Die Methode ermöglicht es uns, integrierte Amyloid-Proteinstrukturen klar von den löslichen und sogar akkumulierten Gegenstücken zu unterscheiden. Die Technik wird in vivo in einer nichtinvasiven Weise mit wenig oder gar keinen toxischen Nebenwirkungen durchgeführt. Da es von den fluoreszierenden Eigenschaften des Fluorophors selbst abhängt, ist es sehr robust und im Laufe der Zeit reproduzierbar.
FLIM wurde im Bereich der Krebsdiagnose eingesetzt. Wir verwenden es jedoch, um die grundlegenden Mechanismen der Proteinaggregation zu untersuchen, die in der Tat für neurodegenerative Erkrankungen relevant sind. Die Methodik kann im Bereich der Proteinaggregation eingesetzt werden.
Solange das mit der Krankheit verbundene Protein mit einer fluoreszierenden Sonde markiert ist, kann es im Laufe der Zeit verfolgt und überwacht werden. Verbindungen und Strategien, die eine Aggregation fördern oder verhindern, können erfolgreich untersucht werden. Jedes biologische System, das eine Visualisierung durch Lichtmikroskopie ermöglicht, eignet sich für FLIM entweder in vivo oder ex vivo, z.B. in der Zellkultur, in fixierten oder permeabilisierten Proben und in jedem erforderlichen Medium.
Achten Sie darauf, die Eigenschaften Ihres ausgewählten Fluorophors innerhalb der Nematode zu testen, bevor Sie experimentelle Daten erhalten, und testen Sie, ob das Setup voll funktionsfähig ist, bevor Sie Messungen erfassen. Beginnen, wachsen und halten Nematoden bei 20 Grad Celsius auf NGM-Platten. Altern Sie die Nematoden bis zum vierten Tag des Lebens als die jungen Erwachsenen und Tag acht des Lebens als die alten Erwachsenen.
Beginnen Sie am Tag der Bildgebung mit der Vorbereitung der Bilddias. Agabarose und doppelt destilliertes Wasser mit einer Konzentration von 3% Volumen aufstellen. Übertragen Sie es in eine Mikrowelle, um zu schmelzen und lassen Sie es dann leicht abkühlen.
Schneiden Sie die Spitze einer ein Milliliter Pipette Spitze und nehmen Sie etwa 200 Mikroliter der geschmolzenen Agarose. Pipette die Agarose auf eine saubere Glasrutsche und sofort eine zweite auf die Oberseite, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Lassen Sie die Dias trocknen und entfernen Sie vorsichtig die obere Glasrutsche.
Das Ergebnis ist ein Glasschlitten mit einer gleichmäßigen Agarose-Oberfläche, auf der die Nematoden positioniert werden. Sobald das bildgebende Setup einsatzbereit ist und unter einem Stereomikroskop arbeitet, legen Sie einen 10-Mikroliter-Tropfen Anästhetika auf ein Agarose-Pad und übertragen Sie vorsichtig fünf bis zehn Nematoden hinein. Verwenden Sie eine Wimpernspitze, um die Nematoden zu trennen.
Halten Sie sie dicht beieinander, aber nicht berührend, um eine einfachere Lokalisierung der Nematoden während der Bildaufnahme zu ermöglichen. Überlagern Sie die Nematoden vorsichtig mit einem Deckelschlupf. Nehmen Sie innerhalb einer Stunde nach der Montage Messungen vor.
Stellen Sie sicher, dass die Nematoden völlig unbeweglich sind. Öffnen Sie die FLIM-Erfassungssoftware. Suchen Sie die Tab-Taste und drücken Sie die Aktivierungsausgänge.
Platzieren Sie das Dia mit den montierten C.elegans auf der Bühne und verwenden Sie eine 10-fache Vergrößerungslinse im Übertragungsmodus, lokalisieren Sie die Position der Nematoden auf dem Dia. Entfernen Sie den Schlitten, schalten Sie das Objektiv auf eine 63X Vergrößerungslinse um, und wenden Sie das erforderliche Tauchmedium an. Platzieren Sie die Folie auf der Bühne und lokalisieren Sie die Nematoden.
Starten Sie das Scannen des Beispiels. Wählen Sie eine Region aus, die von Interesse ist, und konzentrieren Sie sich auf die maximale Projektionsebene. Zeigen Sie auf der Schnittstelle der FLIM-Software eine Vorschau der Anzahl der erkannten Photonen an.
Der ADC-Wert sollte zwischen einem Mal 10 bis dem vierten und ein mal 10 bis fünf liegen. Verschieben Sie bei Bedarf den Fokus auf eine andere Ebene oder erhöhen Sie die Laserleistung, um mehr Photonen zu sammeln. Stellen Sie sicher, dass Sie Photonenhaufen vermeiden, aber eine ausreichende Menge an Photonen sammeln, um eine gute Lebensdauer Passform und Messung zu schaffen.
Wählen Sie in der Menüleiste die Registerkarte aus, um die Erfassungsparameter festzulegen. Wählen Sie Scan-Synchronisierung ein, um eine einzelne Photonenerkennung zu ermöglichen. Legen Sie die Erfassung auf eine feste Zeit oder eine feste Anzahl von Photonen fest.
