Die Autoren danken der Cirillo Labor Mitglieder für wertvolle Diskussionen und Unterstützung in dieser Studie. Wir danken Dr. Joshua Hill und dem Labor von Dr. James Samuel um Hilfe bei bei den Dreharbeiten zu diesem Protokoll. Diese Arbeit wurde durch Grant 48523 von der Bill &amp; Melinda Gates Foundation und gewähren AI47866 von den National Institutes of Health gefördert.

1. Pulmonale Infektionen durch intratracheale Intubation <ol><li> Wiegen Mäusen und, optional, Markierungen können an den Ohren zur einfachen Identifizierung vorgenommen werden. </li><li> Anesthetize die Mäuse mit Ketamin (100 ug pro g Maus Gewicht) und Xylazin (10 ug pro g Maus Gewicht) durch intraperitoneale Impfung. </li><li> Legen Mäuse in Käfigen, bis sie vollständig betäubt. Drücken Sie die Pads von den Füßen in die Pedale treten Reflex zu überprüfen. Mäuse sollte reduziert oder Display keine Reflex-Reaktion. </li><li> Legen Sie die Maus auf die Intubation stehen Liegen auf dem Rücken. </li><li> Fix ein Gummiband um eine Intubation zu stehen und sie dann unter die oberen Schneidezähne der Maus. Verwenden Sie Klebeband um Arme und Beine auf die Intubation stehen fix. </li><li> Bewegen Sie tougue aus dem Mund mit einer Pinzette. </li><li> Legen Sie speculum mit octoscope Innere des Mundes und schauen Sie in Oropharynx bis Kehlkopf Öffnung sichtbar ist. </li><li> Advance-Führungsdraht mit cathether in Luftröhre abgedeckt, bis catether Hub ist bei den Schneidezähnen. Entfernen Führungsdraht. Put Luft in cathether zur Brust Expansion zu beobachten und zu bestätigen korrekte Intubation. </li><li> Inject 50 ul bakterielle (in den Abbildungen verwendeten wir Bacillus Calmette Guerin (BCG) zum Ausdruck klicken Käfer rot Luciferase (CBRLuc), in unserem Labor aufgebaut, sondern alle lumineszierenden Bakterienstamm verwendet werden kann) Lösung durch cathether mit einer 1 ml-Spritze. </li><li> Bewegen Sie die Maus in einen Käfig und beobachte sie während aus der Narkose. </li></ol> 2. Tierische Betäubung und Vorbereitung für die Biolumineszenz Imaging Mäuse sind mit Isofluran mit der XGI-8 Gas Aneshesia System. <ol><li> Vor der Inbetriebnahme des XGI-8 Anästhesie-System, wiegen jeweils Aktivkohlefilter Kanister und schreiben das Gewicht und das Datum drauf. Wenn das Gewicht von 50 Gramm mehr als der ursprüngliche Gewicht, ersetzen Sie ihn durch einen neuen Behälter. </li><li> Überprüfen Sie die Isofluran-Ebene in den Verdampfer und füllen Sie ihn, wenn nötig. </li><li> Schalten Sie den Evakuierungspumpe in der Vorderseite des XGI-8 Anästhesie-System und auf 8 lpm (Liter pro minuite). </li><li> Schalten Sie die Sauerstoffzufuhr aus dem Hochdruck-Zylinder und setzen Sie ihn auf 55 psig. </li><li> Schalten Sie den Sauerstoff toggle (grün) auf der Vorderseite der XGI-8 Anästhesie-System. </li><li> Schalten Sie den Gasstrom auf die Bildgebung Kammer auf das Niveau der Gasfluss eingestellt. Set auf 0,25 lpm und schalten Sie dann den Gasstrom. </li><li> Schalten Sie den Gasstrom auf die Narkose Kammer auf das Niveau der Gasfluss eingestellt. Set bis 1,5 lpm und schalten Sie dann Gasstrom. </li><li> Schalten Sie die Isofluran mit dem Verdampfer und setzen auf 2-2,5 Prozent. Die Isofluran Ebene kann je nach der Anzahl der Tiere verwendet und Gewicht sein. </li><li> Legen Sie die Mäuse in der Induktion Kammer und den Deckel schließen. Schalten Sie den Gasstrom auf die Induktion Kammer. Legen Mäuse in der Kammer für 5 bis 10 minuites, bis sie vollständig zu betäuben. </li><li> Bewerben optische Salbe auf die Augen, um die Maus Augen während der Bildgebung zu schützen und setzen die Mäuse in der Imaging-Kammer in eine der Bugspitze über die Betäubung vielfältig. Verwenden Sie leichte Trennwand zwischen Mäusen, um die Reflexion von Licht auf benachbarte Tier Themen zu verhindern. </li><li> Inject Luciferin (150 pg / g Körpergewicht) durch intraperitoneale Impfung. </li></ol> 3. Biolumineszenz-Bildgebung <ol><li> Starten Sie das Leben Imaging Software. </li><li> Wenn das System nicht initialisiert wird, initialisieren Sie die IVIS Imaging Systems. </li><li> Stellen Sie die Parameter für die Bildgebung, indem Reihenfolge Setup in IVIS Erwerb Bedienfeld. Wählen Lumineszenz und