem Sie sanft enden, um ein gleichmäßiges Agra-Pad zu erzeugen. Entfernen Sie den oberen Schlitten und bei etwa vier Mikroliter Polystyrol Nano-Perlen in der Mitte des Pads.
Fügen Sie bei schwachem Licht vier bis sechs C.elegans in die Nano-Perlen-Lösung ein, um sicherzustellen, dass die Tiere nicht übereinander liegen, und legen Sie vorsichtig einen Deckelschlappe darüber. Wenn Sie bereit zum Abbild sind, legen Sie die vorbereitete Dia- oder Sezierschale auf das Mikroskop und finden und fokussieren Sie sich auf einen Wurm mit 10-facher Vergrößerung und abheller Heller Feldbeleuchtung. Wechseln Sie zur 60-fachen Vergrößerung in RCaMP-Fluoreszenzanregung, um einen ventrum medialen Körperwandmuskel zu identifizieren, der vor der Vulva und in der richtigen Stimmebene liegt.
Ändern Sie dann den Bildweg vom Okular zur Kamera, indem Sie den Umschalter herausziehen und live in der Datenerfassungssoftware klicken. Klicken Sie in der Datenerfassungssoftware auf die Schaltfläche ORI, und erstellen Sie ein Feld um den Muskel, auf den sich konzentriert wird. Schalten Sie auf dem Stimulator den zuvor programmierten Blaulichtstimulationsweg ein, und klicken Sie dann auf Die Bildverarbeitungssoftware übernehmen, um das Bild zu erfassen.
Wenn C.elegans auf All-Trans-Retina angebaut werden, erfolgreich Retinal und Aktivierung des Kanals Rhodopsin, ein Calcium transient kann evoziert werden. Wenn Tiere nicht alltransretinal ausgesetzt sind, wird kein Muskelkalziumtransient ausgelöst. Dieses Protokoll wurde verwendet, um den Verlust von Funktions-Sca-1-Mutanten zu untersuchen, die sich auf die sarkoplasmische Retikulum-Calciumpumpe auswirken, die durch das sca-1-Gen kodiert ist.
Aber, die Sezierpräparation Erhöhungen der Ausgangswerte der RCaMP Fluoreszenz wurden in der Mutant im Vergleich zur Kontrolle beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Mutation die erhöhten Konzentrationen von ruhendem zytoplasmatischem Kalzium benötigt. Es gab einen signifikanten Rückgang der Spitzenkalziumspiegel in den Sca-1 Mutanten im Vergleich zur Kontrolle. In der anstiegen Spitzenzeit oder der halben Zerfallszeit gab es jedoch keine Veränderung.
Wichtig ist, dass ähnliche Ergebnisse mit der weniger technisch anspruchsvollen Nano-Perlen-Präparation beobachtet werden können. Der Verlust von Funktionsslomutanten, die die kalziumaktivierten großen Kaliumkanäle stören, wurde untersucht, um Mutanten zu untersuchen, die sich indirekt auf die Kalziumbehandlung in C.elegans auswirken. Bei der Messung der Ausgangswerte von RCaMP zeigten die Mutanten eine erhöhte Fluoreszenz im Vergleich zu den Kontrollen.
Bei der Auswertung der Kinetik des Kalziumtransienten wurden keine Veränderungen der Kalziumspitzenwerte beobachtet. Die Slo-1(eg142)mutants wiesen jedoch einen deutlich erhöhten Anstieg bis zur Spitzenzeit auf. Der wichtigste Schritt, den Sie sich beim Abschluss des Verfahrens merken sollten, ist die Bereite Versuchstiere in All-Trans-Retinal.
Ohne diesen Schritt wird der Kanal Rhodopsin inaktiv sein, wodurch verhindert wird, dass lichtinduzierte Kalziumtransienten ausgelöst werden. Nach diesem Verfahren können Elektrophysiologie und Verhaltensanalyse durchgeführt werden, um die funktionellen Auswirkungen der beobachteten Veränderungen der Calciumhomöostase zu bewerten. Mit den hier beschriebenen Immobilisierungsmethoden ebnet der Weg für die weitere Erforschung der Kalziumdynamik und zeigt, dass vergleichbare Ergebnisse als Reaktion auf die optogenetische neuronale Stimulation und Erfassung von Muskelkalziumtransienten mit der weit weniger anspruchsvollen Immobilisierungstechnik der Perle beobachtet werden können.
