Dieses Protokoll ermöglicht quantitative klein- bis großflächige Analysen des Zellspeicherfettgehalts in einer Vielzahl von Hefearten und dies in unvoreingenommener und standardisierter Weise. Die Technik ermöglicht die schnelle Verarbeitung mikroskopischer Bilder und liefert detaillierte quantitative Ergebnisse, um Proben wie verschiedene Mutanten und Zellen, die unter verschiedenen Bedingungen angebaut werden, einfach zu vergleichen. Zunächst folgen Sie dem begleitenden Textprotokoll, um die Färbelösungen, Kulturmedien und Zellen vorzubereiten.
Stellen Sie sicher, dass die Zellen gesund sind und sich in der gewünschten Wachstumsphase befinden, bevor Sie das Experiment ausführen. Als Nächstes bereiten Sie einen Mikroskop-Coverslip für jede zu bebilderte Probe vor. Einen Mikroliter Gleitbeschichtungslösung mit der langen Seite einer horizontal positionierten Pipettenspitze auf einen sauberen Deckelschieben verteilen.
Lassen Sie die Beschichtungslösung vollständig trocknen und lagern Sie die Abdeckungen dann in einer staubfreien Umgebung. Als nächstes messen Sie die optischen Dichten der Zellkulturen und für Kulturen, die in der gleichen Wachstumsphase analysiert werden sollen, versuchen Sie, ähnliche Werte unter allen getesteten Kulturen zu erreichen, um vergleichbare experimentelle Bedingungen zu gewährleisten. Dann pipette einen Milliliter der Zellkultur in ein 1,5-Milliliter Mikrozentrifugenrohr.
Nur für die S.cerevisiae-Zellen fünf Mikroliter der Gleitbeschichtungslösung in das Rohr geben. Dann wirbeln Sie alle Mikrozentrifugenrohre kurz aus und bebrüten sie bei 30 Grad Celsius mit Schütteln für fünf Minuten. Als nächstes fügen Sie jedem Kulturaliquot einen Mikroliter der Lipidfärbelösung hinzu und wirbeln Sie sie kurz aus.
Fügen Sie dann 10 Mikroliter der Zellgrenzvisualisierungslösung hinzu, und wirbeln Sie sie ein zweites Mal kurz aus. Sammeln Sie die Zellen, indem Sie sie bei 1.000-facher Schwerkraft drei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrieren. Wenn sie mit dem Spinnen fertig sind, entfernen Sie 950 Mikroliter aus dem Überstand und setzen Sie die Zellen im verbleibenden Überstand mit einer Pipette wieder auf.
Als nächstes pipette zwei Mikroliter der dichten Zellsuspension auf einen mit Lektin beschichteten Deckelschlupf. Legen Sie dann den Deckelrutsch auf ein sauberes Mikroskopschlitten, um eine Zellmonoschicht zu bilden, und gehen Sie so schnell wie möglich zur Mikroskopie über, um Artefakte in der Bildgebung zu minimieren. Die Einrichtung des Mikroskops erfordert lange Expositionen gegenüber starken Lichtquellen, die Schäden an der Probe und schiefe Ergebnisse verursachen können.
Richten Sie daher die bildgebenden Bedingungen mithilfe eines speziellen Probenschlittens ein, der nicht weiter für die Lipidtropfenquantifizierung verwendet wird. Platzieren Sie die dedizierte Probe auf der Stufe eines Phasenkontrast- oder Differentialinterferenzkontrastmikroskops, und konzentrieren Sie sich auf die Zellen. Legen Sie in der Software des Mikroskops die Z-Stack-Einstellungen so fest, dass sie das gesamte Zellvolumen überspannen.
Die gesamte vertikale Entfernung hängt von der Zellgröße ab, und die Anzahl der optischen Slices hängt von der numerischen Öffnung des Objektivs ab. Legen Sie als Nächstes den Fokus fest, um sich relativ zur zentralen Fokusebene zu bewegen. Um Lipidtröpfchen abzubilden, legen Sie experimentell die Lichtintensität und Belichtungszeit im grünen Kanal fest.
Seien Sie vorsichtig bei der Bildgebung, da BODIPY ein sehr helles Fluorchrom ist, das schnell photobleached werden kann. Minimieren Sie außerdem die Belichtungszeit, um eine Übersättigung zu vermeiden. Erfassen Sie zuerst den vollen grünen Kanal Z-Stack, bevor Sie zum blauen Kanal wechseln, um zu verhindern, dass die mobilen Lipidtröpfchen verschwimmen.
Um Zellgrenzen abzubilden, legen Sie experimentell die Lichtintensität und Belichtungszeit im blauen Kanal fest. Stellen Sie nach Möglichkeit einen automatisierten experimentellen Workflow in der Mikroskopsteuerungssoftware ein, um die Bildgebung mehrerer Proben unter standardisierten Bedingungen zu erleichtern. Wichtig ist, dass alle Bilder mit den gleichen Einstellungen erfasst werden müssen, um einen angemessenen Vergleich zwischen Denbbildern zu ermöglichen.
