Unser Kultursystem erfasst die phänotypische Plastizität von Lungenplattenepinomenzellen als Reaktion auf Tumor-Stroma-Wechselwirkungen und wie diese Wechselwirkungen die Tumormorphologie während der Fortschreiten der Lungenplattenepithelkarzinom-Progression regulieren. Der Hauptvorteil unseres Systems ist seine Fähigkeit, die Biologie der Lungenplattenepither in einem 3D-Kontext zu modellieren und gleichzeitig die Plastizität der bösartigen Zellen zu erhalten. Diese 3D-Kokultur bietet ein einzigartiges System zur Untersuchung von Tumor-Stroma-Zell-Wechselwirkungen und könnte angepasst werden, um die Reaktionen von Lungenplattenkrebskarzinomzellen und krebsassoziierten Fibroblasten auf die medikamentöse Behandlung zu überwachen.
Zunächst tauchen Sie über Nacht in einem Vier-Grad-Kühlschrank mit Vier-Grad-Celsius-Folienauftauen auf. Zwei-Milliliter-Kunststoffpipetten abkühlen und bei minus 20 Grad Celsius über Nacht abkühlen. Am nächsten Tag wärmen Sie die Reagenzien, die verwendet werden, um TUM622-Zellen, HEPES-Puffer, Trypsin/EDTA und Trypsin-Neutralisationspuffer in einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad zu dissoziieren.
Nehmen Sie die aufgetaute Kellermembranmatrix aus dem Kühlschrank und legen Sie die Durchstechflasche auf Eis. Kühlen Sie die Gewebekulturplatten auf einem Metallplattformkühler ab, der auf Eis platziert ist. Zentrifugenrohre auf ein Metallkühlregal auf Eis legen.
Berechnen Sie die Menge der Zellen, die benötigt werden, basierend auf der Anzahl der Brunnen und der Konzentration der Zellen in jedem Brunnen, der vorbereitet werden soll. TUM622 Zellsuspension in ein gekühltes Zentrifugenrohr geben und bei 300 mal g in einer hängenden Eimerzentrifuge bei vier Grad Celsius fünf Minuten lang nach unten drehen. Mit einer an einer ungefilterten Spitze befestigten Saugpipette, saugen Sie den Überstand vorsichtig an und lassen Sie ca. 200 Mikroliter des Mediums im Rohr zurück.
Tippen Sie vorsichtig auf die Seite des Rohres, um das Pellet zu lösen und zu lösen und dann in das Kühlregal zurück. Mit den zwei Milliliter vorgekühlten Pipetten die Matrix vorsichtig auf Eis mischen, indem Sie ein paar Mal auf und ab pfeifen. Pipette mit einer gleichmäßigen und moderaten Geschwindigkeit, so dass während dieses Verfahrens keine Blasen in die Matrix eingeführt werden.
Übertragen Sie 1,1 Milliliter der Matrix in jedes Zentrifugenrohr. Mit vorgekühlten Spitzen, Pipette die Matrix in jedem Rohr nach oben und unten etwa 10 Mal, um eine einheitliche Zellsuspension zu machen. Übertragen Sie 310 Mikroliter der Zellmatrixsuspension in jeden Brunnen einer vorgekühlten 24-Well-Platte.
Legen Sie die Pipette in einem 90-Grad-Winkel zur Plattenoberfläche und fügen Sie die Aufhängung in die Mitte des Brunnens. Die Aufhängung breitet sich aus und deckt den gesamten Brunnen ab. Um die nachgeschaltete Immunfluoreszenzanalyse zu erleichtern, übertragen Sie 60 Mikroliter Zellmatrixsuspension in das Brunnenzentrum eines Zwei-Well-Kammerschlittens.
Dadurch kann die Matrix eine kuppelartige Struktur mit viel kleinerem Volumen bilden. Geben Sie die Platte und die Kammer zurück in den Inkubator der Gewebekultur und inkubieren Sie 30 Minuten, damit sich die Matrix verfestigen kann. Danach untersuchen Sie die Platte und gleiten Sie unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass einzelne Zellen gleichmäßig innerhalb der Matrix verteilt sind.
