Plasmide sind extrachromosomale Elemente, die in den meisten Bakterienarten und Lebensräumen allgegenwärtig sind, wo sie sehr wichtige Erreger des lateralen Gentransfers sind, da sie zwischen Zellen und Zwischenpopulationen wandern können. Eines der auffälligsten und prominentesten Beispiele für einen solchen Transfer ist die Verbreitung von Antibiotikaresistenzgenen, die auf Plasmiden kodiert sind. Um ein Modellplasmid zu erstellen, das ein Antibiotikaresistenzgen kodiert, wählen Sie ein Plasmid-Rückgrat und PCR verstärken das Rückgrat mit einer Hochtreue-Polymerase und Primern, die an die Plasmidschablone binden. In unserem Fall haben wir ein pBBR1-Plasmid-Rückgrat verwendet. Als nächstes verstärken Sie das Resistenzgen nptII einschließlich des nativen Tn5-Promotors mit einer Hochtreuepolymerase. Entwerfen Sie die Primer für das Resistenzgen mit ca. 20 Basenpaaren der Sequenzkompleärität zum Plasmid-Rückgrat. Nach den PCRs, verschmelzen Sie den Homologiebereich des gereinigten Resistenzgens PCR-Produkts mit dem gereinigten Plasmid-Rückgrat mit isothermen Baugruppen bei 50 Grad für 60 Minuten. Verwandeln Sie das geschmolzene Produkt in E.Coli DH5-Alpha mittels Elektroporation. Platte 100 Mikroliter der Mischung auf selektiven Medien und inkubieren bei 37 Grad für etwa 24 Stunden. Das Plasmid kann dann extrahiert, validiert und in den E.coli-Wildstamm MG1655 umgewandelt werden. Dies ergibt Stamm MG1655 pCON.Während der Antibiotika-Exposition, Bakterien brauchen das Plasmid zu überleben. Somit befindet sich das Plasmid unter positiver Selektion. Unter nicht-selektiven Bedingungen, also ohne Antibiotika, ist das Plasmid für die Zelle einweg. Das Ziel unserer Studie war es, die Plasmide unter solchen nicht-selektiven Bedingungen im Laufe der Zeit zu verfolgen. Dazu haben wir die kleinen Plasmide mit einem Antibiotikaresistenzgen ausgestattet und in Escherichia coli eingeführt. Wir führten ein evolutionäres Experiment durch und überwachten die Häufigkeit der Plasmide über die Nachbildung. Der Plasmid-Trägerstamm mg1655 pCON wird nun in ein Evolutionsexperiment eingeführt. Erstens, Platte mg1655 pCON auf LB Agar Platten mit Antibiotika ergänzt und inkubieren über Nacht bei 37 Grad. Wählen Sie aus dieser Platte zufällig die 8 Ahnenkolonien aus und brüten über Nacht bei 37 Grad mit ständigem Schütteln. Am nächsten Tag werden die Populationen auf das Experiment übertragen, das in 96 Tiefenbrunnenplatten durchgeführt wird. Es ist sehr wichtig, die Replikationen nach dem Zufallsprinzip auf die Platte zu verteilen. Zum Beispiel in einem Schachbrettansatz. In unserem Experiment werden die Kulturen verdünnt und mit unterschiedlichen Verdünnungsraten und bei zwei Temperaturen übertragen. Bei jedem Transferereignis wird die Verdünnungsbehandlung angewendet und die serielle Übertragung über insgesamt 98 Transfers wiederholt. Entlang des Evolutionsexperiments wird die Häufigkeit von Plasmiden in der Population anhand des Anteils der Plasmid trägerden Zellen geschätzt. Replica Plating wurde von Esther und Joshua Lederberg in den 1950er Jahren populär gemacht, wo sie es verwendet, um Die Drogenresistenz bei Bakterien zu studieren. Die Methode wird es ihnen ermöglichen, ihre Scans nach Phänotypen zu skalieren und am Ende der Studie zeigte, dass Penicillinresistenz in Bakterien aufgrund spontaner Mutationen im Genom entstehen kann. Um die Plasmidhäufigkeit in der Population während des Experiments zu bestimmen, werden