Sobald die bildgebenden Bedingungen optimiert wurden, konzentrieren Sie sich auf die Zellen und stellen Sie sie sowohl im grünen als auch im blauen Kanal ab. Bildner mehrere Sichtfelder pro Beispiel, um robuste, repräsentative Daten zu erhalten. Speichern Sie die blauen und grünen Kanal-Z-Stack-Bilder als 16-Bit-, mehrschichtige TIFF-Dateien.
Achten Sie darauf, die Wörter grün oder blau in die entsprechenden Dateinamen aufzunehmen. Öffnen Sie mikroskopische Bilder in ImageJ, und entfernen Sie alle Bildstapel, die eine beträchtliche Anzahl von Zellen enthalten, die sich während der Erfassung bewegt haben. Diese erscheinen an unterschiedlichen Positionen in einzelnen Z-Abschnitten.
Entfernen Sie als Nächstes alle Bildstapel, die hochfluoreszierende Nichtzellpartikel im blauen Kanal enthalten. Dies wird oft durch Schmutz auf der bildgebenden Oberfläche oder Verunreinigungen im Kultivierungsmedium verursacht und kann den Nachweis von Zellen in ihrer Nähe beeinträchtigen. Entfernen Sie außerdem alle Bildstapel, die einen großen Teil abgestorbener Zellen enthalten.
Diese Bilder zeigen Zellen mit erhöhter blauer Fluoreszenz im Vergleich zu den lebenden Zellen. Während das Vorhandensein einiger abgestorbener Zellen in der Stichprobe in der Regel kein Problem darstellt und diese Zellen während der Analyse automatisch verworfen werden, können einige abgestorbene oder absterbende Zellen gelegentlich vom Segmentierungsalgorithmus als lebende Zellen erkannt werden und somit die gemeldeten Ergebnisse verzerren. Um mit der Analyse in MATLAB zu beginnen, erstellen Sie zunächst einen Hauptordner und kopieren Sie alle MATLAB-Skripts an diesen Speicherort.
Erstellen Sie als Nächstes Unterordner mit den Namen der verschiedenen Hefearten, und kopieren Sie die entsprechenden TIFF-Bilder an diese Speicherorte. Starten Sie nun MATLAB, öffnen Sie das Skript MAIN. m, und führen Sie das Skript aus.
Wählen Sie im Menü die zu analysierende Hefeart aus und starten Sie die Bildverarbeitung. Überprüfen und verarbeiten Sie die Ausgabedateien nach Bedarf mit einem Tabelleneditor oder einem statistischen Paket. Der Workflow erzeugt semikolongetrennte CSV-Dateien und segmentierte TIFF-Dateien mit erkannten Zellobjekten und Lipidtröpfchen.
Hier sind wildtypisierte S.pombe-Zellen zu sehen, die entweder im komplexen JA-Medium oder im definierten EMM-Medium angebaut wurden. Im Vergleich zu Zellen, die im JA-Medium angebaut wurden, wurden im EMM-Medium weniger Lipidtröpfchen und eine höhere Färbeintensität pro Zellvolumeneinheit nachgewiesen. Darüber hinaus waren einzelne Lipidtröpfchen, die im EMM-Medium gebildet wurden, größer und zeigten eine erhöhte Gesamtfärbeintensität.
Dies stimmt mit früheren Erkenntnissen über einen erhöhten gespeicherten Lipidgehalt in Zellen überein, die in EMM angebaut werden. Als nächstes zeigen diese Bilder S.japonicus Zellen aus exponentiellen und frühstationären Kulturen, die in JA-Medium angebaut werden. Zellen, die in die stationäre Phase eintraten, zeigten eine deutlich verringerte Anzahl von Lipidtröpfchen pro Einheit des Zellvolumens, während die volumennormalisierte Lipidtröpfchenfluoreszenzintensität zwischen den beiden Bedingungen leicht abnahm.
Die frühen stationären Lipidtröpfchen waren in der Regel mäßig größer und hatten eine mäßig höhere Gesamtfluoreszenzintensität im Vergleich zu Tröpfchen aus exponentiell wachsenden Zellen. In S.cerevisiae-Zellen, die exponentiell im Vergleich zur stationären Phase herangewachsen sind, enthielten stationäre Zellen etwas weniger Lipidtröpfchen pro Volumeneinheit im Vergleich zu exponentiell wachsenden Zellen. Ihre volumennormalisierte Tröpfchenfluoreszenzintensität verdoppelte sich jedoch fast.
Dieser starke Anstieg des Gesamtfetttröpfchengehalts war auf die viel höhere Fluoreszenzintensität und das Volumen einzelner Lipidtröpfchen in stationärer Phase zurückzuführen. Nach diesem Verfahren können Ausgabedaten in einem statistischen Paket wie R aggregiert werden, um Diagramme mit zusammengefassten Ergebnissen zu erstellen und statistische Tests zu allen beobachteten Unterschieden im Fetttropfengehalt durchzuführen. Grundsätzlich kann die Bildverarbeitungspipeline zur Analyse des Lipidtröpfchengehalts in anderen Mikroorganismen oder zur Analyse anderer punktähnlicher subzellulärer Strukturen genutzt werden.
