We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).

HINWEIS: Befolgen Sie alle institutionellen Bestimmungen für die sichere Verwendung und Entsorgung von radioaktivem Material, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Verwendung persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhe, Schutzbrille, Kittel und entsprechende Acryl Schilde. HINWEIS: Der Standardpuffer besteht aus 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM Kaliumglutamat, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA (dieser Puffer wird bei einer 5-fach Konzentration vorgefertigten) und 0,3 mM jedes dNTP. T7 - Replikationsproteine werden gereinigt , wie beschrieben 8, 9, 10. Einzelsträngige DNA eine einzelne T7 Primase-Erkennungsstelle (5&#39;-GGGTC-3 &#39;, 5&#39;-GTGTC-3&#39;, 5&#39;-TGGTC-3 &#39;) enthält, kann aus einer Vielzahl von DNA-Synthese Unternehmen erworben werden (die Länge die ssDNA auf das Enzym der Wahl abhängen, für T7 - Primase, ein Pentamer der minimale Schablonenlänge für ein Volllängen - Primers zu synthetisieren 11, wie die kryptische C wesentlich ist jedoch, wenn der Primer durch die Polymerase verlängert werden soll, müssen zusätzliche Nucleotide am 3&#39; - Ende der Matrize vorhanden sein. Reaktionen werden durch die Zugabe einer Endkonzentration von 10 mM MgCl 2 und inkubiert bei 25 ° C eingeleitet. Manuelle Probenahme funktioniert gut für die Zeitpunkte von 5 Sekunden oder länger. Wenn Zeitpunkten kürzer ist als die erforderlich sind, wird empfohlen, ein rapid-quench Strömungs Instrument zu verwenden, um genaue Daten zu erhalten. 1. Multiple-Umsatz Primer Synthesereaktion durch manuelle Probenahme <ol><li> Vor dem Start des Experiments Aliquot 2 ul Formamid-Farbstoff-Puffer (93% (v / v) Formamid, 50 mM EDTA, 0,01% Xylolcyanol und 0,01% Bromphenol blau) in 8 1,5 ml Polypropylenröhrchen. Im Allgemeinen ist die Anzahl der Rohre gleich der Anzahl von Zeitpunkten analysiert. </li><li> Bereiten Sie eine 20 &amp; mgr; l Mischung aus 1x Puffer, 0,1 mM ATP und CTP, 0,25 mCi / ml [α- 32 P] CTP, 0,1 uM ssDNA Vorlage, und 0,1 uM gp4 (als Hexamer Konzentration ausgedrückt - 0,6 &amp; mgr; M-Monomer). </li><li> Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Entfernen 2 &amp; mgr; l der Mischung ein Pipettiergerät und mischen sich mit 2 ul Formamid-Farbstoff Puffer in einem 1,5 ml-Röhrchen in Schritt unter Verwendung von 1,1 für die keine Reaktionskontrolle (Zeit Null). </li><li> Fügen Sie 2 ul 0,1 M MgCl 2 auf die Reaktionsmischung (auf eine Endkonzentration von 10 mM). </li><li> zurückziehen manuell 2 &amp; mgr; l-Proben der Reaktionsmischungen eine Pipette in 10 s Intervallen und mischen sich mit Formamid Farbstoff vordosiert in 1,5 ml-Röhrchen, hergestellt in Schritt 1.1 verwendet. </li><li> Wärme Proben bei 95 ° C für 5 min in einem Heizblock. </li><li> Laden Aliquots der Proben auf einem denaturierenden Gel. Die kleinen tetraribonucleotide Primer Produkte von der T7-Primase synthetisiert sind