Unter den verschiedenen Strategien zur Produktion von rekombinantem Protein in Pflanzen bietet die dekonstruierte pflanzliche VERS-Expression eine überlegene Leistung, die über einen relativ kurzen Zeitraum zu hohen Erträgen führt. Die Replikation dieser Technologie für die Herstellung eines oralen Impfstoffs birgt ein großes Potenzial, in naher Zukunft zu einer Alternative zu herkömmlichen Impfstoffen zu werden. Lyophilisierte Rote Rübenblätter, die vorübergehend transformiert werden, akkumulieren eine Menge an Photoantigenen, die für die orale Toleranzinduktion bei der Diabetesprävention Typ 1 geeignet sind.
Dieses experimentelle Protokoll könnte nach einer Fall-zu-Fall-Bewertung der rekombinanten Proteinakkumulation auf viele verschiedene essbare Arten ausgedehnt werden. Die Demonstration des Verfahrens wird Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo und Roberta Zampieri sein. Um dieses Verfahren zu beginnen, wachsen Rote Rüben und Spinatpflanzen in einer Wachstumskammer, wie im Textprotokoll beschrieben.
Nach der Samenkeimung die Pflanzen zweimal pro Woche mit einer Lösung aus handelsüblichem Dünger in einer Konzentration von einem Gramm pro Liter düngen. Für die Agroinfiltration fünf Wochen alten Spinat und sechs Wochen alte Rote-Bete-Pflanzen verwenden. Nach dem Aufbau der Pflanzenexpressionsvektoren impfen Sie die drei A.tumefaciens-Transformationsmittel in 50 MilliliterLB-Medium, das Rifampicin in einer Konzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter und vektorspezifische Antibiotika enthält, wie im Textprotokoll beschrieben.
Wachsen Sie durch Schütteln über Nacht bei 28 Grad Celsius. Am nächsten Tag pellet die Bakterienkulturen durch Zentrifugieren bei 4500 mal G für 20 Minuten. Setzen Sie das Pellet in 100 Milliliter infiltrationspuffer mit 10 Millimolar MES und 10 Millimolar Magnesiumsulfat aus.
Inkubieren Sie die Suspensionen bei Raumtemperatur für drei Stunden. Mischen Sie ein gleiches Volumen einer bakteriellen Suspension, die eines der hier gezeigten Module enthält, mit dem fünf Primmodul und dem Integrase-Modul. Mit einer Spritze ohne Nadel fünf Milliliter der Suspensionsmischung herausnehmen.
Drücken Sie die Spitze der Spritze gegen die Unterseite des Pflanzenblattes, während Sie sanft Gegendruck auf die andere Seite des Blattes ausüben. Infiltrieren Sie die ersten drei vollständig expandierten Blätter, beginnend mit der Spitze, für jede Pflanze. Beschriften Sie die agrofiltrierten Blätter mit dem Papieranhänger auf dem Blattstamm.
Dann bringen Sie die Pflanzen unter Standardbedingungen in die Wachstumskammer zurück. An den Tagen vier bis 14 nach der Infektion die agrofiltrierten Blätter sammeln und in flüssigem Stickstoff einfrieren. Bewahren Sie dieses Pflanzengewebe bei minus 80 Grad Celsius auf.
Erstens, separat wachsen die drei A.tumefaciens Transformants in 50 Milliliter LB Medium mit Rifampicin in einer Konzentration von 50 Mikroliter pro Milliliter, und geeignete vektorspezifische Antibiotika durch Schütteln über Nacht bei 28 Grad Celsius. Am nächsten Tag pellet die Bakterienkulturen durch Zentrifugieren bei 4500 mal G für 20 Minuten. Setzen Sie das Pellet in 1 Liter Infiltrationspuffer auf einen OD600 von 0,35 aus, und inkubieren Sie die Suspensionen bei Raumtemperatur für drei Stunden.
Dann fügen Sie 0,01% des Waschmittels zu jeder Suspension hinzu. Mischen Sie ein gleiches Volumen einer bakteriellen Suspension, die eines der hier gezeigten Module enthält, mit dem fünf Primmodul und dem Integrase-Modul. Legen Sie eine sechs Wochen alte Rote-Beet-Pflanze in den Halter.
Invertieren Sie den Halter und legen Sie ihn auf einen Becher, der zwei Liter eines Infiltrationsbades enthält, um die Blätter in die Infiltrationssuspension zu tauchen. Danach das Infiltrationsbad mit der Unterwasseranlage in die Infiltrationskammer überführen und schließen. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein und öffnen Sie das Vakuumeinlassventil an der Infiltrationskammer.
Sobald der Druck in der Kammer auf 90 Millibar gefallen ist, halten Sie das Vakuum für drei Minuten aufrecht. Lassen Sie dann das Vakuum für 45 Sekunden los. Wenn die Kammer wieder atmosphärischen Druck erreicht hat, öffnen Sie die Kammer und entfernen Sie die infiltrierte Pflanze aus dem Bakterienbad.
Bringen Sie die Pflanze in die Wachstumskammer zurück. Am Tag der maximalen Expression die infiltrierten Blätter ernten und in flüssigem Stickstoff einfrieren, wie zuvor beschrieben. Zuerst ernten Sie das vakuumagrofilfiltrierte Delta 87 GAD65mut, das rote Rübenblätter auf dem Ausdrucksgipfel ausdrückt, und frieren sie in flüssigem Stickstoff ein.
