In vivo FPOP Protein-Protein-Wechselwirkungen und Proteinstrukturveränderungen bei C-Eleganen. Diese Tiere sind weit verbreitet als Modellsystem zur Untersuchung menschlicher Krankheiten. Durch die Kopplung von in vivo FPOP an die Massenspektrometrie können wir Protein-Protein-Wechselwirkungen in verschiedenen Zell- und Körperkompartimenten in einem lebenden Tier untersuchen, ohne ein bestimmtes Protein isolieren zu müssen.
Beginnen Sie die Fließsystembaugruppe, indem Sie ein zwei Zentimeter großes Stück fluoriertes Ethylenpropylen oder FPP-Schläuche schneiden. Verwenden Sie eine saubere Seznadel, um den Innendurchmesser an einem Ende der Schläuche zu verbreitern, wodurch ein kleiner Krater mit einer Länge von etwa 15 Millimetern entsteht. Um die infundierten Linien des Strömungssystems zu erstellen, schneiden Sie auf 15 Zentimeter Stücke von 250 Mikrometer Innendurchmesser geschmolzenkieselsäure mit einem Keramikschneider.
Und kleben Sie die beiden Kapillaren zusammen mit selbstklebendem Klebeband, um sicherzustellen, dass die Enden 100% gespült werden. Setzen Sie die beiden Kapillaren in den Krater der FPP-Schläuche ein und schieben Sie sie bis an den Rand. Legen Sie einen kleinen Punkt Epoxidharz auf eine saubere Oberfläche und mischen Sie ihn mit der Sezierender Nadel.
Verwenden Sie die gleiche Nadel, um schnell einen kleinen Tropfen des Harzes am Ende der infundierten Kapillaren zu platzieren, wo sie mit dem FPP-Schlauch verbinden, lassen Sie das Harz austreten Seite für ein paar Minuten trocknen. In der Zwischenzeit schneiden Sie eine neue 250 Mikrometer Innendurchmesser Kapillare, die die Auslasskapillare des Strömungssystems werden. Sobald das Harz getrocknet ist, legen Sie die neue Kapillare an das FPP-Schlauchauslassende ein.
Die inneren Enden der Auslasskapillare und die beiden infundierten Kapillaren sollten bündig gegeneinander sein, wodurch der Mischtee entsteht. Binden Sie an die Kapillar- und FPP-Schläuche mit frischem Epoxidharz, wie zuvor beschrieben, und lassen Sie das Strömungssystem über Nacht trocknen. Legen Sie vier magnetische Rührwerke in eine Fünf-Milliliter-Spritze ein, die verhindert, dass sich Würmer während der in vivo schnellen photochemischen Oxidation von Proteinen oder in vivo FPOP in dieser Spritze niederlassen.
Füllen Sie diese und eine zusätzliche Fünf-Milliliter-Spritze mit M9, um zu vermeiden, Blasen zu erzeugen. Schließen Sie einen unteren Adapter an jede Spritze an, um sicherzustellen, dass sie an der Stelle des Fingers fest und gesichert sind. Befestigen Sie dann jede Spritze am mittleren Anschluss eines einzelnen Dreiventils.
Befestigen Sie jede Spritze an der Doppelspritzenpumpe, und passen Sie die mechanische Farbe an, um einen Überdruck aus dem Schubblock zu verhindern. Verwenden Sie eine Superflanschliste, nicht FEP-Hülle und Superflansch-Listenvariable, um jedes infundierte Kapillarende des zuvor hergestellten mikrofluidischen Systems an den oberen Anschluss jedes Drei-Zwei-Ventils zu befestigen. Schließlich befestigen Sie eine Kapillare mit einem Innerendurchmesser von 10 Zentimetern 450 Mikrometer am unteren Anschluss des Ventils, das als Entnahmemusterkapillare dient.
Starten Sie den Pumpenstrom und überprüfen Sie visuell alle Anschlüsse auf Leckagen. Durchfluss von mindestens drei Spritzenvolumen mit der experimentellen Durchflussrate. Der Fließweg wird durch die Pfeile am Drei-Zwei-Ventilgriff markiert, und jede Spritze kann manuell nachgefüllt werden, indem der Ventilgriff von der Ausglaugung in die Rückzugsposition bewegt wird.