auf einer 0,4 mm dicken 25% Acrylamid gelöst: Bisacrylamid (19: 1), 3 M Harnstoff, 1x TBE (100 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA). </li><li> Legen gesamte Gel auf chromatograPHY Papier und Abdeckung mit Plastikfolie. Trockenes Gel mit einem Gel-Trockner. </li><li> Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe der Rest des Reaktionsgemisches und Spot das gleiche Volumen auf dem Gel auf Chromatographie Papier eingelegt, das heißt, vor Ort 4 ul der Verdünnung , wenn 4 ul der Probe geladen wurden. ANMERKUNG: Diese als Standardkurve dient der Konzentration der Produkte während der Reaktion gebildet zu bestimmen. Zum Beispiel fünffache Verdünnungen TE Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) funktionieren gut, eine Reihe von 01.25 Spanning bis 1: 15.625 (5 2 -5 6), aber die Verdünnungen sollten in Abhängigkeit von dem Aktivitätsniveau eingestellt werden. </li><li> Expose trockenes Gel und Standard mit einem Phosporimager Bildschirm. Quantifizierung der Radioaktivität in der Verdünnungsreihe und konstruieren als eine Standardkurve 8 beschrieben, 12 HINWEIS: Inclusion von T7 DNA - Polymerase zu der Reaktionsmischung ermöglicht es , zu EXAMine die Verwendung von tetraribonucleotide Primer durch dieses Enzym. Optimalerweise sollte die Polymerase-Konzentration werden Sättigen der Interpretation der Daten zu vereinfachen. Eine Polymerase-Konzentration von 0,4 &amp; mgr; M oder höher gute Ergebnisse. Zusätzlich kann die Wirkung von anderen Proteinen, wie beispielsweise Einzelstrang-DNA-bindende Proteine, entweder auf der Primersynthese oder nacheilend Stranginitiations kann auf diese Weise untersucht werden. </li></ol> 2. Multiple-Umsatz Primer Synthesereaktion einem Rapid-Quench Einsatz des Instruments <ol><li> Herstellung von Reaktionsgemischen <ol><li> Bereiten 400 ul Lösung A, enthaltend 1x Puffer, 0,2 &amp; mgr; M gp4 Hexamer, 0,2 uM ssDNA Vorlage, 0,6 mM dNTPs, 0,2 mM ATP und CTP (einschließlich 0,5 mCi / ml [α- 32 P] CTP. </li><li> Bereiten 400 ul Lösung B, enthaltend 1x Puffer und 20 mM MgCl 2. </li></ol></li><li> Der Betrieb von S-Quench Fluss Instrument <ol><li> Schalten Sie Rapid-Quench-Flow Instruments; nachdem das Hauptmenü angezeigt wird, geben 7 auf dem Instrument Tastatur, um die Spritze Fahrer in die Ausgangsposition zu bewegen. </li><li> Offene Pufferspritzenposition auf &quot;LOAD&quot;. </li></ol></li><li> Ladepuffer Spritzen <ol><li> Bringen Sie einen 10-ml-Spritze mit dem Antriebs Spritze Port mit Puffer. Ändern Spritze Knopfposition auf &quot;LOAD&quot;. </li><li> Unter Verwendung von 10 ml Spritzen, füllen Instrument Pufferbehälter A und B mit 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA und Spritze C mit Quench-Lösung (250 mM EDTA und 0,2% SDS) zu füllen. Entfernen Sie Luftblasen durch Drücken Kolben, die in die und aus. </li><li> Ändern Knopfpositionen auf &quot;FIRE&quot;. Typ-2-Position der Spritze Fahrer bar einzustellen. Drücken Sie &quot;EINSTELLUNG