High-Density DNA und RNA Mikroarrays - Photolithographische Synthese, Hybridisierung und Vorbereitung von großen Nukleinsäurebibliotheken

DNA- und RNA-Mikroarrays sind sehr nützlich, um die Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren und Proteinen zu untersuchen, aber sie sind auch eine bequeme Methode für die Erstellung von Sequenzbibliotheken. Die Photolithographie ermöglicht die parallele Synthese hunderttausender einzigartiger Sequenzen und ist derzeit die einzige direkte Methode zur RNA-Synthese auf Mikroarrays. Die in situ photolithographische Synthese von Mikroarrays kann auch auf chemisch modifizierte Oligonukleotide erweitert werden, beispielsweise mit zwei Primfluor-Peptid-Nukleinsäuren.

Den Prozess der Mikroarray-Fertigung und -Handhabung zu sehen, kann helfen zu verstehen, wie diese komplexe Maschineausweise aus der bekannten Standard-Festphasen-DNA-Synthese entwickelt wurde. Beginnen Sie dieses Verfahren mit microarray-Design und Slide-Funktionalisierung, wie im Textprotokoll beschrieben. Schalten Sie die UV-LED des DNA-Synthesizers und ihren Lüfter ein.

Befestigen Sie ein UV-Intensitätsmessgerät am Brennpunkt des eingehenden UV-Lichts und schalten Sie es ein. Starten Sie auf dem Computer die WiCell Controller-Software. Schalten Sie das Mikromere-Gerät ein und initialisieren Sie es.

Laden Sie eine weiße Maskendatei, indem Sie mit der rechten Maustaste auf DMD klicken und dann das Bild laden auswählen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das UVS-Symbol und wählen Sie den UV-Verschluss öffnen. Lesen Sie den Leistungswert auf dem Intensitätsmesser und zählen Sie 60 Sekunden.

Lesen Sie nach 60 Sekunden den Energiewert erneut und notieren Sie sich die Anfangs- und Endwerte. Schließen Sie den Verschluss, indem Sie den UV-Verschluss schließen und schalten Sie den Intensitätsmesser aus. Berechnen Sie den durchschnittlichen UV-Intensitätswert in Milliwatt pro Zentimeter Quadrat.

Laden Sie in der WiCell-Software die Auftrags-, Sequenz- und Protokolldateien in ihre jeweiligen Unterfenster, und klicken Sie dann auf Senden, um die Sequenz- und Protokolldateien an den DNA-Synthesizer zu senden. Um die Synthesezelle zu montieren, legen Sie eine dicke Perfluorelastomerdichtung auf den Quarzblock der Zelle. Legen Sie dann einen gebohrten, funktionalisierten Mikroskopschlitten auf die erste Dichtung und überprüfen Sie, ob sich die Löcher auf den Dias mit dem Ein- und Auslassschlauch der Synthesezelle verbinden.

Legen Sie eine zweite, dünne Polytetrafluorethylendichtung über den gebohrten Schlitten, der die beiden Löcher umgibt. Platzieren Sie schließlich eine zweite, funktionalisierte, aber unrillierte Rutsche auf der zweiten Dichtung. Legen Sie nun einen 4-Schrauben-Metallrahmen auf die montierte Doppelsubstratzelle Und ziehen Sie die Schraube mit einem Drehmomentschrauber auf die gleiche Spannkraft.

Befestigen Sie den Einlass und den Auslassschlauch am DNA-Synthesizer. Prime die Acetonitril-Waschlinie und überprüfen Sie den richtigen Fluss von Acetonitril durch die Substrate. Messen Sie das Acetonitrilvolumen an der Abfalllinie, nachdem Sie sieben Zyklen der Acetonitrilgrundierung durchlaufen haben.

Dieses Volumen sollte zwei Milliliter betragen. Befestigen Sie die Synthesezelle an der Brennebene des eingehenden UV-Lichts. Bei der Bibliotheksvorbereitung eine zusätzliche Ein- und Auslassleitung an der Rückseite der Zelle befestigen und die hintere Kammer mit den zwei Millilitern der Betacarotinlösung füllen.

