Dieses Protokoll ermöglicht es, verschiedene Arten von Kulturen zu sehen und ihre Wechselwirkungen mit extrazellulären Matrix zu beobachten. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass die Matrix, die Sie erhalten, durch Fibroblasten regeneriert wird und sie ganz ähnlich zu denen sein wird, die in vivo erzeugt werden. Wir glauben, dass diese Krankheit irrelevant ist, wenn Man Fibroblasten aus Backgerichten bezieht.
Das Aufstellen einer Matrix aus diesen Zellen könnte uns erhellen, wie sie sich beispielsweise auf die anhaltende Situation auswirken kann. Diese Methoden können beispielsweise auch auf physikalische Studien auf Überlebende aus Matrix-Eigenschaften angewendet werden. Visualisierung dieses Protokolls ist es wichtig, eine Pipettiertechnik der Schritte zu beachten, die Sie regentieren müssen.
Wenn Sie diese Methoden zum ersten Mal ausprobieren, wird es wahrscheinlich mehr Zeit als erwartet dauern. Unser Rat ist es, so viel wie möglich im Voraus vorzubereiten und Dauerperioden zu verwenden, um sich auf die nächsten Schritte vorzubereiten. Beginnen Sie mit der Zubereitung von 0,2% Gelatine, 1%glutaraldehyd und einer molaren Ethanolamin-Lösung nach den Manuskriptanweisungen.
Stellen Sie sicher, dass Sie jede Lösung vor der Verwendung über einen 0,22-Mikrometer-Filter ausführen. Als nächstes Ascorbinsäure und Lysepuffer vorbereiten. Verdünnen Sie den PBS-Stiftstrep, wie im Manuskript beschrieben, und bereiten Sie DMEM mit 10%FBS vor.
Bereiten Sie wärmedenaturierte 2%BSA vor, indem Sie 2 Gramm BSA zu 100 Milliliter sterilem Wasser hinzufügen und es in einem kochenden Wasserbad sieben Minuten lang erwärmen. Dann, ergänzen FBS mit Penicillin, Streptomycin, Gentamicin, und Amphotericin B.Culture rekombinante Telomere transfizierte menschliche Vorhaut Fibroblasten und DMEM mit 10%FBS und hielt sie bei 37 Grad Celsius und 5%Kohlendioxid. Um die primäre Fibroblastenkultur zu etablieren, schneiden Sie die Gewebeproben in kleine Stücke von etwa zwei bis drei Millilitern würfeln und säen Sie sie in FPS mit einer hohen Konzentration von Antibiotika.
Wenn die ersten Fibroblasten erscheinen, ersetzen Sie das Medium durch FBM-Medium für die Zellerhaltung. Fügen Sie zwei Milliliter 0,2% Gelatinelösung zu jedem Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte hinzu und inkubieren Sie sie für eine Stunde für 37 Grad Celsius oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation die Gelatine ansaugen und mit zwei Millilitern PBS gut waschen.
Fügen Sie zwei Milliliter von 1% Glutaraldehyd zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für dreißig Minuten, die die Gelatine miteinander vernetzen. Das Glutaraldehyd ansaugen und die Brunnen in zwei Milliliter PBS fünf Minuten waschen. Um das restliche Glutaraldehyd zu blockieren, fügen Sie zwei Milliliter eines Molarenethanolamins hinzu und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für dreißig Minuten.
Aspirieren Sie das Ethanolamin und wiederholen Sie die Wähbe mit PBS. Fügen Sie einen Milliliter DMEM mit 10%FPS hinzu. Wenn das Medium sofort rosa wird, entfernen Sie es, waschen Sie die Brunnen einmal mit zwei Milliliter PBS und fügen Sie einen weiteren Milliliter DMEM hinzu.
Samen Sie einen Milliliter Fibroblastsuspension mit 5 x 10 zu den fünften Zellen in jedem Brunnen und Kultur der Zellen, bis 100% Zusammenfluss erreicht ist. Entfernen Sie dann das Medium und ersetzen Sie es durch DMEM mit 10%FBS und 50 Mikrogramm pro Milliliter Ascorbinsäure. Ersetzen Sie das Medium alle zwei Tage für sechs Tage.
Zwei Tage nach der letzten Ascorbinsäurebehandlung das Medium entfernen und die Brunnen mit zwei Millilitern PBS waschen. Nach dem Waschen langsam einen Milliliter vorgewärmten Lysepuffer hinzufügen und die Platte bei Raumtemperatur für fünf bis zehn Minuten bebrüten, bis die Fibroblasten lysiert sind. Ohne den Lysepuffer zu entfernen, fügen Sie vorsichtig zwei Milliliter PBS zu jedem Brunnen hinzu und saugen Sie dann etwa 2,5 Milliliter an.
Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal für insgesamt drei Wähbe. Nach der letzten Wäsche zwei Milliliter PBS mit Stift-Strep hinzufügen. Versiegeln Sie die Platte mit Folie und halten Sie sie bis zu drei Monate bei vier Grad Celsius.
Wachsen Sie HUVEC-Zellen und EMB-2 mit 2%FBS bis zum maximalen Zusammenfluss. Dann ersetzen Sie das Medium durch EBM-2 ohne FBS für acht Stunden. Um die Matrizen für die Zellaussaat vorzubereiten, entfernen Sie sie aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie bei Raumtemperatur für eine Stunde.
Blockieren Sie die Matrizen, indem Sie zwei Milliliter wärmedenaturierte 2%BSA hinzufügen und sie bei 37 Grad Celsius für eine Stunde inkubieren. Dann die BSA ansaugen und mit zwei Millilitern PBS waschen. Samen 2 x 10 bis die fünften HUVEC-Zellen an jedem Brunnen der Platte, der mit Fibroblasten-abgeleiteten Matrizen beschichtet ist.
Inkubieren Sie die Zellen 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und untersuchen Sie dann die röhrenartigen Strukturen unter einem Standard-Lichtfeldmikroskop bei 20-40-facher Vergrößerung. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Auswirkungen der PDGF-Behandlung auf die Fibroblasten-abgeleitete Matrixbildung zu untersuchen. Die BGH dritten Fibroblasten, die mit PDGF inkubiert wurden, zeigten eine stärker ausgerichtete Zellverteilung in Matrizen als die ohne PDGF inkubierten.
Die Expression von Kollagen 1 und Fibronectin-Protein wurde in Matrizen erhöht, die aus PDGF-stimulierten Fibroblasten gewonnen wurden, und folglich wurde die Matrixdicke erhöht. Darüber hinaus zeigen Richtungshistogramme, dass Kollagen 1 und Fibronectin parallele Muster aufweisen. Wenn HUVEC-Zellen auf dezellularisierte Matrizen aus PDGF-stimulierten Fibroblasten gesät wurden, entwickelten sie mehr kapillarartige Strukturen als unter keinen stimulierten Bedingungen.
Bestätigen, dass Matrizen aus PDGF-BB stimulierten Fibroblasten die Aktivierung von Endothelzellen fördern. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Lösungen im Voraus vorzubereiten und sicherzustellen, dass die Zellen vor dem Start bereit sind. Neben Endothelzellen können Auch Matrizen mit Epithelzellen gesät werden und die Reaktion auf äußere Faktoren wie Zustand in Medien oder zytotoxische natoxischen Medikamenten beobachtet werden.
Die Erzeugung von extrazellulären Matrix ist entscheidend für die Entwicklung von Tumor-Makroumgebungsexperimenten.