VERRINGERN&quot;, um die Spritze zu senken, bis Puffer aus der Austrittsschleife kommt: (7-geht kontinuierlich; 8-großen Schritt nach unten; 9-kleiner Schritt nach unten). Geben Sie &quot;ESC&quot;, um in das Hauptmenü zurückzukehren. </li></ol></li><li> Wash Schlauch <ol><li> AttACH Ausfahrt Linie Vakuum. Ändern Probe Knöpfe auf &quot;flush&quot;. Schließen Puffer Spritze durch die Knöpfe in die horizontale Position. Schalten Sie Vakuum und tauchen Sie die 2 bündig Schleifen in H 2 O für 10 s, dann tauchen in MeOH für 10 s. Trockenschleifen von Luft für ~ 15 s saugen, oder bis es trocken ist. </li></ol></li><li> Laden Proben <ol><li> Ändern Probe Knopfposition auf &quot;LOAD&quot;. Legen Sie die Lösung A in 1-ml-Spritze. Stecken Spritze in einem der Probenladestationen. Wiederholen Sie dies für die Lösung B, und legen Sie in die entgegengesetzte Probenladeöffnung. </li></ol></li><li> Sammlung von Zeitpunkten <ol><li> Auf dem Hauptmenü, geben Sie 1 für Quench-Flow-Lauf. Geben Sie Reaktionszeit (s) ein und drücken Sie &quot;ENTER&quot;. Die Reaktionsschleife Nummer verwendet wird angezeigt. Wechseln Sie auf die gewünschte Reaktionsschleife. Wiederholen Waschvorgang in Schritt 2.2.4. </li><li> Drehen Probe Knöpfe auf &quot;LOAD&quot;. Last Reaktion mischt in Probenschleifen bis kurz außerhalb des zentralen Mischraum. Drehen Sie alle Regler auf &quot;FIRE &quot;. Bestätigen Sie, dass alle Knöpfe in der richtigen Position sind. </li><li> Legen Sie 1,5 ml-Röhrchen auf Ende der Ausfahrt Schleife. Drücken Sie auf &quot;GO&quot; um die Reaktion auszuführen. Wiederholen Waschvorgang in Schritt 2.2.4. Nachladepuffer Spritzen A und B, bis sie den Fahrer getroffen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2.6.2-2.2.6.3 für jeden gewünschten Zeitpunkt. Ausnahme: Legen Sie keine Lösung , um die Start - Reagenz (dh MgCl 2 in diesem Fall) , wenn das Abschrecken des Null - Zeit-Punkt - Regelung enthält. </li><li> Wenn die Proben fertig zu sammeln, geben Sie &quot;ESC&quot; zum Hauptmenü zurückzukehren. Drücken Sie &quot;7&quot; Puffer Spritze Fahrer in seine Ausgangsposition zurückzukehren. </li></ol></li><li> Instrument clean-up <ol><li> Entfernen Reaktionsgemisch Spritzen. Drehen Probenladeknopf auf &quot;LOAD&quot; Position. Im Vakuum waschen jede Probenschleife mit 10 ml 0,2 N NaOH, gefolgt von 10 ml 0,3 NH 3 PO 4 und 10 ml MeOH. </li><li> Drehen Sie Spritze Knöpfe auf &quot;LOAD&quot; Position. Drücken Sie auf allen 3 syringe Plunger Reaktion und Quench-Puffer abzurufen. Waschen Sie die Spritzen mit 5 ml H 2 O mindestens zweimal. </li><li> Füllen Sie Spritzen erneut mit 5 ml H 2 O und drehen Knöpfe auf &quot;FIRE&quot; Position. Ändern Sie Knopfpositionen und schalten Sie Vakuum zu H 2 O Flush , wie in Schritt 2.2.4 entfernen. Schalten Sie das Gerät ab. HINWEIS: Die Produkte werden in Schritten von 1,7 bis 1,12 , wie beschrieben analysiert. Zusätzlich Polymerase T7 DNA und andere Replikationsproteine ​​können in der Reaktionsmischung