Hier stellen wir NETQUANT vor, einen vollautomatischen Ansatz zur Quantifizierung von NETS- und Immunfluoreszenzbildern. Dies wird Forschern helfen, vergleichbare Bildanalysen aus Daten zu erstellen, die von mehreren Benutzern und Bedingungen generiert wurden. Die Vorteile dieser Technik sind die Benutzerfreundlichkeit, die Analyse von Einzelzellendaten, mehrere Kriterien zur Bewertung der NET-Bildung und eine unvoreingenommene Analyse mehrerer Bilder.
Installieren und öffnen Sie die Analysesoftware. Eine aktuelle Version finden Sie im Zenodo GitHub-Archiv oder auf der Nordonfelt Lab-Website. Wählen Sie auf der Registerkarte Setup einen Quellordner für die Analyse aus, indem Sie im Quellmenü auf die Option Pfad abrufen klicken.
Wählen Sie den Ordner aus, der die zu analysierenden Bildsequenzen enthält. Klicken Sie erneut auf die Option Pfad abrufen im Zielmenü, und wählen Sie den Zielordner zum Speichern der Daten nach der Bildanalyse aus. Als nächstes benennen Sie bei verwendung separater Kanalbilder die Kanalordner, sodass der DNA-Kanal dem Kern-DNA-Fleck entspricht, und der NET-Kanal zeigt den neutrophilen Elastase-Fleck in den Bildern.
Benennen Sie außerdem den Ordner, der die Steuerelementabbilddateien enthält, als Steuerelement. Klicken Sie als Nächstes auf die Schaltfläche Bildinformationen laden, und laden Sie die Bildmetadaten in die Software. Wählen Sie dann im Untermenü Kanalreihenfolge die richtige Kanalreihenfolge aus, die in den Bildern enthalten ist.
Dies hilft, versehentliche Inkongruenzen zu vermeiden. Klicken Sie nun auf die Schaltfläche Daten vorbereiten, um primäre Bildeigenschaften aus den Rohdaten zu erfassen und die Bilder zu konvertieren. Die konvertierten Bilder werden dann im Untermenü der Beispieltypen angezeigt.
Klicken Sie auf das Menü vom Beispieltyp, wählen Sie ein Bild aus dem Untermenü aus und klicken Sie auf Anzeigebilddaten, um die in die DNA und Neutrophil Extracellular Trap bzw. NET-Kanal aufgeteilten Bilder anzuzeigen. Um die Zellen in ihre jeweiligen Kanäle zu segmentieren, wählen Sie die Registerkarte Segmentierungsmethode aus, und wählen Sie eine Methode im Untermenü der Methode für die DNA- und die NET-Kanäle aus. Die Standardmethode der Segmentierung ist auf adaptiv festgelegt und ist die empfohlene Einstellung.
Andere Optionen sind in der Software einschließlich global edge und chanverse verfügbar. Eine Wassereinzugsgebietsoption wurde ebenfalls aufgenommen, um zwischen eng platzierten Zellen oder NETs zu unterscheiden. Klicken Sie auch auf der Registerkarte Segmentierung auf die Option Segmentsteuerungsmuster.
Wählen Sie dann PMA aus dem Beispieltyp-Untermenü aus und klicken Sie auf die Stapeloption, um mit der Segmentierung aller im Datensatz enthaltenen Bilder zu beginnen. Wählen Sie als Nächstes die Bilder im Menü "Beispieltyp" aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Bilddaten anzeigen, um die binären Bildmasken für die nach der Segmentierung generierten DNA- und NET-Masken zu visualisieren und zu validieren. Klicken Sie nun auf der Registerkarte Analyse auf die Schaltfläche Schwellenwert bestimmen, um die Kontrollbeispiele zu analysieren.
Ändern Sie dann auf der rechten Seite den Stichprobentyp in PMA, und klicken Sie auf die Schaltfläche Zelleneigenschaften abrufen, um die Analyse der stimulierten Proben abzuschließen. Wählen Sie als Nächstes ein Bild aus dem Untermenü des Beispieltyps aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Bilddaten anzeigen, um die Überlagerung und die Anzahl der Zellen und NET-bildenden Zellen im Bild anzuzeigen. Wählen Sie zunächst das Beispiel aus dem Untermenü des Beispieltyps aus.
Einzelne Bilder können aus dem Untermenü des Beispieltyps für die Analyse ausgewählt werden oder der gesamte Bildstapel kann durch Auswahl der Batch-Option analysiert werden. Sobald die Option ausgewählt ist, klicken Sie auf die Schaltfläche NETs analysieren, um die Analyse abzuschließen. Passen Sie die NET-Kriterien manuell an, um optimale Ergebnisse für eine bestimmte Stichprobe zu erzielen.
Vergleichen Sie identifizierte NETs mit den Originalbildern, um die Qualität der Identifizierung zu bewerten. Nach Abschluss dieses Schritts können die NET-Kriterien auf alle Bilder im Dataset angewendet werden. Alle an den NET-Kriterien vorgenommenen Änderungen werden gleichzeitig auf alle Steuerelementstichproben angewendet.
Überprüfen Sie die Datenzusammenfassung im Untermenü zellendaten, in dem die Anzahl der Bilder, die Zellenanzahl pro Bild und der Prozentsatz der NETs pro Bild angezeigt werden. Geben Sie die Registerkarte Ausgabe ein, um die Ergebnisausgaben auszuwählen und anzuzeigen. Untersuchen und vergleichen Sie die verschiedenen Datenausgänge, die aus der Analyse von Kontroll- und PMA-behandelten Proben generiert wurden, indem Sie die Form der Ausgabe auswählen und auf die Schaltfläche Ausgabeergebnisse klicken.
Als Nächstes starten Sie die Ergebnisdatentabelle CSV-Datei, um Einzelzellendaten zu untersuchen, und klicken Sie auf die Ergebnisse PDF-Dateien, um die NET-Bereichsverteilung und DNA-zu-NET-Verhältnis in den Stichproben zu visualisieren. Die rote Linie gibt den Schwellenwert in den Diagrammen an. Klicken Sie schließlich auf die bivariate Verteilungsdatei der Ergebnisse, um den NET-Bereich im Vergleich zur Form der DNA zu bestimmen.
Hier wurden 15 Bilder von Kontrollneutrophilen und 15 Bilder von PMA-stimulierten Neutrophilen in weniger als zehn Minuten analysiert. Die Gesamtzahl der Zellen wurde gezählt und der Prozentsatz der Zellen mit Neutrophilen extrazellulären Fallen wurde mit der in diesem Artikel beschriebenen automatisierten Quantifizierungsmethode bestimmt. Diese Ergebnisse zeigen, dass PMA-stimulierte Neutrophile eine größere Fläche, eine Zunahme der nuklearen Verformung und ein höheres DNA-zu-NET-Verhältnis haben als Kontrollproben.
In Kombination mit einem 3D-Diagramm zeigen die PMA-stimulierten Proben tendenziell Bereiche, in denen die Gruppierungen enger werden als die Kontrollproben. Beim Versuch des Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Workflow zwar mit mehreren Spendern getestet wurde, dass der Benutzer jedoch die Softwareparameter entsprechend basierend auf dem einzelnen Datensatz entscheiden sollte.
