Predictive Immune Modeling von Solid Tumoren

Zusammenfassung

Die Verwendung eines RNA-basierten Ansatzes zur Bestimmung quantitativer Immunprofile von soliden Tumorgeweben und zur Nutzung klinischer Kohorten für die Entdeckung von bioonkologischen Biomarkern wird durch molekulare und informatikische Protokolle beschrieben.

Zusammenfassung

Immuntherapien versprechen die Behandlung von onkologischen Patienten, aber die komplexe Heterogenität der Tumormikroumgebung macht die Vorhersage des Behandlungsreaktionens schwierig. Die Fähigkeit, die relativen Populationen von Immunzellen im und um das Tumorgewebe aufzulösen, hat sich als klinisch relevant für das Verständnis der Reaktion erwiesen, ist jedoch durch traditionelle Techniken wie Durchflusszytometrie und Immunhistochemie eingeschränkt ( IHC), aufgrund der großen Menge an Gewebe erforderlich, Mangel an genauen Zelltyp Marker, und viele technische und logistische Hürden. Ein Assay (z.B. der ImmunoPrism Immune Profiling Assay) überwindet diese Herausforderungen, indem er sowohl kleine Mengen an RNA als auch stark degradierte RNA, gemeinsame Merkmale von RNA, die aus klinisch archiviertem festem Tumorgewebe extrahiert werden, aufträgt. Der Zugriff auf den Test erfolgt über ein Reagenzien-Kit und Cloud-basierte Informatik, die eine durchgängige quantitative Immunprofilierungslösung mit hohem Durchsatz für Illumina-Sequenzierungsplattformen bietet. Die Forscher beginnen mit nur zwei Abschnitten formalinfixiertem Paraffin-eingebettetem (FFPE)-Gewebe oder 20-40 ng der gesamten RNA (je nach Probenqualität), und das Protokoll erzeugt einen Immunprofilbericht, der acht Immunzelltypen und zehn Immunescape- eine vollständige Sicht auf die Tumormikroumgebung. Für die Nutzung der resultierenden Daten ist keine zusätzliche bioinformatische Analyse erforderlich. Mit den entsprechenden Stichprobenkohorten kann das Protokoll auch verwendet werden, um statistisch signifikante Biomarker innerhalb einer Patientenpopulation von Interesse zu identifizieren.

Einleitung

Quantifizierung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) und anderen immunbedingten Molekülen in formalinfixierten und paraffineingebetteten (FFPE) soliden Tumor-Humangewebeproben hat in der klinischen Forschung einen Wert gezeigt^1,2,3. Häufige Techniken wie Durchflusszytometrie und singlezellige Ribonukleinsäure (RNA) Sequenzierung sind nützlich für frisches Gewebe und Blut⁴, aber sind ungeeignet für die Analyse von FFPE-Materialien aufgrund der Unfähigkeit, lebensfähige Zellsuspensionen zu schaffen. Aktuelle Methoden, die zur Quantifizierung dieser Zellen im FFPE-Gewebe verwendet wurden, leiden unter großen Herausforderungen. Die Immunhistochemie (IHC) und andere ähnliche bildgebende Arbeitsabläufe erfordern spezifische Antikörper zum Nachweis von Zelloberflächenproteinen, die laborübergreifend nur schwer zu standardisieren sind, um eine reproduzierbare Quantifizierung zu ermöglichen⁵. Plattformen wie das nCounter-System verlassen sich auf die Expression einzelner Gene, um wichtige Immunzellen zu definieren⁶, wodurch die Empfindlichkeit und Spezifität des Nachweises begrenzt wird. Allgemeinere RNA-Sequenzierungsmethoden, gekoppelt mit eigenständigen Software-Tools, sind verfügbar, erfordern jedoch eine signifikante Optimierung und Validierung vor der Verwendung^{7,8,9,10,11,12}. Die jüngsten Fortschritte bei der Kombination von Lasercapture Microdissection (LCM) mit RNA-Sequenzierung für FFPE-Gewebe haben sich als vielversprechend erwiesen; Für translationale Studien zur Identifizierung robuster Biomarker^13,14ist jedoch eine schlüsselfertigere Lösung mit höherem Durchsatz erforderlich. Methoden zur Erzeugung multidimensionaler Biomarker, wie z. B. Predictive Immune Modeling, die Patientenkohorten einschließlich Therapie-Responder, Krebssubtypen oder Überlebensergebnisse mit hoher Vorhersagegenauigkeit und statistischer Signifikanz definieren, werden im Zeitalter der Präzisionsmedizin und Immuntherapie immer^wichtiger.