Lyophilisieren Sie die gefrorenen Blätter bei minus 50 Grad Celsius und bei 0,04 Millibar für 72 Stunden. Dann lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, schleifen Sie die Blätter zu einem feinen Pulver und lagern Sie bei Raumtemperatur in einem verschlossenen Behälter mit Kieselgel, um die Feuchtigkeit auszuschließen.
Für die Magenverdauungssimulation 100 Milligramm der fein gemahlenen gefriergetrockneten roten Rübenblätter wiegen und in sechs MilliliterN PBS wieder aufsetzen. Verwenden Sie sechs molare Salzsäure, um den pH-Wert der Probe auf zwei einzustellen. Fügen Sie vier Milligramm pro Milliliter Pepsin aus der Magenschleimhaut von Schweinen und 10 Millimolar-Salzsäure hinzu, um eine endgültige Pepsinkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter zu erhalten.
Schütteln Sie die Probe bei 37 Grad Celsius für 120 Minuten. Als Nächstes verwenden Sie Natriumhydroxid, um den pH-Wert der Probe auf acht einzustellen und das Pepsin zu inaktivieren. 750 Mikroliter-Aliquots jeder Probe in Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und die Aliquots bei 20 000 mal G und bei vier Grad Celsius für 20 Minuten zentrifugieren.
Sammeln Sie jeden Überstand separat, und setzen Sie jedes Pellet in einem überstandenen Volumen des Ladepuffers wieder auf. Analysieren Sie dann sowohl den Überstand als auch das resuspendierte Pellet durch Western Blot-Analyse. Für die Zellintegritätsanalyse zwei Proben von 100 Milligramm der fein gemahlenen gefriergetrockneten Roten Rübenblätter vorbereiten und beide in sechs MilliliterPBS wieder aussetzen.
Verwenden Sie sechs molare Salzsäure, um den pH-Wert einer Probe auf zwei anzupassen. Schütteln Sie beide Proben bei 37 Grad Celsius für 120 Minuten. Dann aliquot 750 Mikroliter jeder Probe zu Mikrozentrifugenröhrchen.
Zentrifuge bei 20.000 mal G und bei 4 Grad Celsius für 20 Minuten. Sammeln Sie jeden Überstand separat, und setzen Sie jedes Pellet in einem überstandenen Volumen des Ladepuffers wieder auf. Analysieren Sie dann sowohl den Überstand als auch das resuspendierte Pellet durch Western Blot-Analyse.
Wiegen Sie zunächst 100 Milligramm der fein gemahlenen gefriergetrockneten Roten Rübenblätter und setzen Sie sie in acht Millilitern steriler PBS wieder auf. Wirbel für eine Minute. Platte einen Milliliter jedes gefriergetrockneten Blatthomogenats in einem der fünf vorbereiteten selektiven LB-Medien.
Die Platten drei Tage lang bei 28 Grad Celsius bebrüten. Danach zählen Sie die auf jeder Platte angebauten Agrobacteriumkolonien und berechnen die restliche bakterielle Ladung als Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Milliliter des gefriergetrockneten Blatthomogenats. In dieser Arbeit wird ein oraler Impfstoff in essbarem Pflanzengewebe entwickelt.
Rote Rüben- und Spinatpflanzen werden manuell mit Suspensionen von A.tumefaciens mit EGFP-rekombinanten Expressionsvektoren agrofiltriert, und die fluoreszierende Proteinexpression wird durch Western Blot-Analyse visualisiert und unter UV-Licht quantifiziert. Das Rote-Rüben-System zeichnet sich durch eine höhere EGFP-Expression aus und erreicht nach der Infektion etwa 544 Mikrogramm pro Gramm frischem Blattgewicht, während der Spinat nach der Infektion nur einen Höchstwert von etwa 113,4 Mikrogramm pro Gramm frischem Blattgewicht erreichte. Aus diesem Grund wird die Rote Rübe als Ausdruckshost für alle nachfolgenden Experimente ausgewählt.
Die Pflanzen werden dann mit einer A.tumefaciens Suspension vakuuminfiltriert. Nach der TSP-Extraktion aus Agroinfiltrationsblättern werden die Proben mit Western Blot analysiert, und das rekombinante Protein wird durch eine Densitometrie-Analyse relativ quantifiziert. Schließlich werden die Parameter für die Entwicklung eines potenziellen oralen Impfstoffs bewertet.
Wie hier gesehen, wird das Zielprotein nach dem Lyophilisierungsprozess als stabil angesehen. Die Magenverdauung wird simuliert, indem das Magenenzym Pepsin zu gefriergetrocknetem Material hinzugefügt wird, entweder auf eine Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter oder ein Verhältnis von eins zu 20 zu TSP. Beide Verdauungsbehandlungen führen zum Abbau des rekombinanten Proteins.
Das Fehlen eines spezifischen Signals in den Pelletproben nach der Pepsinverdauung deutet darauf hin, dass die Pflanzenzellen nach dem Einfrieren ihre Integrität verloren haben, was zum Abbau des Zielproteins führte. Das Verfahren sollte sorgfältig an die Pflanzenarten in Bezug auf die Vakuuminfiltration und an das Ziel rekombinantes Protein in Bezug auf die Zeitverlaufsanalyse angepasst werden. Das Nachweisverfahren könnte auch zur Herstellung von Biopharmazeuten verwendet werden, die zur oralen Abgabe bestimmt sind, wie Impfstoff e.B. Impfstoff und Antikörper.