fotografieren in Imaging-Modus. Wenn die Option zur Durchführung DLIT 3D-Rekonstruktion erwünscht ist, wählen Sie Foto-, Lumineszenz-und Struktur-Licht Bilder als Teil der Bildsequenz. Set Belichtungszeit von 0,5 sec bis 10 Minuten. Set Binning und F / Stop auf der Grundlage erwarteter Helligkeit der Probe. Set Anregungsfilter zu blockieren und Emissionsfilter zu öffnen, es sei denn, der Planung, dass nur bestimmte Wellenlängen des Lichts zu erwerben. Im Falle von DLIT 3D Verfassung, setzen mehrere Emissions-Filter verschiedener Wellenlängen, um genaue Lokalisierung der Quelle ermöglichen. Set FOV von A bis D in Abhängigkeit von der Anzahl der Mäuse oder Region Tier abgebildet werden. Wählen Sie A und B für 1 Maus, C für 2-3 Mäuse und D für 4-5 Mäuse. </li><li> Klicken Sie auf Hinzufügen in der Image-Assistenten in der Übernahme der Systemsteuerung, um die Reihenfolge Setup hinzuzufügen. </li><li> Starten Bildgebungssequenz indem erwerben. Im Falle von DLIT 3D-Konstruktion, wird lumineszierenden Bilder für mehrere Emissionsfilter bei verschiedenen Wellenlängen erworben werden. Fotografische und strukturiertem Licht Bilder auch erworben werden. </li><li> Bei der Aufnahme des Bildes und bearbeiten Bildebenen Panels sichtbar sein wird. Füllen Sie so detailliert wie möglich für jedes Experiment in Bild ändern, um die einfache Verfolgung von Bildern zu späteren Zeitpunkten zu gewährleisten, und speichern Sie Ihre Bilder. </li><li> ReRemove die Mäuse aus IVIS Bildgebung Kammer und bringt sie in ihre Käfige. Beachten Sie Genesung von einerESTHESIA Mäusen sicher nicht signifikant von den Verfahren betroffen. Die Tiere sollten ständig überwacht werden, bis sie aus der Narkose (in der Regel 1-2 min) vollständig erholen. </li></ol> 4. Ex vivo Imaging und CFU-Analyse für die Quantifizierung von Bakterien in der Lunge <ol><li> Inject Mäuse mit Luciferin intraperitoneal in der gleichen Weise wie für die Bildgebung, kurz vor der Euthanasie. </li><li> Euthanize die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 100 mg / kg pentobarbitol 5 min nach dem Luciferin Injektion. </li><li> Explantation der Lunge von Mäusen und in sterile Petrischalen mit einer sterilen Pinzette und Schere. </li><li> Legen Sie Petrischale mit explantierten Organ in der Bildgebung Kammer und erwerben Biolumineszenz Bilder in der gleichen Weise wie für die ganze Maus. </li><li> Nach der Belichtung, entfernen explantierten Orgel aus Petrischale mit einer sterilen Pinzette und homogenisieren in 1 ml PBS. </li><li> Machen Verdünnungen und Platte Gewebe auf den entsprechenden selektiven Medien. Homogenisierte Gewebe -80 ° C für re-Beschichtung gelagert werden sollte es notwendig sein. Alternativ können homogenisiert Gewebe für RNA oder DNA-Extraktion der bakteriellen Zahlen, die durch qPCR Quantifizierung verwendet werden. </li></ol> 5. Die Analyse der Lumineszenz Imaging <ol><li> Starten Sie &quot;Living Imaging Software&quot; und durchsuchen Sie die Image-Dateien. </li><li> Verwenden Sie &quot;Tool-Palette&quot;, um Bilder einzustellen. Klickt auf das Bild anpassen, um Korrektur / Filter-Einstellungen und min / max für einzelne Farbskalen ändern. </li><li> Verwenden Sie ROI-Tools in Pulldown-Liste für die Quantifizierung der Lichtintensität. Wählen ROI Form, Anzahl und Größe. Drag ROI Frame region of interest auf das Bild. Sicherstellen, dass alle ROI haben die gleiche Größe und Form. Klicken Sie auf ROI-Messung und speichern, kopieren und / oder Export quantitative Daten. </li><li> Im Falle von DLIT 3D-Rekonstruktionen, laden Bildsequenz einschließlich der mit strukturiertem Licht Bild. Klicken Sie auf Oberflächentopographie in der Tool-Platte. In Pull-Down-Liste, klicken Sie rekonstruieren Registerkarte, um die Topographie zu erzeugen. Eine Oberfläche Durcheinander wird dann in dem Fenster angezeigt werden. </li><li> Wählen DLIT 3D-Rekonstruktion in der Tool-Platte. In Pull-Down-Liste, klicken Sie auf die Registerkarte Eigenschaften, um Gewebe Eigenschaften und Source-Spektrum gesetzt. Der Muskel ist in den meisten Fällen empfohlen. Im Pulldown-Liste, klicken Sie auf die Registerkarte Analysieren der Wellenlänge für die Analyse auszuwählen. Klicken Sie auf die Registerkarte Parameter und bestätigen Sie die Standardwerte oder passen DLIT Parameter, wenn nötig. Klicken Sie rekonstruieren Registerkarte 3D-Analyse zu starten. </li><li> Als 3D-Rekonstruktion abgeschlossen ist, wird die 3D-Ansicht zeigt die Ergebnisse der 3D-Rekonstruktion. Klicken Sie auf die Registerkarte Ergebnisse der Analyse von Daten für Photonen-Dichte, Voxel und DLIT Algorithmus Parameter zu sehen. </li><li> Speichern und / oder exportieren Sie die Ergebnisse der 3D-Rekonstruktion Analysen in Zahlen und Daten. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Die Biolumineszenz Bilder von Mäusen mit Biolumineszenz Bakterien zusammen mit einem nicht infizierten Maus-Steuerung infiziert sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Mäuse Lungen mit Biolumineszenz-Bakterien infiziert produzieren signifikantes Signal aus der Lunge (Abbildung 1). Lumineszenzintensität ist als Gesamt-Lichtstrom innerhalb einer ROI (Region of interessiert) (Abbildung 2) quantifiziert. Die quantitativen Daten für die Lichtintensität ist für Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) von Bakterien von der Lunge erhalten, um zu bestätigen, dass das Signal von der Biolumineszenz Bakterien produziert und können zu negativen Kontrolle verglichen werden normalisiert. Die Lage und Intensität des Signals kann durch DLIT 3D-Rekonstruktion der Lumineszenz Quelle-Tomographie der Maus Fläche 11 analysiert werden. Diese Analysen erlauben die Quantifizierung und Lokalisierung der Biolumineszenz-Signal erzeugt. Die Ergebnisse der 3D-Rekonstruktion eines lumineszierenden Quelle in infizierten Mäusen zeigt, dass Licht von Lungen der Maus (Abbildung 3) hergestellt wird. Die ex vivo Bilder des resultierenden Mauslungen bestätigen, dass Lumineszenz wird von den Lungen abgegeben, sondern als einige andere eng nebeneinanderliegenden Gewebe oder Organ (Abbildung 2C). <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Lumineszenzbildgebung der pulmonalen infizierten Mäuse mit Biolumineszenz Bakterien mit CBRluc getaggt. Infizierte Kontroll-Maus ist auf der linken und zwei infizierte Mäuse sind auf der rechten Seite. Die Mäuse wurden mit Bakterien exprimiert CBRluc (n = 2) infiziert über die intratracheale Route. Dorsal, ventral, links und rechts: 10 Minuten nach dem Luciferin Injektion wurden Lumineszenz Bilder für 10 min bei 4 Positionen erworben. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Die quantitative Lichtintensität von Mäusen, die mit Bakterien exprimiert CBRluc infiziert. (A, B) Lumineszenz Bilder von ROI-Analyse und der Quantifizierung insgesamt Lichtstrom von ROI in dorsalen und ventralen Positionen jeweils. Nicht infizierte Mäuse sind auf der linken und zwei infizierte Mäuse sind auf der rechten Seite. Lumineszenz Bilder wurden von der Lunge o erworbenf Mäusen infizierten und infizierten mit CBRlux (n = 2). Die Lichtintensität rund Lunge wurde durch ROI-Analyse quantifiziert. C) ex vivo Bilder der Lunge aus nicht infizierten (oben) und infizierten (unten zwei Sätze von Lunge) Mäusen. Luciferin war 5 miniuts injiziert, bevor der Euthanasie und Bilder dann erworben wurden. Die quantifizierten Werte sind CFU normalisiert. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Die 3D-Rekonstruktion von Biolumineszenz Quelle (n) aus einer pulmonalen Infektion der Maus. Die Maus wurde mit Bakterien exprimiert CBRluc durch intratracheale Injektion infiziert. Die Bildsequenz wurde aufgenommen mit verschiedenen Emissions-Filter von seriellen Wellenlängen von 540 nm bis 700 nm. Ein Bild-Sequenz wurde für die 3D-Rekonstitution für Lumineszenz-Quelle in der Tier-Themen, die eine strukturierte imag enthalten sind, verwendet. A) Die Tomographie für die Maus ist in verschiedenen Positionen dargestellt: vorne, hinten, links und rechts. Lichtquellen werden als Voxel (rote Kästchen in 3D-Maus), die in Lunge befinden, werden als durch Rekonstruktion bestimmt gezeigt. B) Photon densiy Karte von gemessenen und simulierten Daten. Vergleicht man die gemessenen und simulierten Photonendichte Kurven stellen die Informationen der Qualität der Rekonstruktion. Gute Qualität Rekonstruktionen Ergebnis in ähnlicher gemessenen und simulierten Photonendichten.