Starten Sie die Synthese, indem Sie zuerst in der WiCell-Software auf Ausführen klicken. Drücken Sie beim ersten Wartebefehl in der Auftragsdatei auf den DNA-Synthesizer. Nach der Synthese von regulären Mikroarrays trennen Sie die Zelle vom Synthesizer und zerlegen Sie die Zelle.

Verwenden Sie einen Diamantstift, um die Synthesenummer auf die Glasgleitet zu ätzen. Ätzen Sie die Zahl auf der nicht synthetisierten Fläche jeder Folie. Die Dias in 50 Milliliter Zentrifugenrohre übertragen und bis zur weiteren Verwendung in einem ausgetrockneten Bereich lagern.

Nach der Synthese von Bibliotheksmikroarrays zuerst die Betacarotin-Lösung aus der Kammer abtropfen lassen und dann die Kammer zweimal waschen, indem sie fünf Milliliter Methylenchlorid durchfließen, bevor sie abgelassen wird. Für DNA-Mikroarry-Deprotection, füllen Sie ein Glasglas mit 20 Milliliter Ethanol und 20 Milliliter EDA. Legen Sie die dna-only-Mikroarrays vertikal in das Glas, schließen Sie den Deckel und lassen Sie die Dias für zwei Stunden bei Raumtemperatur deprotectieren.

Nach zwei Stunden die Dias mit einer Pinzette abholen und gründlich mit doppelt destilliertem Wasser abspülen. Trocknen Sie die Dias in einer Mikroarray-Zentrifuge für einige Sekunden, bevor Sie sie in einem Trockenbaugerät lagern. Für den RNA-Mikroarray-Deprotection eine trockene Lösung von 20 Milliliter Triethylamin und 30 Milliliter Acetonitril in einem 50 Milliliter Zentrifugenrohr vorbereiten.

Übertragen Sie ein RNA-Mikroarray-Dia in das Zentrifugenrohr, schließen Sie den Deckel und wickeln Sie ihn mit Kunststoff-Dichtungsfolie. Schütteln Sie das Zentrifugenrohr auf einem Orbital-Shaker eine Stunde und 30 Minuten bei Raumtemperatur vorsichtig. Als nächstes entfernen Sie den Schlitten und waschen Sie zweimal mit 20 Milliliter trockenem Acetonitril, bevor Sie in einer Mikroarrayzentrifuge für ein paar Sekunden trocknen.

Nach dem ersten Deprotection-Schritt die RNA-Folie in die Hydrazinhydratlösung übertragen, den Deckel schließen und mit Kunststoff-Dichtungsfolie umwickeln. Nach zwei Stunden sanftem Schütteln auf einem Orbital-Shaker, entfernen Sie die Rutsche und waschen Sie sie zweimal mit 20 Milliliter trockenem Acetonitril. Dann trocknen Sie in einer Mikroarray-Zentrifuge für ein paar Sekunden.

Wenn das RNA-Mikroarray auch DNA-Nukleotide enthält, fahren Sie mit einem dritten Deprotection-Schritt fort. Fügen Sie das DNA/RNA-Mikroarray in eine 50-Milliliter-Röhre mit einer 1-zu-eins-ETHANOL-Lösung nach 5 min bei Raumtemperatur, entfernen Sie den Schlitten und waschen Sie das Mikroarray zweimal mit 20 Milliliter sterilem Wasser. Trocknen Sie die Rutsche in einer Mikroarray-Zentrifuge und lagern Sie sie in einem Trockenschrank.

In einem 1,5 Milliliter sterilen Mikrozentrifugenrohr bereiten Sie den Hybridisierungspuffer vor, der Cy3-markierte DNA enthält, wie im Textprotokoll beschrieben. Mischen und wirbeln Sie die Lösung. Legen Sie vorsichtig eine selbstklebende 300-Mikroliter-Hybridisierungskammer über den Synthesebereich auf jedem Schlitten und jeder Pipette in die Hybridisierungslösung.