hinzugefügt werden, deren Wirkung auf der Primersynthese oder Erweiterung zu analysieren. </li></ol></li></ol> 3. Single-Umsatz Primer Synthesereaktion HINWEIS: Single-Umsatz Primersynthese / Extension - Assays sind in ähnlicher Weise zu Mehrumsatz Reaktionen durchgeführt, mit einigen großen Unterschiede: diese Tests folgen die Umwandlung von radiomarkiertem ATP in Primer oder Verlängerungsprodukte, aber die Konzentration von Substraten und Proteinen sind consideraBly höher. Darüber hinaus, um Millisekundenauflösung zu ermöglichen Analyse der Primer-Synthesereaktion zu erreichen, muss man eine schnelle Abschrecken Strömungsmaschine zu nutzen. <ol><li> Herstellung der Reaktionsgemische. <ol><li> Bereiten Sie 400 ul der Lösung A, bestehend aus 1x Puffer, 3 uM gp4 Hexamer, 6 uM ssDNA - Vorlage, 0,6 mM dNTPs, 1 mM CTP und 2 nM [γ- 32 P] ATP. Bereiten 400 ul Lösung B, enthaltend 1x Puffer und 20 mM MgCl 2. </li></ol></li><li> Schneller-Quench Flow - Betrieb <ol><li> Führen Sie Reaktionen wie in Schritt 2.2 beschrieben. Falls gewünscht, fügen T7 DNA-Polymerase oder T7 einzelsträngige DNA-Bindungsprotein in einer Konzentration von 15 uM und 20 uM, respectively. In diesem Fall sammeln sich die Verlängerungsprodukte zu einem Zeitpunkt Regime, das für die manuelle Probennahme der Reaktions ermöglicht. </li></ol></li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Fit Produkt Verlaufskurven auf nicht-lineare LeastQuadrate Modelle im Handel erhältliche Software, die der kleinsten Quadrate passt und / oder numerische Integration verwendet wird. Die Einzelheiten der Operation wird mit der Software verwendet wird, variieren, aber unterhalb sind verallgemeinerte Formen der Gleichungen verwendet, um die Daten passen. </li><li> Bestimmen die Rate der Produktbildung mehrerer Umsatz Primer Synthesereaktionen von Anpassungskurven in eine lineare Gleichung für den Fortschritt. Bei wesentlichen Krümmung ist, verwenden Sie die Anfangsgeschwindigkeit Methode 13, 14 durch die Daten in eine Single-Exponentialfunktion passend: y = A (e - k t), wobei y die Produktkonzentration ist, A die Reaktions Amplitude, k die beobachtete Geschwindigkeitskonstante, t die Zeit in Sekunden. Die Steigung der Tangente zum Zeitpunkt = 0 ist die Anfangsgeschwindigkeit. HINWEIS: Fit pre-steady state Primer Synthesereaktionen auf eine lineare Gleichung oder dem Ober steady state Burst Gleichung y = A (e - k burst t) + Rate ss t, wobei A die Reaktions Amplitude, k Burst ist die beobachtete Geschwindigkeitskonstante für die Pre-Steady - State - Burst - Rate ss ist die Steady-State - Rate ss = k cat [Enzym]), t die Zeit , in Sekunden. Fit Einzel Umsatz Primer Synthesereaktionen Verlaufskurven auf einer Single-Exponentialfunktion y = A (e - k t). Im Falle von gp4, passen die Daten durch numerische Integration 15 zu einem Modell mit drei NTP Kondensationsschritten, wobei jeder Zwischen in Gleichgewicht mit dem Enzym ist, im Handel erhältliche Software. </li></ol>

