Da diese Methode PD-1-blockierende Antikörper-gebundene Zellen mit peripherem Blut von Patienten bestimmt, kann die spezifische Teilmenge identifiziert werden, die für Antitumoreffekte und immunbedingte Nebenwirkungen verantwortlich ist. Diese Methode benötigt nur eine winzige Menge blutprobe und der Analyseprozess ist ziemlich einfach und schnell. Es braucht nur eine Durchflusszytometrie-Maschine.
Zu Beginn, sammeln Vollblutproben in Blutentnahmeröhrchen mit EDTA. Behandeln Sie jeden fünf Milliliter runden unteren Polystyrol-Flow-Zytometrie-Rohr mit einem Milliliter 2%fetales Rinderserum in PBS. Wirbel für 10 Sekunden.
Dann 20 Mikroliter Vollblutproben in die behandelten fünf Milliliter runden Bodenröhrchen übertragen. Fügen Sie 20 Mikroliter 2%FBS in PBS und 10 Mikroliter des humanspezifischen FC-Rezeptor-Blockierungsreagenz hinzu. Gut mischen und bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren.
Als nächstes fügen Sie 500 Mikroliter roter Blutkörperchen Lyse Puffer. Gut mischen und bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubieren. Fügen Sie vier Milliliter 2%FBS in PBS hinzu und drehen Sie Zellen bei 400 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration. Wiederholen Sie den Wasch- und Aspirationsprozess. Setzen Sie die Zellen in 100 Mikroliter n.F. 2%FBS in PBS wieder auf und teilen Sie sie in zwei Röhren mit jeweils 50 Mikrolitern auf.
Fügen Sie Oberflächenmarker-Antikörper hinzu. Gut mischen und 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln bebrüten. Waschen Sie Proben zweimal in 2%FBS in PBS wie zuvor.
Setzen Sie die Zellen in 200 Mikroliter n.F. 2%FBS in PBS wieder aus. Setzen Sie die Rohre in das Durchflusszytometer ein und erfassen Sie Zellen nach dem empfohlenen Protokoll. Zeichnen Sie 10.000 Ereignisse als Lymphozytentor auf und exportieren Sie Flussdaten als FCS-Dateien für die Analyse.
Öffnen Sie Dateien in der Analysesoftware und klicken Sie auf die Datei der Isotypsteuerung, um die Zellen auf einer Vorwärtsstreuung im Vergleich zu seitlichen Streudiagrammen und Gate-Lymphozyten zu visualisieren. Wählen Sie einzelne Zellen mit FSCH und SSCH versus SSCW aus und zeigen Sie sie auf cd3 im Vergleich zu CD8 oder CD3 im Vergleich zu CD4-Plot an. Gate die CD8 T-Zellen und CD4 T-Zellen jeweils.
Wählen Sie die gated cells aus und zeigen Sie sie auf einem PD-1-Diagramm im Vergleich zum menschlichen IgG4-Diagramm an. Wählen Sie dann auf der Grundlage der Isotypkontrolle Q3 aus, um PD-1-blockierende Antikörper-gebundene CD8- und CD4-T-Zellen zu identifizieren. In dieser Studie wurde in der Gating-Strategie- und Durchflusszytometrie-Analyse eine PD-1-blockierende Antikörperbindung an T-Zellen nachgewiesen, die aus einem Tropfen peripheren Blutdesatous des Patienten gewonnen wurden.
Das Diagramm PD-1 versus Human IgG4 zeigt den Bindungsstatus von PD-1-blockierenden Antikörpern auf T-Zellen. Orange Punkte und schwarze Punkte weisen auf Anti-IgG4-Antikörper bzw. Isotyp-Kontrollfärbung hin. Vor der Verabreichung von PD-1-blockierendem Antikörper waren keine humanen IgG4-positiven CD8- oder CD4-T-Zellen vorhanden und die PD-1-Expression wurde durch einen PD-1-detektierenden Antikörper bestätigt.
Nach Verabreichung von Nivolumab oder Pembrolizumab kann IgG4 auf T-Zellen durch Anti-IgG4-Antikörper nachgewiesen werden, während der PD-1-Detektionsantikörper EH12.1 keine PD-1 an T-Zellen erkennt. Die roten, blauen und grünen Tore weisen auf die vollständige Bindung, Teilbindung bzw. Bindungsverlust hin. Nachdem die Patienten Nivolumab und Pembrolizumab abgesetzt haben, verringerte sich der Status der PD-1-blockierenden Antikörperbindung an CD8-T-Zellen.
Es bestand eine teilweise Bindung und schließlich ein vollständiger Verlust der Bindung. Bitte stellen Sie sicher, dass die Blutprobe mit RBC-Lyse sowie mischen. Auch das Mischen der RBC-Lyse vor der Oberflächenmarkerfärbung ist der schlüsselfertige Schritt bei dieser Methode.
Wenn der Forscher Zugang zu einer fortschrittlichen Durchflusszytometriemaschine hat, können PD-1-blockierende Antikörper-gebundene T-Zellen mit immer mehr Markern im Zusammenhang mit dieser Strategie für die Profilierung von T-Zell-Phänotypen angewendet werden, die für unerwünschte Ereignisse verantwortlich sind, die durch PD-1-blockierende Antikörper verursacht werden. Die Probenahme von Patienten mit entwickelten unerwünschten Ereignissen ist wichtig, um den Nutzen dieser Strategie zu bewerten.
