Unser Protokoll bewertet die Auswirkungen von myeloiden suppressorischen Suppressorzellen und die tumorassoziierten Makrophagen bei t-zellinduzierter Tumorzellapoptose. Neben der Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen potenzieller therapeutischer Interventionen. Dieses Protokoll evaluiert direkt t-zellinduzierte Tumorzellapoptose mit hoher Empfindlichkeit und ermöglicht Längsinalanalysen und Bildgebung von Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen.
Die Wirksamkeit von Checkpoint-Hemmern wird am besten durch tumorinfiltrierende myeloische Zellen bei bestimmten Tumortypen betrachtet. Diese Technik könnte zur Identifizierung neuartiger Therapien für diese Tumoren führen. Diese Methode könnte nicht nur die Krebsimmunologieforschung voranbringen, sondern potenziell auch Einblicke in die Immunschwäche- und Autoimmunerkrankungen geben.
Zur Aktivierung und Erweiterung von Milz-isolierten CD8-positiven T-Zellen zunächst einmal 10 zu den fünften CD8-positiven T-Zellen in 50 Mikrolitern E-DMEM in einzelne Bohrungen einer 96-Well-U-Bodenplatte. Als nächstes fügen Sie ein mal 10 zu den fünften Suppressorzellen in 50 Mikroliter e-DMEM oder 50 Mikroliter E-DMEM allein in jeden Brunnen von T-Zellen. Dann 50 Mikroliter frisch zubereitetes Aktivierungsmedium und 50 Mikroliter E-DMEM mit oder ohne testreagenzien in die entsprechenden Brunnen geben.
Und legen Sie die Platte in einem 37-Grad-Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator mit 95% Luftfeuchtigkeit für vier Tage. Um eine voraktivierte CD8-positive T-Zell-Zielzell-Kokultur einzurichten, fügen Sie zunächst 30 Mikroliter 1-bis-100-verdünnter wachstumsfaktorreduzierter löslicher Kellermembranmatrix in die entsprechenden Brunnen einer 96-Well-Flachbodenplatte, die für die Mikroskopie geeignet ist, hinzuzufügen. Schütteln Sie die Platte, um die Matrix gleichmäßig zu verteilen, und legen Sie die Platte mindestens eine Stunde lang im Zellkultur-Inkubator.
Während die Platte ausgeglichen ist, bereiten Sie die Zielzellen vor. Das Medium ansaugen, mit PBS waschen und einen Milliliter 05%Trypsin-EDTA bei Raumtemperatur für eine Minute hinzufügen. Fügen Sie neun Milliliter DMEM hinzu, ergänzt durch sanftes Pipettieren mit fetalem Rinderserum, und übertragen Sie die dissoziierten Zellen in Röhren.
Nach dem Zentrieren der Zellen, setzen Sie die Palette in 500 Mikroliter E-DMEM. Filtern Sie die resuspendierten Zellen durch ein Zellsieb, und zählen Sie die lebenden Zellen. Dann stellen Sie die Dichte auf viermal 10 auf die vierte Zielzelle pro Milliliter in frischem E-DMEM auf Eis ein.
Als nächstes pipette die voraktivierten CD8-positiven T-Zellen ein paar Mal, um die Zellen in eine einzelne Zellsuspension wieder auszusetzen, und übertragen Sie die schwimmenden T-Zellen in eine 1,5-Milliliter-Röhre pro Bedingung. Sammeln Sie alle verbleibenden Zellen mit 200 Mikroliter PBS pro Brunnen, übertragen Sie die Washes in die entsprechenden 1,5-Milliliter-Röhren und Zentrifugen. Aspirieren Sie das Medium und fügen Sie jedem Rohr einen Milliliter E-DMEM für die Zentrifugation hinzu.
Nach der Zentrifugation die Pellets in 100 Mikroliter frischer E-DMEM pro Tube wieder aufsetzen. Passen Sie die Zellen in jedem Rohr nach der Zählung auf eine Dichte von 1,6 mal 10 bis zu den fünften voraktivierten CD8-positiven T-Zellen pro Milliliter Medium an, und legen Sie die Zellen auf Eis. Wenn die Zellen fertig sind, aspirieren Sie die Kellermembranmatrix aus jedem Brunnen der 96-Well-Mikroskopieplatte und fügen Sie 50 Mikroliter Zielzellen zu einzelnen Brunnen innerhalb der inneren 60 Brunnen der Platte mit Mischen hinzu.
Fügen Sie 25 Mikroliter E-DMEM, ergänzt mit viermal 10, bis zur dritten Einheit pro Milliliter IL2 und 10-Mikromol-fluorogenem Caspase-3-Substrat in die entsprechenden Brunnen. Dann 25 Mikroliter voraktivierte CD8-positive T-Zellen in die entsprechenden Brunnen geben. Und schließlich fügen Sie E-DMEM zu den entsprechenden Brunnen hinzu, um ein Gesamtvolumen von bis zu 100 Mikrolitern zu machen.
Fügen Sie 200 Mikroliter PBS oder steriles Wasser in alle leeren Brunnen. Schütteln Sie die Platte, und lassen Sie die Platte auf einer flachen Oberfläche für 10 Minuten. Um die Zellen abzubilden, stellen Sie das Mikroskop so ein, dass Bilder im Phasenkontrast erfasst werden.