Um diesem Bedarf gerecht zu werden, wurde ein Immunprofiling-Assay entwickelt, um eine empfindliche und spezifische Quantifizierung von Immunzellen in soliden Tumor-FFPE-Geweben mit standardisierten RNA-Sequenzierungsreagenzien und Cloud-basierter Informatik zu ermöglichen. Neben der Aufnahme degradierter RNA aus FFPE-Gewebe ist das Protokoll in der Lage, RNA aus begrenzenden Gewebeproben wie Kernnadelbiopsien, Nadelaspirierungen und mikro- oder makroseziertem Gewebe aufzunehmen. RNA-Daten aus jeder Probe werden mit einer Datenbank von Genexpressionsmodellen von Immunzellen, den so genannten Immun-Gesundheitsexpressionsmodellen, verglichen, um Immunzellen als Prozentsatz der gesamtin der Probe vorhandenen Zellen zu quantifizieren. Kurz gesagt, wurden diese Modelle mit maschinellen Lernmethoden erstellt, um einzigartige multigene Expressionsmuster aus Ganzentranskriptomdaten zu identifizieren, die aus gereinigten Immunzellpopulationen (isoliert mit kanonischen Zell-Oberflächen-Markern)^17,18erzeugt wurden. Die der Technologie zugrunde liegenden multidimensionalen Gesundheitsexpressionsmodelle ermöglichen es dem Assay, jede Immunzelle als Prozent der gesamtin der heterogenen Mischung vorhandenen Zellen zu quantifizieren. Dies ermöglicht es dem Forscher, Inter- und Intra-Sample-Immunzellvergleiche zu erzeugen, die nachweislich einen klinischen Wert^{von 19,20}haben. Weitere Anwendungen sind die Quantifizierung der Immunantwort vor und nach der Behandlung, wie in den repräsentativen Ergebnissen beschrieben. Der Assay berichtet über mehrere Merkmale der Immunkontexturierung des Tumors und der Tumormikroumgebung, einschließlich der absoluten Prozentsätze von acht Immunzelltypen (abgeleitet aus Genexpressionsmodellen): CD4⁺ T-Zellen, CD8⁺ T-Zellen, CD56⁺ Natural Killer-Zellen, CD19⁺ B-Zellen, CD14⁺ Monozyten, Tregs, M1-Makrophagen und M2-Makrophagen. Darüber hinaus meldet der Assay die Expression (in Transkripten pro Million oder TPM) von zehn Immun-Escape-Genen: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 und ARG1.

Das Reagenzien-Kit wird verwendet, um qualitativ hochwertige Bibliotheken für die Sequenzierung auf einer Illumina-Plattform nach einer hybriden Capture-basierten Bibliotheksvorbereitungsmethode bereit zu machen, wie in Abbildung 1dargestellt. Wenn ein Forscher keine Illumina-Sequenzierungsplattform in seinem Labor hat, kann er seine Proben zur Sequenzierung an ein Kernlabor übermitteln. Nach der Erstellung werden Sequenzierungsdaten zur automatisierten Analyse in das Prism-Portal hochgeladen, und dem Benutzer wird ein umfassendes, quantitatives Profil in Form des Immunberichts (Abbildung 2A) zurückgegeben. Benutzer können auch Stichprobengruppierungen im Prismenportal definieren, um einen Biomarker-Bericht zu erstellen (Abbildung 2B), in dem statistisch signifikante Biomarker hervorgehoben werden, die zwei Patientenkohorten unterscheiden. Wichtig ist, dass die vom Reagenzien-Kit generierten Daten nur für Forschungszwecke bestimmt sind und nicht für diagnostische Zwecke verwendet werden dürfen.

Abbildung 1: Übersicht über den Workflow. In diesem Protokoll wird DIE RNA zuerst in cDNA umgewandelt. Sequenzierungsadapter sind ligattiert, und adaptor-ligated cDNA wird von PCR verstärkt und barcodet, um eine Pre-Capture-Bibliothek zu erstellen. Biotinylierte Sonden werden dann zu bestimmten cDNA-Zielen hybridisiert, die dann mit Streptavidinperlen erfasst werden. Ungebundene, nicht zielgerichtete cDNA wird durch Waschen entfernt. Eine abschließende PCR-Anreicherung ergibt eine Nach-Capture-Bibliothek, die für die Sequenzierung bereit ist. *Die gesamte RNA muss aus menschlichen Proben stammen; intakte oder degradierte (FFPE) RNA sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative Immunberichte. Der Workflow generiert zwei Berichte, einen individuellen Immunbericht (A) für jede verarbeitete Probe und einen Biomarker-Bericht (B) für definierte Patientenkohorten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Das Protokoll benötigt ca. 16 h Vorbereitungszeit (von der gesamten RNA bis zu Bibliotheken, die für die Sequenzierung bereit sind); Es gibt jedoch eine Reihe von optionalen Haltepunkten, wie im Protokoll erwähnt. Der Assay nutzt die reiche, dynamische Natur der Transkriptomik, um über ältere Einzelanalyten-Biomarker zu multidimensionalen Genexpressionsmodellen überzugehen und so eine umfassende biologische Charakterisierung von Gewebeproben mit standardisierten Reagenzien und benutzerfreundliche Software-Tools. Es versetzt Forscher in die Lage, eine moderne Technologie in ihrem eigenen Labor zu nutzen, indem sie maschinelles Lernen und eine Datenbank von Health Expression Models nutzen, um genauere, quantitative requantitative Immunprofile wertvoller klinischer Proben abzuleiten und multidimensionale RNA-Biomarker mit vollständiger statistischer Analyse.