Nach der Inspektion des mikrofluidischen Strömungssystems auf die Versuchsbank bewegen und die Auslasskapillare mit einer Edelstahl-Union zur Strahlungsstufe sichern. Verwenden Sie ein lang erreichendes Feuerzeug, um die Beschichtung des geschmolzenen Kieselsäures am Laserbestrahlungsfenster zu verbrennen und die verbrannte Beschichtung mit Fusselgewebe und Methanol zu reinigen. Positionieren Sie den magnetischen Rührblock über der Spritze mit den Magnetischen Rührungen und stellen Sie die Geschwindigkeit so ein, dass sich die Rührwerke langsam und konstant drehen.
Schalten Sie den Krypton Fluorid-Excimer-Laser ein und lassen Sie die Schilddrüse tron aufwärmen. Messen Sie die Laserenergie bei einer Frequenz von 50 Hertz für mindestens 100 Impulse, indem Sie den optischen Sensor am Strahlausgangsfenster platzieren. Ziehen Sie manuell ca. 10.000 Würmer in einem Volumen von 500 Mikrolitern in die Probenspritze.
Dann füllen Sie es mit 2,5 Milliliter des M9-Puffers, um Luftblasen zu vermeiden. Es ist wichtig, eine Stichprobengröße von mindestens 10.000 Würmern zu haben. Eine geringere Stichprobengröße führt zu einem geringen Proteinertrag für die nachgelagerte proteomische Analyse.
Füllen Sie die zweite Spritze mit drei Millilitern 200 Millimolar Wasserstoffperoxid. Am Ende der Auslasskapillare ein 15 Milliliter konisches Rohr mit sechs Millilitern 40 Millimolaren DMTU, 40 Millimolar PBN und 1%mal Apfelsauceoxid aufstellen. Starten Sie den Excimer-Laser aus dem Softwarefenster, warten Sie auf den ersten Impuls und starten Sie den Probenfluss von der Doppelspritze.
Sammeln Sie die gesamte Probe in der 15-Milliliter-Röhre, während Sie aktiv den Probenfluss auf visuelle Lecks überwachen. Nach in vivo FPOP die Würmer durch Zentrifugieren bei 805 mal g für zwei Minuten pellet. Aspirieren Sie die Quench-Lösung und fügen Sie 250 Mikroliter lizenzierten Puffer hinzu.
Die Probe in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr geben, blitzen und bei negativen 80 Grad Celsius bis zur Probenverdauung lagern. Die Wurmregeneration wurde nach in vivo FPOP mit Kapillaren mit zwei unterschiedlichen Innendurchmessern verglichen. Bei Verwendung einer Kapillare mit 250 Mikrometern Innendurchmesser wurde eine Gesamtprobenrückgewinnung zwischen 63 und 89 % über zwei biologische Repliken hinweg erreicht.
Die Verwendung einer Kapillare mit 150 Mikrometern Innendurchmesser führte nur zu einer Rückgewinnung von 21 bis 31 %. Die Verwendung einer größeren Kapillare mit größerem Innendurchmesser führt zu einem besseren Wurmfluss während in vivo FPOP, die kleinere Kapillare lässt keinen einzelnen Wurmfluss zu, und mehrere Würmer werden am Laserstrahlungsfenster zusammenfließen gesehen, was die Laserbelichtung pro Wurm verringert. Repräsentativ extrahierte Ionenchromatogramme eines FPOP modifizierten und unveränderten Peptids zeigten, dass das Hydroxylradikal die Chemie oxidativ modifizierter Peptide verändert, wodurch sie polarer werden.
In der Reverse-Phase-Chromatographie haben in vivo FPOP-modifizierte Peptide frühere Retentionszeiten als unveränderte Peptide. MS-Fragmentierung isolierter Peptide ermöglicht die Identifizierung oxidativ modifizierter Rückstände. In vivo FPOP hat insgesamt 545 Proteine in zwei biologischen Replikationen innerhalb von C-Eleganen oxidativ modifiziert.
Ein Vorteil dieser Protein-Footprinting-Methode ist ihre Fähigkeit, Proteine in einer Vielzahl von Körpersystemen innerhalb der Würmer zu modifizieren. Die Tandem-MS-Analyse bestätigt die In-vivo-FPOP-Sonde Lösemittel-Zugänglichkeit in vivo. Das Oxidationsmuster des Hitzeschockproteins 90 im Komplex mit dem Myosin-Chaperon-Protein UNC 45 wurde analysiert und vier oxidativ modifizierte Rückstände gefunden.
Die Verwendung von C-Eleganen für in vivo FPOP bietet das Potenzial, die Rolle von Protein-Protein-Wechselwirkungen und Proteinstruktur bei der Krankheitspathogenese zu untersuchen.