Neben Fluoreszenzkanälen, die für das kernstoffbegrenzte fluoreszierende Protein geeignet sind, und den im Experiment verwendeten fluorogenaktivierten Caspase-3-Substratfluorophoren. Dann erfassen Sie Bilder von jedem experimentellen Brunnen im Phasenkontrast und die beiden Fluoreszenzkanäle alle ein bis drei Stunden für mindestens 72 Stunden. Um die aufgenommenen Bilder zu analysieren, öffnen Sie ein Bild aus einem Kontrollbrunnen, der nur Zielzellen und Medium ohne Caspase-3-Substrat im Fluoreszenzkanal enthält, der für substratssignals verwendet wird.
Beobachten Sie, ob ein unangemessenes Fluoreszenzsignal von den Kernen emittiert wird. Wenn das Substratsignal innerhalb der Kerne sichtbar ist, verwenden Sie das spektrale Unmixen, um den Prozentsatz des substraten Signals zu erhöhen, das vom Kernsignal entfernt wird, bis das Substratsignal verschwindet. Als Nächstes sehen Sie einen Kontrollbrunnen, der nur nicht beschriftete Effektorzellen in Medium ohne Caspase-3-Substrat in den beiden Fluoreszenzkanälen einzeln enthält.
Beobachten Sie, ob ein Signal von den Kernen emittiert wird. Wenn in den einzelnen Kanälen kein Signal erkennbar ist, ist keine spektrale Unmischung erforderlich. Um die fluoreszierenden Objekte in beiden Fluoreszenzkanälen aufzulösen, verwenden Sie eine Fluoreszenz-Hintergrundsubtraktionsmethode mit relevanten Parametern für die Probe und den entsprechenden Parametern für die Kantenaufteilung.
Verwenden Sie Bilder der Zielzellmonokultur, um Parameter für die Kernfluoreszenz der Zielzelle festzulegen. Verwenden Sie Bilder der Effektorzellmonokultur, um Parameter für substratinduzierte apoptotische Kernfluoreszenz festzulegen. Verwenden Sie Bilder der Co-Kultur, um Parameter für substratinduzierte apoptotische Kernfluoreszenz in Zielzellen zu verifizieren oder zu verfeinern.
Um die minimale Größe der Zielkerne zu bestimmen, verwenden Sie Bilder im Kernsignalkanal aus den Brunnen, die nur Zielzellen mit Caspasesubstrat enthalten. Um die durchschnittliche Größe der apoptotischen Effektorkerne zu bestimmen, verwenden Sie Bilder im Substratsignalkanal aus den Brunnen, die nur Effektorzellen mit Caspasesubstrat enthalten. Um die Anzahl der Fluoreszenzzielzellkerne zu zählen, richten Sie ein Analyseverfahren mit einer geeigneten Mindestgrößenbeschränkung ein.
Mit Effektorzellmonokulturbildern, richten Sie ein zweites Analyseverfahren ein, um die Anzahl der apoptotischen Kerne zu zählen, die größer als die mittlere Größe der apoptotischen Effektorkerne sind. Richten Sie dann ein drittes Analyseverfahren ein, um die Anzahl der apoptotischen Zielzellen zu zählen, indem Sie die Anzahl der Kerne zählen, in denen das Kernsignal und das größenbeschränkte Substratsignal signifikant mitlokalisieren. Typischerweise erhöhen Krebszellen das Fluoreszenzsignal in ihren Kernen nach der Aktivierung eines kernzielbaren Caspase-Biosensors, wenn die Zellen Kontakt mit CD8-positiven T-Zellen aufnehmen, die ohne Suppressorzellen durch Antikörper voraktiviert werden.
Die Kerngrößen von CD8-positiven T-Zellen sind kleiner als die von Krebszellen. Daher können apoptotische Effektorzellen durch eine Bildanalysemethode zur Größenbeschränkung von der apoptotischen Zielzellzahl ausgeschlossen werden. Obwohl einige Zielkrebszellen eine kleine abgerundete Form ohne Substratfluoreszenz aufweisen, hat dies keinen Einfluss auf die Analyse.
Da diese Zellen eher an Mitose als an Apoptose leiden und daher von der apoptotischen Zielzellzahl durch eine nukleare Substratsignalüberlappungsmaske ausgeschlossen werden. Die Co-Kultur von Zielkrebszellen mit voraktivierten CD8-positiven T-Zellen erhöht die Tumorzellapoptose über dem Niveau der spontanen Apoptose in Krebszellmonokulturen. Im Allgemeinen kann bei verwendung eines optimalen Verhältnisses von Zielkrebszellen zu Effektorzellen ein Spitzenwert in der Anzahl der apoptotischen Zielkrebszellen beobachtet werden.
Dieser Peak wird deutlicher, wenn die Daten als apoptotischer Bruchteil der Zielzellpopulation ausgedrückt werden. Das Wichtigste, was man beim Versuch dieses Protokolls beachten sollte, ist die Einrichtung von Monokulturen von Zielzellen und Monokulturen von Effektorzellen für die Entwicklung der Analysemasken. Diese Methode kann Einblick in die Dauer und Häufigkeit von T-Zell-zu-Krebs-Zell-Wechselwirkungen und die Bedingungen im Zusammenhang mit genabhängiger Zytotoxizität sowohl in menschlichen als auch in Mauszellen geben.
Wir entwickeln diesen Test derzeit zu einem High-Throughput-Bildschirm mit menschlichen Zellen, um Verbindungen zu identifizieren, die myeloische zellvermittelte Immunsuppression hemmen und dadurch die Wirksamkeit von Checkpoint-Inhibitoren verbessern.