Fügen Sie in jedem Brunnen der Platte einen Milliliter vorgewärmter 3D-Kultur-Gesamtmedium und 1,5 Milliliter 3D-Kulturmedium in jeden Brunnen der Kammerrutsche ein, und geben Sie sie dann an den Inkubator zurück. Nach der Vorbereitung von Zellsuspensionen von TUM622 und CAFs, wie zuvor beschrieben, zählen Sie die CAF-Zelldichte, indem Sie 10 Mikroliter Zellsuspension mit 10 Mikroliter Trypanblau mischen. Fügen Sie 10 Mikroliter der Mischung zu jeder der beiden Kammern auf dem Hämozytometer hinzu, um die Zelldichte zu zählen und zu berechnen.
Um TUM622-Zellen und CAFs in die Kellermembranmatrix einzubetten, berechnen Sie zunächst die gewünschte Anzahl von Zellen, die für die Beschichtung verwendet werden, basierend auf den Zelldichteinformationen. CAFs werden mit einem Verhältnis von 2:1 von TUM622-Zellen gesät. Übertragen Sie das berechnete Volumen von TUM622s sowie die CAF-Zellsuspension in dasselbe Zentrifugenrohr.
Spin-down und aspirieren alle Medium. In Kellermembranmatrix und Platte 310 Mikroliter der Mischung in jeden Brunnen einer 24-Well-Platte aufsetzen. Übertragen Sie bei der Immunfluoreszenz 60 Mikroliter TUM622- und CAF-Mischungen auf Kammerschlitten, wie zuvor beschrieben.
Zur Kokultur TUM622 mit überlagerten CAFs in Derkellermembranmatrix, zuerst TUM622 Monokultur wie zuvor beschrieben einrichten, doppelt so viele CAF Suspension in ein Zentrifugenrohr übertragen und bei Raumtemperatur bei 300 mal g für fünf Minuten nachgeben. Übersaugen Sie den Überstand und setzen Sie die CAFs im Kulturmedium wieder aus, übertragen Sie die doppelte Anzahl von CAF-Zellen, die im Kulturmedium resuspendiert wurden, in jeden der Brunnen, die die eingebetteten TUM622-Zellen enthalten. Typische TUM622-Zellen in 2D-Kultur werden mit großen Kernen abgerundet, während CAFs flach und länsam sind.
In der 3D-Kultur gesät, waren einzelne TUM622-Zellen in der Lage, Organoide mit acinarähnlichen Morphologien zu bilden, wenn sie eingebettet wurden. Zwischen den Tagen fünf und sieben wurde ein Lumen in den acinarartigen Strukturen sichtbar und blieb danach hohl. Jeder Acinus, bestehend aus einer Monoschicht von Zellen, die das hohle Lumen umgeben, zeigte eine richtige apikale Basalpolarität ähnlich der des Lungenepithels in vivo.
Diese acinarähnlichen Strukturen waren hyperplastisch und wuchsen bis 24 Tage, bevor sich die extrazelluläre Matrix vollständig auflöste. In den TUM622-CAF-Kokulturen, entweder überlagernd oder miteinbettend, hat das Vorhandensein von CAFs die Anzahl und Größe der gebildeten Sphäroide erheblich verbessert. Interessanterweise, als TUM622 acini in die Nähe von CAFs kam, induzierten sie die Acini, invasiv zu werden und in Richtung der CAFs zu wandern, indem sie tropfenartige Strukturen bildeten.
Um eine robuste Bildung von acinarartigen Strukturen zu gewährleisten, ist es wichtig, die Kellermembranmatrix während des gesamten Einbettungsprozesses der Zellen in ihrer flüssigen Form zu erhalten. TUM622-Organoide können für eine Vielzahl von nachgeschalteten Analysen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Immunfluoreszenz, Immunhistochemie, Durchflusszytometrie, RNA und Proteinextraktion, und können auch für das Arzneimittelscreening modifiziert werden. Anhand dieses Systems als Plattform kann untersucht werden, wie tumorzellintrinelle sowie zellextrinsische Veränderungen in der Tumormikroumgebung die Tumorepithelarchitektur und die Karzinombildung beeinflussen können.