<ol>
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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG.">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).</li><li>Sanyal, G., Doig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+DNA+replication+enzymes+as+targets+for+antibacterial+drug+discovery.">Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Der wichtigste Faktor, diese Experimente in der Durchführung ist die Verfügbarkeit von hoch aktiven gereinigten Enzyms. Während unserer Arbeit mit gp4 zum Beispiel haben wir festgestellt, dass die Lagerung des gereinigten Enzyms in Puffer (20 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT), enthaltend 50% Glycerin bei -20 ° C führt zu einer Reduktion in die spezifische Aktivität des Präparats über einige Monate. Daher wir nun Flash-freeze kleinen Aliquots von gereinigtem gp4 in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM Na...

Die Replikation der DNA ist ein konserviertes Merkmal aller zellulären Lebens. Während die Identität und Anzahl der Replikationskomponenten in weiten Grenzen variieren, werden die allgemeinen Mechanismen für die Evolution 1 geteilt. Hier beschreiben wir Gelbasis, diskontinuierliche kinetischen Experimenten, radioaktiven Substraten, dem Ziel, das Verständnis der Kinetik der nacheilenden Strang - DNA - Synthese in vitro durch Komponenten des T7 replisome. Die Replikationsmaschinerie des Bakteriophagen T7 ist sehr einfach, die aus nur vier Proteine (die DNA - Polymerase, GP5 und dessen Prozessivitätsfaktor, E. coli - Thioredoxin, die bifunktionellen Primase-Helikase gp4 und die einzelsträngige DNA - Bindungsprotein, GP2. 5) 2. Diese Funktion macht es ein attraktives Modellsystem die konservierten biochemischen Mechanismen der DNA-Replikation beteiligt zu studieren. Ein besonderer Schwerpunkt liegt auf der Bildung von Ribonukleotid Primer durch T7-DNA-Primase platziert, ein critical Schritt bei der Initiation der DNA-Synthese. Darüber hinaus kann man auch die Verwendung dieser Primer durch T7-DNA-Polymerase oder andere Replikationsproteine ​​zu untersuchen, indem sie in der Reaktionsmischung einschließlich. Die T7-Primase-Helikase, gp4, katalysiert die Bildung von Primer für DNA-Synthese an spezifische DNA-Sequenzen Primase-Erkennungsstellen oder PRS genannt, (5&#39;-GTC-3 &#39;). Das Cytosin in der PRS ist kryptisch, es für die Anerkennung der Website von wesentlicher Bedeutung ist, aber es wird nicht in das Produkt 3 kopiert. Der erste Schritt bei der Primersynthese durch gp4 beinhaltet die Bildung des Dinucleotid pppAC, die dann zu einem Trimer verlängert wird, und schließlich zu funktionellen Tetranukleotid Primern pppACCC, pppACCA oder pppACAC Abhängigkeit von der Sequenz in der Template - 4. Diese Primer können dann von T7 DNA - Polymerase verwendet werden , um DNA - Synthese zu initiieren, das auch ein gp4 unterstütztes Verfahren 5, 6. In dieser Hinsicht ist die PrimaseDomäne stabilisiert die extrem kurze tetraribonucleotides mit der Vorlage ihrer Dissoziation zu verhindern, greift DNA - Polymerase tatsächlich in einer Weise , um die Primer / Matrize in der Polymerase - aktiven Stelle 7 sichern. Diese Schritte (RNA-Primer-Synthese, Primer-Handoff-Polymerase und Verlängerung) werden in mehreren Zyklen wiederholt, um die nacheilende Strang zu replizieren und mit der Replikation des führenden Stranges koordiniert werden. Die Assays hier beschrieben sind, sind sehr empfindlich und kann in einem moderaten Zeitrahmen durchgeführt werden. Sie sind jedoch mit relativ niedrigem Durchsatz und großer Sorgfalt muss bei der Nutzung und Entsorgung von radioaktiven Materialien ausgeübt werden. In Abhängigkeit von der Geschwindigkeit, mit der die Reaktion abläuft, könnte man ein schnelles Abschrecken Instrument einsetzen, um Proben auf Zeitskalen zugänglich für aussagekräftige Analyse der Kurse Reaktionszeit erreichen entweder die stationäre oder die Pre-stabilen Zustand. Vor kurzem haben wir verwendeten Assays hier beschriebenen evidenc zur Verfügung zu stellene die Bedeutung der Primer Freisetzung aus der Primase-Domäne von gp4 in der Einleitung von Okazaki-Fragmenten. Zusätzlich fanden wir Beweise für eine regulatorische Rolle für die T7 einzelsträngige DNA - Bindungsprotein, gp2.5, bei der Förderung der effizienten Primer Bildung und Nutzung 8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="584">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;"> 
			Tris pre-set crystals 
			pH 7.5</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">T4128&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:83px;">&#160;SIGMA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">93362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">G1501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:83px;">Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">5958-04</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1,4-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:83px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">F780-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:83px;">MP Biomedicals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">811030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate</td>
			<td style="width:83px;">Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">4931-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">[&#945;-32P] CTP</td>
			<td style="width:83px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU508H</td>
			<td>radioactive, take protective measures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">[&#947;-32P] ATP</td>
			<td style="width:83px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU502A</td>
			<td>radioactive, take protective measures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">77100</td>
			<td>four dNTPs part of set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 mM ATP and CTP</td>
			<td style="width:83px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">RN02825</td>
			<td>part of NTP set</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">ssDNA constructs</td>
			<td style="width:83px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>custom sequences&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">methanol&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">3017-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">formamide</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bromophenol blue</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">B8026&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cylene xyanol&#160;</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">X4126&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acrylamide</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">A9099</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">M7279&#160;</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:83px;">Boston Bioproducts</td>
			<td style="width:119px;">P-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:83px;">Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rapid Quench-Flow Instrument&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Kintek Corp.</td>
			<td style="width:119px;">RQF-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kintek Explorer</td>
			<td style="width:83px;">Kintek Corp.</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kaleidagraph&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetics of lagging-strand dna synthesis in vitro by the bacteriophage t7 replication proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Die Ergebnisse in Figur 1A gezeigt sind, wurden wie in Schritt 1 des Protokolls beschrieben erhalten, dh durch eine manuell Primer - Synthesereaktion durch gp4 unter mehreren Bedingungen Umsatz katalysierten Abtasten. Hier kann eine Reihe von Produkten nach der Gelelektrophorese unter Verwendung von CTP mit 32 P an der α-Position in Primer - Synthesereaktionen (Abbildung 1A) markiert beobachtet werden. Die markierte ...