<ol>
	<li>Wilson, T., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence.">Bioluminescence.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).</li><li>Contag, C. H., Bachmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+gene+expression.">Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.</a> Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).</li><li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases.">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li><li>Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+DNA+coding+click+beetle+luciferases+can+elicit+bioluminescence+of+different+colors.">Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors.</a> Science. 244, 700-702 (1989).</li><li>Wet, J. R. d. e., Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+firefly+luciferase+cDNA+and+the+expression+of+active+luciferase+in+Escherichia+coli.">Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).</li><li>Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistries+and+colors+of+bioluminescent+reactions:+a+review.">Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review.</a> Gene. 173, 5-11 (1996).</li><li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emission+spectra+of+bioluminescent+reporters+and+interaction+with+mammalian+tissue+determine+the+sensitivity+of+detection+in+vivo.">Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo.</a> J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).</li><li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes.">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li><li>Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li><li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging.">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).</li><li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging.">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).</li></ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Texas A &amp; M University setzen durchgeführt.

Obwohl die folgenden Protokolle werden in der Regel in qualitativ hochwertige Bilder, ist es wichtig, ein paar wichtige Fragen zu erörtern, um genaue und konsistente Daten aus bildgebenden Verfahren zu erhalten. Lumineszenz Bilder sollten erworben, die haben zählt von 600 bis 60.000, um sicherzustellen, dass das Signal über dem Hintergrund liegt und die Kamera ist nicht gesättigt werden. Wenn das Signal erhalten weniger als 600 der Expositionsbedingungen sollte so eingestellt zählt zu erhöhen. Wenn das Signal erha...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VETONE</td>
<td>501027 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Butler animal health supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>158307</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luciferin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GMT</td>
<td>LUCK-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal plus solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VOR tech pharmaceutical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cathether (22G x 1&#x201D;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TERUMO</td>
<td>OX2225CA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guide wire </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hallowell EMC</td>
<td>210A3491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octocope with speculum </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hallowell EMC</td>
<td>000A3748</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xenogen IVIS system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XGI-8-gas Anesthsia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Living Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transparent nose cones</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Light baffle divider </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using luciferase to image bacterial infections in mice