Bedecken Sie die Löcher der Kammer mit Klebepunkten und wickeln Sie die gesamte Rutsche in Aluminiumfolie. Legen Sie den Mikroarray-Dia in den Hybridisierungsofen, decken Sie ihn ab und lassen Sie es zwei Stunden lang sanft bei der gewählten Hybridisierungstemperatur drehen. Nach zwei Stunden die Rutsche lösen, die Aluminiumfolie entfernen, die Hybridisierungslösung auspipetten und die Hybridisierungskammer vorsichtig abreißen.

Übertragen Sie die Dias in ein Zentrifugenrohr mit 30 Millilitern Nicht-Stringent Wash Buffer. Zwei Minuten bei Raumtemperatur kräftig schütteln. Das Dia in ein Zentrifugenrohr mit 30 Milliliter stringenten Waschpuffern geben und eine Minute lang kräftig schütteln.

Übertragen Sie schließlich das Dia in ein Zentrifugenrohr mit 30 Millilitern Final Wash Buffer. Schütteln Sie für ein paar Sekunden. Trocknen Sie den Schlitten in einer Mikroarray-Zentrifuge.

Platzieren Sie nun das trockene Mikroarray, den Synthesebereich nach unten, in den Diahalter des Mikroarray-Scanners. Um DNA-Bibliotheken zu deprotecten und zu spalten, tauchen Sie das Dia in die Spaltungslösung ein, in ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr. Schließen Sie das Rohr und wickeln Sie es mit Kunststoff-Dichtungsfolie, bevor Sie sich bei Raumtemperatur zwei Stunden lang sanft in einem Orbitalshaker drehen.

Nach zwei Stunden die Rutsche entfernen und zweimal mit 20 Millilitern sorgfältig trockenem Acetonitril waschen, bevor sie an der Luft trocknen. Mit einer Pipette 100 Mikroliter steriles Wasser über den nun erkennbaren Synthesebereich auftragen. Pipetdiere die Lösung ein paar Mal nach oben und unten, bevor sie in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr übertragen wird.

Wiederholen Sie den Vorgang und kombinieren Sie das Mikroarray-Eluat in das gleiche Rohr. Verdampfen Sie den Chip bis zur Trockenheit und lösen Sie ihn dann wieder in 10 Mikroliter nukleasefreier H2O auf. Hier sind die Ergebnisse eines Hybridisierungstests zu sehen, der an einem Mikroarray durchgeführt wurde, das die DNA- und RNA-Versionen einer 25mer-Sequenz enthält.

Der Scan in erscheint in einem grünen Format, das dem Anregungs- und Emissionsspektrum der Cy3-Fluoreszenz entspricht, wobei die Fluoreszenzintensität in beliebigen Einheiten aufgezeichnet wird. Die absoluten Fluoreszenzwerte zwischen den Experimenten sind signifikant variabel. Die Ergebnisse für drei unabhängige Synthesen mit den gleichen Fertigungsparametern und der gleichen postsynthetischen Handhabung werden angezeigt.

Die 25mer-DNA, wenn sie zu ihrem komplementären Cy3-markierten DNA-Strang hybridisiert wird, liefert Fluoreszenzsignale im Bereich von 20.000 bis 30.000, sehr selten über oder unter. Die 25mer-RNA, wenn sie mit der gleichen Cy3-markierten DNA-Ergänzung hybridisiert wird, wird Fluoreszenzintensitäten auf die entsprechenden Merkmale von 15.000 bis 20.000 geben. Die Fluoreszenzintensität der RNA/DNA-Duplexe sinkt jedoch gelegentlich unter 8 000, wenn die entsprechenden DNA/DNA-Duplexe noch im Bereich von 20.000 bis 30.000 fluoreszieren.

In solchen Fällen können die Ergebnisse für RNA als suboptimal angesehen werden. Wie bei jedem anderen RNA-basierten Experiment ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass RNA-Mikroarrays empfindlich auf Abbau reagieren und unter sterilen Bedingungen behandelt werden sollten. Nukleinsäurebibliotheken, die aus Mikroarrays gesammelt werden, können in der DNA- oder RNA-Sequenzierung sowie bei der Kodierung digitaler Informationen über DNA verwendet werden.

Der NED erzeugt ein intensives UV-Licht, das nicht direkt betrachtet werden sollte. Aus diesem Grund ist es ratsam, Schutzbrillen zu tragen, während das Gerät in Gebrauch ist.