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Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Kinetik der Verzögerungs-DNA-Synthese<em&gt; In Vitro</em&gt; Von den Bakteriophagen T7 Replikationsproteine

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

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Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Replication

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7.3K Aufrufe.  Harvard Medical School. We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7. 

Serie: Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process requires multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) and a series of transcription factors that act to modulate the activity of RNAP during gene expression. Sequencing gel electrophoresis of radiolabeled transcripts is used to provide detailed mechanistic information on how transcription proceeds and what parameters can affect it. In this paper we describe the protocol to study how the essential elongation factor NusA regulates transcriptional pausing, as well as a method to identify an antibacterial agent targeting transcription initiation through inhibition of RNAP holoenzyme formation. These methods can be used a as platform for the development of additional approaches to explore the mechanism of action of the transcription factors which still remain unclear, as well as new antibacterial agents targeting transcription which is an underutilized drug target in antibiotic research and development.

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

In - vitro - Transkriptionsassays und ihre Anwendung in der Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Forschung

Genetik

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ Labeling der mitochondrialen DNA - Replikation in Drosophila Adult Ovarien von EdU Anfärben

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Genomweite Bestimmung der Mammalian Replication-Timing von Inhaltsmessung DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing biosynthetic pathways. In this manuscript, the use of a highly effective system for the construction of multigene synthetic operons under the control of an inducible T7 RNA polymerase is described. This system allows many genes to be expressed simultaneously from one plasmid. Here, a set of four related vectors, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K, and pMGX-hisK, with either the ampicillin or kanamycin resistance selectable marker (A and K) and either possessing or lacking an N-terminal hexahistidine tag (his) are disclosed. Detailed protocols for the construction of synthetic operons using this vector system are provided along with the corresponding data, showing that a pMGX-based system containing five genes can be readily constructed and used to produce all five encoded proteins in Escherichia coli. This system and protocol enables researchers to routinely express complex multi-component modules and pathways in E. coli.