Drücken Sie den Start der Erfassung. Öffnen Sie die Software und importieren Sie FLIM-Datendateien per Datei, laden Sie FLIM-Daten. Laden Sie alle Proben aus einer Bedingung, auch wenn sie in verschiedenen Sitzungen und aus verschiedenen biologischen Wiederholungen erhalten werden.
Ggf. Segment, um Nematoden für viele FLIM-Bilder über Segmentierung zu signalisieren, Segmentierungsmanager. Ziehen Sie das Zuschneidewerkzeug um den Interessenbereich, bis es hervorgehoben wird. Sobald Sie fertig sind, drücken Sie OK. Wählen Sie einen kleinen Bereich aus, in dem das intensitätsbasierte Bild eines C.elegans angezeigt wird.
Die Zerfallskurve dieses Bereichs wird im großen Zerfallsfenster auf der rechten Seite der Schnittstelle angezeigt. Um die Lebensdauer zu extrapolieren, legen Sie auf der Registerkarte Daten einen beliebigen integrierten Mindestwert zwischen 40 und 300 fest, um Pixel auszuschließen, die zu wenig sind, um eine gute Passform zu erzeugen. Wählen Sie ein Zeitminimum und eine maximale Zeitzahl aus, um das FLIM-Signal auf diese Werte zu beschränken.
Ändern Sie nicht die voreingestellten Zahlen Photon von einem. Geben Sie die Wiederholungsrate in Megahertz des Lasers ein, der während der Erfassung verwendet wird. Geben Sie einen Gate-Max-Wert ein, um alle gesättigten Pixel auszuschließen.
Wählen Sie auf der Registerkarte Lebensdauer ein globales Fitting aus, das verwendet werden soll. Ändern Sie keinen anderen Parameter außer der Anzahl der exponentiellen Selektion, wenn bekannt ist, dass der gewählte Fluoreszenzzerfall multiexponentiell ist und mehr als eine Lebensdauer aufweist. Laden Sie den IRF über das IRF-Menü hoch.
Um die IRF-Verschiebung zu schätzen, wählen Sie IRF, iRF-Verschiebung. Ein Satz von Werten wird automatisch auf der Registerkarte IRF angezeigt. Sobald dies eingerichtet ist, ändern Sie keine anderen Parameter dieser Registerkarte.
Sobald alle Parameter festgelegt sind, drücken Sie den Anpassungsdatensatz. Die resultierende Anpassung, die in einer blauen Linie hervorgehoben wird, sollte sich mit allen Ereignissen überlappen. Eine gute Passform wird erhalten, wenn alle Ereignisse entlang der Passform ausgerichtet sind.
Klicken Sie auf die Registerkarte Parameter in den oberen rechten Menüs der Software-Schnittstelle, und wählen Sie die Statistik, den gewichteten Mittelwert, und überprüfen Sie, ob der Chi-Quadratwert so nah wie möglich an einem ist. Der Lebensdauerwert des ausgewählten Bildes wird somit als Tau 1 offenbart. Exportieren Sie alle Informationen von Interesse durch Datei, ExportIntensität Bilder, passen Ergebnistabelle, Bilder, Histogramme.
Repräsentative Karten von C.elegans, die muskulöse Q40 RFP am vierten oder achten Tag des Lebens ausdrücken, werden hier gezeigt. Die längere Q-Strecke des IQ85 war anfälliger für Aggregation und zeigte bereits am vierten Tag des Lebens eine Fluoreszenz-Lebensdauerverschiebung im Histogramm. Tatsächlich wurde am vierten Tag die Foci-Bildung für IQ85 beobachtet, während es in IQ44 noch fehlte.
Nach dem Altern zeigte IQ44 aber auch eine Foci-Bildung und damit eine reduzierte Fluoreszenzlebensdauer. Schließlich wurde die Foci-Bildung weder nachgewiesen noch die Fluoreszenzlebensdauer im NQ40CFP-Stamm verringert. Für diese Sorte gab es nur subtile nicht signifikante Veränderungen der mittleren Fluoreszenzlebensdauer nach alterung.
Sobald das Nematodenmodell etabliert ist, ist die Menge des gesammelten Photons von größter Bedeutung, um eine gute Lebenslange Passform zu erhalten. Das Verfahren kann weiter mit verschiedenen Techniken wie Forster-Resonanzenergieübertragung, FRET, Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichmittel, FRAP oder Messung verbunden werden. Alle diese Anpassungen liefern zusätzliche Informationen über die Eigenschaften der Proteinstudien und ihre aggregierte Form.
Im Bereich der Proteinaggregation und Proteinhomöostase erlaubte die Technik die Untersuchung jeglicher Störungen, die dem System auferlegt wurden, die Verteilung verschiedener Proteinarten und den Handel und im Allgemeinen die Unterschiede und Bedeutung von löslichen und unlöslichen Proteinfraktionen innerhalb des lebenden Organismus. Das Anästhetikum Natriumazid ist giftig und sollte mit Handschuhen und Schutzbrille niert und unter einer Dunstabzugshaube verdünnt werden. Da die Technik auf Mikroskopie basiert, ist es wichtig, alle Warnungen im Zusammenhang mit der Arbeit mit Lasern zu befolgen.
