Unser Protokoll stellt fest, dass die Verwendung von Nierenextrakten von Kühen und Schweinen eine ausgezeichnete und wirtschaftliche Ressource für die Untersuchung der Nierenphysiologie ist, insbesondere die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen vaskulären endothelialem Wachstumsfaktor und anderen Analyten. Es war schon immer eine Herausforderung, VEGF, einen wesentlichen Wachstumsfaktor in der Organangiogenese, mit anderen Proteinen zu korrelieren. Diese Technik ermöglicht es uns, den Zusammenhang zwischen VEGF und Analyten wie Hormonen zu untersuchen.
Dies wird sicherlich unsere Wissensbasis in Bezug auf diesen wichtigen Wachstumsfaktor erweitern. Diese Methode kann nützlich sein, um andere Analyten in Nierenkortika-Extrakten neben den in diesem Video erwähnten zu korrelieren. Visuelle Demonstration hilft anderen, reproduzierbare Ergebnisse ohne Stichprobenfehler zu erzielen.
Die Verwendung von frischem Gewebe ist entscheidend für den Erfolg dieser Technik. Es ist wichtig, frische ganze Nieren unmittelbar nach der Schlachtung von einem Tier zu erhalten. Übertragen Sie das Gewebe immer auf Eis ins Labor.
Verwenden Sie sterile Schere, Zangen, ein Messer und Petri-Gerichte, um Nieren zu sezieren und die erforderliche Gewebeportion zu verbrauchen. Schneiden Sie die Niere vorsichtig entlang der sagittalen Ebene und schneiden Sie ein Stück Gewebe aus dem Kortexbereich in der Mitte der Niere. Das Gewebe mit dem Messer in kleine Stücke zerkleinern und mit einem Milliliter eiskaltem 1X RIPA-Lyseextraktionspuffer in ein Mikrofugenrohr geben.
Beschriften Sie das Rohr mit spezifischen Probendetails und legen Sie es auf Eis. Verwenden Sie einen Handhomogenisator mit einer sterilen Sonde, um das Gewebe für ein bis zwei Minuten zu homogenisieren, bis keine Brocken sichtbar sind, und zentrieren Sie das Rohr dann sofort bei 9, 600 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation verschiedene Aliquots der Probe für ELISA und die gesamte Proteinanalyse vorbereiten, um mehrere Gefrier-/Tauzyklen zu vermeiden.
Bevor Sie mit dem Test beginnen, bringen Sie alle Reagenzien und die Assayplatte auf Raumtemperatur, um die überschüssigen Brunnen zu entfernen und sie bei vier Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung aufzubewahren. Den 20X Waschpuffer mit doppelt destilliertem Wasser auf 300 Milliliter verdünnen und die Rohbrunnen lösungslos aufstellen. Fügen Sie 50 Mikroliter Standard oder Probe und weitere 50 Mikroliter Meerrettichperoxidase konjugieren zu jedem Brunnen, dann fügen Sie sofort 50 Mikroliter Antikörperlösung zu jedem Brunnen und versiegeln Sie die Platte.
Mischen Sie die Platte und inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Nach der Inkubation jeden Brunnen mit 200 Mikroliter Waschpuffer waschen. Fügen Sie 50 Mikroliter Substrat A und Substrat B zu jedem Brunnen hinzu, mischen Sie die Platte sanft, indem Sie auf die Seite tippen, dann versiegeln und inkubieren Sie es im Dunkeln für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Fügen Sie 50 Mikroliter Stop-Lösung zu jedem Brunnen. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte und lesen Sie die Absorption bei 450 Nanometern mit einem Spektralphotometer ab. Bereiten Sie die Reagenzien und Waschpuffer wie zuvor beschrieben, dann fügen Sie 100 Mikroliter Standard oder Probe zu jedem Brunnen, versiegeln Sie die Platte, mischen Sie gut, und inkubieren Sie es für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius.
Entfernen Sie die Flüssigkeit in jedem Brunnen und fügen Sie 100 Mikroliter Detektionsreagenz A.Seal die Platte und inkubieren Sie es für eine weitere Stunde. Als nächstes waschen Sie jeden Brunnen mit 400 Mikroliter Waschpuffer, fügen Sie dann 90 Mikroliter Substratlösung zu jedem Brunnen, tippen Sie vorsichtig auf die Platte, und inkubieren Sie es für eine weitere Stunde bei 37 Grad Celsius. Nach der letzten Inkubation 50 Mikroliter Stop-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen, sanft auf die Platte tippen und die Absorption bei 450 Nanometern mit einem Spektralphotometer ablesen.
Schätzen Sie das Gesamtprotein der Rinder- und Schweinenierenextrakte mit einem Standard-BSA-Test und verwenden Sie diese Schätzung, um die LH- und VEGF-A-ELISA-Ergebnisse zu normalisieren. Der Mittelwert und der Median von LH und VEGF wurden sowohl für Tiere als auch für Geschlechter berechnet. Nach der Überprüfung der Normalität der Daten wurden lineare Regressionsmodelle verwendet, um die Beziehung zwischen LH und VEGF zu untersuchen.
LH erwies sich als starker und signifikanter Prädiktor von VEGF sowohl bei Rinder- als auch bei Schweinenieren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, identische Bereiche in jedem Gewebe zu proben. Ein ähnliches Verfahren kann verwendet werden, um jede Art von Gewebe zu extrahieren.
Denken Sie daran, Analyten durch Total-Protein-Extrakt von welchem Gewebe Sie verwenden normalisieren.