This study describes methods for the T7-mediated co-expression of multiple genes from a single plasmid in Escherichia coli using the pMGX plasmid system.

Induzierbares T7-RNA-Polymerase-vermitteltes Multigen-Expressionssystem, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

Mit In-vitro- und In der Zelle Form zu untersuchen, kleines Molekül induzierte Pre-mRNA Strukturveränderungen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite coupling reactions with the precision and density of UV light reflected from micrometer-sized mirrors. Photolithography yields microarrays that can accommodate from hundreds of thousands up to several million different DNA sequences, 100-nt or longer, in only a few hours. With this very large sequence space, microarrays are ideal platforms for exploring the mechanisms of nucleic acid&#183;ligand interactions, which are particularly relevant in the case of RNA. We recently reported on the preparation of a new set of RNA phosphoramidites compatible with in situ photolithography and which were subsequently used to grow RNA oligonucleotides, homopolymers as well as mixed-base sequences. Here, we illustrate in detail the process of RNA microarray fabrication, from the experimental design, to instrumental setup, array synthesis, deprotection and final hybridization assay using a template 25mer sequence containing all four bases as an example. In parallel, we go beyond hybridization-based experiments and exploit microarray photolithography as an inexpensive gateway to complex nucleic acid libraries. To do so, high-density DNA microarrays are fabricated on a base-sensitive monomer that allows the DNA to be conveniently cleaved and retrieved after synthesis and deprotection. The fabrication protocol is optimized so as to limit the number of synthetic errors and to that effect, a layer of &#946;-carotene solution is introduced to absorb UV photons that may otherwise reflect back onto the synthesis substrates. We describe in a step-by-step manner the complete process of library preparation, from design to cleavage and quantification.

In this article, we present and discuss new developments in the synthesis and applications of nucleic acid microarrays fabricated in situ. Specifically, we show how the protocols for DNA synthesis can be extended to RNA and how microarrays can be used to create retrievable nucleic acid libraries.

High-Density DNA und RNA Mikroarrays - Photolithographische Synthese, Hybridisierung und Vorbereitung von großen Nukleinsäurebibliotheken

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other environmental stressors. Use of the comet assay in regulatory testing for genotoxic potential in rodents has been driven by adoption of an Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline in 2014. Comet assay slides are typically prepared from fresh tissue at the time of necropsy; however, freezing tissue samples can avoid logistical challenges associated with simultaneous preparation of slides from multiple organs per animal and from many animals per study. Freezing also enables shipping samples from the exposure facility to a different laboratory for analysis, and storage of frozen tissue facilitates deferring a decision to generate DNA damage data for a given organ. The alkaline comet assay is useful for detecting exposure-related DNA double- and single-strand breaks, alkali-labile lesions, and strand breaks associated with incomplete DNA excision repair. However, DNA damage can also result from mechanical shearing or improper sample processing procedures, confounding the results of the assay. Reproducibility in collection and processing of tissue samples during necropsies may be difficult to control due to fluctuating laboratory personnel with varying levels of experience in harvesting tissues for the comet assay. Enhancing consistency through refresher training or deployment of mobile units staffed with experienced laboratory personnel is costly and may not always be feasible. To optimize consistent generation of high quality samples for comet assay analysis, a method for homogenizing flash frozen cubes of tissue using a customized tissue mincing device was evaluated. Samples prepared for the comet assay by this method compared favorably in quality to fresh and frozen tissue samples prepared by mincing during necropsy. Moreover, low baseline DNA damage was measured in cells from frozen cubes of tissue following prolonged storage.

This protocol describes several procedures for preparing high quality frozen tissue samples at the time of necropsy for use in the comet assay to assess DNA damage: 1) minced tissue, 2) scraped epithelial cells from the gastrointestinal tract, and 3) cubed tissue samples, requiring homogenization using a tissue mincing device.

Verwendung von gefrorenem Gewebe im Kometentest zur Bewertung von DNA-Schäden

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...