Diese Methode ermöglicht eine transkriptomische Analyse einer seltenen Zellpopulation aus Drosophila männliche Accessoire-Drüse, die sekundären Zellen genannt, und es deckt Gene, die sie entscheidend für den Fortpflanzungserfolg machen. Im Laufe eines Tages ermöglicht diese Technik die Sortierung von Sekundärzellen aus unterschiedlichen Genotypen und die Extraktion der gesamten RNA für die nachfolgende qPCR- oder RNA-Sequenzierung. Manchmal werden Projekte durch die Seltenheit des Ausgangsmaterials begrenzt.
Diese Methode kann die Grundlage für andere Gruppen bilden, die vor der Herausforderung stehen, mit einer seltenen Zellpopulation zu arbeiten. Da das Verfahren 40 Drüsen ansammeln muss, ist es wichtig, die Sezieren zu üben. Die Vorbereitung der hausgemachten Pipettenspitzen ist ebenfalls wichtig, und so sollten Sie es auf dem Video visualisieren, wie man es macht und im Voraus vorbereitet.
Vor Beginn des Verfahrens, schneiden und Flamme rund, breit, 200-Mikroliter-Spitzen für den Umgang mit den Drüsen, und passieren Sie die Spitzenöffnung von mehreren 1.000-Mikroliter-Spitzen in der Nähe einer Flamme für weniger als eine Sekunde, um die Öffnungen zu verengen. Sortieren Sie dann die modifizierten Tipps von schmaler nach breiter, basierend auf ihrer Aspirationsgeschwindigkeit. Für die zu erhaltende Drüsensektion, legen Sie 20 bis 25 männliche Drosophila in einer Glasschale auf Eis, und verwenden Sie Zangen und ein Seziermikroskop, um den Fortpflanzungstrakt einer männlichen Fliege zu entfernen.
Löschen Sie das Zubehördrüsenpaar von allen anderen Geweben, einschließlich der Hoden und Ejakulationsbirne, und übertragen Sie die Zubehördrüsen auf eine Glasplatte, die serumergänztes Medium bei Raumtemperatur enthält. Wenn 20 Paar Zubehördrüsen gesammelt wurden, waschen Sie die Drüsen in einer Schüssel von PBS für ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Wäsche die Drüsen auf eine frisch zubereitete Dissoziationslösung übertragen und mit scharfen Zangen unter einem Sezierendes Mikroskop die Mitte eines Drüsenlappens fest kneifen.
Schneiden Sie das Gewebe mit der scharfen Spitze mit einem zweiten Zangenpaar, um den proximalen Bereich der Zubehördrüse und den Ejakulationskanal von dem Teil der Drüse zu trennen, der sekundäre Zellen enthält. Schneiden Sie die Drüsen, so dass die Peptidasen die Zellen erreichen können, die sonst durch die äußere Muskelschicht und durch die viskose Samenflüssigkeit im Lumen der Drüse geschützt sind. Verwenden Sie dann eine vornasse, flammenabgerundete, breite 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um die Drüsen in ein 1,5-Milliliter-Rohr zu übertragen.
Für die Gewebeverdauung die Röhre in einen 37-Grad-Celsius-Shaker für 60 Minuten bei 1 000 Umdrehungen pro Minute legen. Am Ende der Inkubation die Verdauung mit einem Milliliter Serum-ergänztem Medium beenden und eine vornasse, flammabgerundete, breite, 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze verwenden, um die Proben auf eine 24-Well-Platte zu übertragen. Überprüfen Sie die Zellen auf ihre GFP-Expression unter einem Fluoreszenzmikroskop.
Die meisten Drüsenspitzen sollten intakt aussehen, und ein paar sekundäre Zellen sollten abgetrennt werden. Verwenden Sie eine abgerundete, schmale, 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze, um die Zellen drei- bis fünfmal sanft zu trituratieren, um das Zubehördrüsengewebe zu stören. Verwenden Sie dann eine sehr schmale, abgerundete, 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze ein- bis zweimal, um die Zellen zu individualisieren.
Lassen Sie die Zellen 15 Minuten lang sich damit begnügen. Bestätigen Sie, dass die Zellen unter dem Mikroskop gesund erscheinen, und entfernen Sie das überschüssige Medium. Dann übertragen Sie die Zellen in eine neue 1,5-Milliliter-Röhre und spülen Sie die Brunnen mit frischem Medium, um alle verbleibenden Zellen zurückzugewinnen.
Das Abd-B-GAL4-Konstrukt kann in diesen Experimenten verwendet werden, um sekundäre, aber nicht Hauptzellen mit GFP zu kennzeichnen. In dieser Studie wurden beide Zelltypen nach Wildtyp und iab-6cocuD1 mutierten Zubehördrüsen sortiert. Dieser D1-Mutante fehlt die Expression von Abd-B- und MSA-Transkripten, die sich auf die Entwicklung, Morphologie und Funktion von Sekundärzellen auswirken.
Nach der Zelldissoziation wird FACS verwendet, um lebende Zellen basierend auf DRAQ7 auszuwählen, und GFP-Fluoreszenzniveau wird verwendet, um sekundäre Zellen und Hauptzellen zu isolieren. RNA wird aus jeder Zellpopulation extrahiert und auf zwei Nanogramm pro Probe für die nachfolgende RT-qPCR und Sequenzierung angepasst. Die Quantifizierung der Expression spezifischer Gene durch quantitative PcR in Echtzeit auf Freityp-Haupt- und Sekundärzellextrakte zeigt, dass die sekundären Zellgene Rab19 und MSA nur aus sekundären Zellextrakten nachgewiesen werden, während das Hauptzellgen-Sexpeptid nur aus Hauptzellproben nachgewiesen wird.
Die Hauptkomponentenanalyse von RNA-Sequenzierungsdaten von drei Wildtyp- und drei Mutantenreplikationen zeigt, dass der Wildtyp sowohl Cluster nahe beieinander als auch weit von den mutierten Proben repliziert. Die Visualisierung von Lesevorgängen, die auf bestimmte Gene ausgerichtet sind, zeigt, dass Haushaltsgene wie Actin 5C und die sekundären zellspezifischen Gene Rab19 und Dve in beiden Genotypen exprimiert werden. Für MSA geht jedoch die starke Expression des Gens, das bei Wildtypfliegen beobachtet wird, in den mutierten Stämmen verloren.
Für ein erfolgreiches Verfahren ist es wichtig, genügend lebende, voneinander dissoziierte Sekundärzellen zu erhalten. Überprüfen Sie daher das Sezier- und Dissoziationsprotokoll in kleinen Experimenten. Diese Methode ermöglicht die Sortierung beider Zelltypen von Zubehördrüsen aus einer kleinen Anzahl von Fliegen, wodurch untersucht werden kann, wie diese Zellen transkriptionsweise auf mehrere genetische oder Umweltbedingungen reagieren.
Männliche Fortpflanzungserfolg ist bekannt, von vielen Dingen betroffen sein, einschließlich Genotyp, Alter, und Paarungsstatus. Die Leichtigkeit dieser Methode sollte es uns ermöglichen zu untersuchen, wie diese Faktoren die Zubehördrüsentranskription beeinflussen.