stationäre Kulturen seriell verdünnt und auf nicht-selektiven LB-Agarplatten plattiert. Passen Sie die Verdünnung nach einem Ertrag von 250 bis 500 Kolonien pro Platte an. Die plattierten Populationen werden für das Übernachtwachstum bei 37 Grad für weniger als 24 Stunden inkubiert. Kolonien werden am besten repliziert, wenn sie noch klein sind. Nach dem über Nacht Wachstum zählen alle Kolonien mit einem automatisierten Koloniezähler nach Wahl des Lesers. Dies ergibt die Gesamtgröße der Bakterienpopulation in den Kulturen. Beachten Sie, dass Kolonien am Rand der Platte weggelassen werden sollten. Um die Platten zu replizieren, benötigen Sie selektive Agarplatten, ergänzt mit Antibiotika, einen runden Block, einen Metallring, der in den Block passt, und steriles Samttuch. Das Tuch muss 100% Baumwolle sein, da dies durch Autoklavierung sterilisiert werden kann. Legen Sie das Tuch auf den Block und fixieren Sie es mit dem Metallring.Legen Sie den Teller mit den gezählten Kolonien vorsichtig auf die feste Samttuchoberfläche. Tippen Sie auf die Platte in Kreisbewegungen, so dass die gesamte Plattenoberfläche das Tuch berührt. Es ist sehr wichtig, dass alle Kolonien den Samt berühren. Entfernen Sie die LB-Platte und legen Sie die selektive Platte auf den Samt. Wiederholen Sie das sorgfältige Tippen. Es ist wieder wichtig, dass die Platte den Samt vollständig berührt. Entfernen Sie anschließend die selektive Platte. Die Platten werden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Tag werden sowohl die LB als auch die Antibiotikaplatte für die Bewertung benötigt. Legen Sie die Platten übereinander und vergleichen Sie das Wachstum. Sie können einfach koloniefreie Räume entdecken. Das sind die Kolonien, die nicht gegen Antibiotika resistent sind. So verloren diese Kolonien das Plasmid. Markieren Sie am Ende, wie viele Kolonien auf der Antibiotikaplatte fehlen. Diese Zahl gibt Ihnen den Plasmidverlust. Wiederholen Sie die Nachbildung aller Populationen während des Evolutionsexperiments wöchentlich. Plasmidverlust kann durch Plasmid-Multi-Malformation verursacht werden. Bei der Arbeit an einer Plasmidkonstruktion sagen für die Expression eines bestimmten Gens in Ihrem bevorzugten Wirtsstamm das native Verhalten eines Plasmids in vivo in Bezug auf die Bestätigung, die ein Zustand nehmen kann, ist in der Regel etwas, das übersehen wird. Aber in einem evolutionären Kontext könnte eine solche Bestätigung von Veränderungen von sehr großer Bedeutung sein. Die Analyse von Plasmid-Bestätigungen kann ein sehr schwieriges Unterfangen sein. Besonders Plasmidmultimere sind schwer zu analysieren, da sie nicht durch PCR oder Durch Sequenzierung richtig identifiziert werden können. Auf der anderen Seite sind Plasmidmultimere aufgrund ihrer potenziell großen Größe und ihrer langsamen elektrophoretischen Mobilität durch Gelelektrophorese schwer zu analysieren. Unser Protokoll bietet eine einfache und einfache Methode für das Screening und die Identifizierung von Plasmid-Multimern in, würde ich sagen, jede gegebene Plasmid-Präparation. Um visuelle Plasmidmoleküle extrahieren das Plasmid aus 5 ml stationären Nachtzellkultur mit alkalischer Lyse. Die Plasmidextraktion von Plasmaplasmiden mit niedriger Kopie führt oft zu einer Kontamination mit der chromosomalen DNA des Wirts, die vor der Visualisierung verdaut werden muss. Um die chromosomale DNA-Kontamination zu entfernen, behandeln Sie die extrahierte Plasmid-DNA mit Plasmid-Safe