Imaging ist eine wertvolle Technik, die verwendet werden, um biologische Prozesse zu überwachen. Insbesondere kann das Vorhandensein von Krebs, Stammzellen, bestimmte Zelltypen, virale Krankheitserreger, Parasiten und Bakterien in Echtzeit innerhalb von lebenden Tieren 1-2 folgen. Die Anwendung des Biolumineszenz-Bildgebung zur Erforschung der Krankheitserreger hat Vorteile gegenüber herkömmlichen Strategien zur Analyse von Infektionen in Tiermodellen 3-4 verglichen. Infektionen können innerhalb der einzelnen Tiere visualisiert im Laufe der Zeit, ohne dass Euthanasie auf die Lage und Menge des Erregers zu bestimmen. Die optische Bildgebung ermöglicht eine umfassende Untersuchung aller Gewebe und Organe, anstatt Probenahme von Seiten bisher bekannten infiziert zu sein. Darüber hinaus kann die Genauigkeit der Impfung in bestimmten Geweben direkt bestimmt werden vor der Durchführung vor Tieren, die erfolglos während des gesamten Experiments wurden geimpft. Variabilität zwischen den Tieren kann kontrolliert werden, da Bildgebung ermöglicht jedes Tier einzeln verfolgt werden. Imaging hat das Potenzial, deutlich reduzieren Tierzahlen notwendig, weil der Fähigkeit, Daten aus zahlreichen Zeitpunkten ohne Probe Gewebe Erreger Last bestimmt 3-4 erhalten. Dieses Protokoll beschreibt Methoden, um Infektionen in lebenden Tieren mit Biolumineszenz-Bildgebung für die rekombinante Bakterienstämme, die Luciferase zu visualisieren. Der Klick Käfer (CBRLuc) und Glühwürmchen-Luciferase (FFluc) nutzen Luciferin als Substrat 5-6. Das Licht von beiden CBRluc und FFluc hervorgebracht hat einen breiten Wellenlängenbereich von 500 nm bis 700 nm, so dass diese Luciferasen ausgezeichnete Reporter für die optische Bildgebung im lebenden Tier-Modellen 7-9. Dies ist vor allem, weil Wellenlängen des Lichts größer als 600 nm erforderlich sind, um die Absorption von Hämoglobin zu vermeiden und damit reisen durch Säugetiergewebe effizient. Luciferase ist genetisch in die Bakterien eingeführt werden, um Licht-Signal 10 zu produzieren. Mäuse sind pulmonale mit Biolumineszenz Bakterien intratracheal zur Überwachung von Infektionen in Echtzeit ermöglichen geimpft. Nach Luciferin Injektion, werden die Bilder aufgenommen mit der IVIS Imaging System. Während der Aufnahme werden die Mäuse mit Isofluran mit einem XGI-8 Gas Anethesia System. Bilder können analysiert zu lokalisieren und zu quantifizieren, die Signalquelle, die die bakterielle Infektion Website (s) und die Zahl repräsentiert, bzw. werden. Nach der Bebilderung wird CFU Bestimmung an homogenisiert Gewebe durchgeführt, um das Vorhandensein von Bakterien zu bestätigen. Mehrere Dosen von Bakterien benutzt, um bakterielle Zahlen mit Lumineszenz korreliert. Imaging können genutzt werden um der Pathogenese und Beurteilung der Wirksamkeit von antimikrobiellen Verbindungen und Impfstoffe studieren.

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Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Methoden für die Biolumineszenz-Bildgebung von bakteriellen Infektionen in lebenden Tieren beschrieben. Krankheitserreger werden geändert, um auszudrücken Luciferase ermöglicht optische Ganzkörperbildgebungssysteme von Infektionen in lebenden Tieren. Tiermodelle können mit Luciferase exprimierenden Krankheitserreger infiziert werden und die daraus resultierende Verlauf der Erkrankung visualisiert in Echtzeit durch Biolumineszenz-Bildgebung.

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

using-luciferase-to-image-bacterial-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.3K Aufrufe.  Texas A&M Health Science Center. Methoden für die Biolumineszenz-Bildgebung von bakteriellen Infektionen in lebenden Tieren beschrieben. Krankheitserreger werden geändert, um auszudrücken Luciferase ermöglicht optische Ganzkörperbildgebungssysteme von Infektionen in lebenden Tieren. Tiermodelle können mit Luciferase exprimierenden Krankheitserreger infiziert werden und die daraus resultierende Verlauf der Erkrankung visualisiert in Echtzeit durch Biolumineszenz-Bildgebung.

Serie: Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

Die Beurteilung stomatäre Response to Bakterienzellen Live mit Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Mess-bakterielle Belastung und Immunreaktionen in Mäuse Infizierte mit Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D Imaging von Multimodalität<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infektionen bei Mäusen

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Langzeitchronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway-Infektion bei Mäusen

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Humanisierten Maus-Modell, um bakterielle Infektionen Studieren Targeting der Mikrogefäß

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

Mit dem Protozoon Paramecium Caudatum als Vehikel für lebensmittelbedingte Infektionen im Zebrafisch-Larven

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...