Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.

1. Vorbereitung der Instrumente und Arbeitslösungen <ol><li> Bereiten Sie die Fisch-Wasser-Lösung. Machen Sie eine Stammlösung durch Lösen von 2 g Meersalz &quot;Instant Ocean&quot; in 50 ml destilliertem Wasser. 1,5 ml der Stockfisch Wasser auf 1 L destilliertem Wasser zur Vorbereitung bereit, Fisch Wasser (60 ug / ml Meersalze Endkonzentration) zu verwenden. Autoklavieren bereit, Fisch Wasser vor Gebrauch zu verwenden. Diese Lösung wird als Zebrafischembryo Medium verwendet. </li><li> Bereiten Methylcellulose für die Embryo-Montage. Lösen Sie 1,5 g Methylcellulose in 50 ml sterilem Wasser Fisch. Erleichtern Sie die Auflösung mit Hilfe eines Magneten auf einer Rührplatte. Die vollständige Auflösung des Pulvers benötigt mehrere Stunden. Überprüfen Sie die Lösung für Klarheit und Teilmenge in kleine Röhrchen. Lagerung bei -20 ° C für Monate und auftauen Aliquots bei Gebrauch. Zentrifugieren Sie die Methylcellulose bei 950 xg für 5 min vor der Anwendung. Vermeiden Frost-Tau-Zyklen von Teilmengen. </li><li> Bereiten Sie 50 ml Tricaine / Ethyl-3-m Aminobenzoatethansulfonat Salz (Stammlösung) durch Lösen von 200 mg Tricaine in 100 ml Wasser und pH-Wert auf 7,0 mit Tris-HCl 1 M (pH 9). Bewahren Sie die Lager bei 4 ° C für nicht mehr als 30 Tage. ACHTUNG: Tricaine ist giftig. Verwenden Sie nach geeigneten Verarbeitungsrichtlinien. </li><li> Induktion oxidativen Stress in Zebrafischembryonen <ol><li> Bereiten Sie ein Oxidationsmittel-Lösung für generische oxidativen Stress Induktion: Stellen 50 ml Oxidationslösung durch Zugabe von H 2 O 2-Stammlösung (Wasserstoffperoxid; 100 mM) um Fische zu Wasser. Mit H 2 O 2 zu einer Endkonzentration von 2 mM bzw. 100 uM. Diese Lösung kurz vor Gebrauch. Die Oxidationsmittel-Lösung kann sowohl whole mount ROS-Erkennung und Einzelzellen-ROS-Nachweisverfahren angewendet werden. Sie diese Lösung lagern. ACHTUNG: H 2 O 2 ist gefährlich und gesundheitsschädlich beim Einatmen und Verschlucken. Berührung mit brennbaren Stoffen besteht Feuergefahr. Griff unter einer Abzugshaube und tragen Sie geeignete personal Schutzausrüstung. </li><li> Bereiten Sie ein Oxidationsmittel-Lösung für Mitochondrien-abgeleiteten oxidativen Stress Induktion: Machen Sie eine Oxidationsmittel-Stammlösung (5 mM) durch Auflösen von 3,9 mg Rotenon in 2 ml Dimethylsulfoxid (DMSO). Diese Lösung wird bei Raumtemperatur in der Dunkelheit. <ol><li> Lösen Rotenon Stammlösung zu 10 ml Wasser pro Fisch gebrauchsfertige Lösung zu machen. Verwenden Rotenon in einer Konzentration zwischen 5-50 uM. Verwenden Sie keine Rotenon in Konzentrationen von mehr als 100 uM. In geeigneten Konzentrationen kann dieser Oxidationslösung sowohl whole mount ROS-Erkennung und Einzelzellen-ROS-Nachweisverfahren angewendet werden. ACHTUNG: Rotenon ist giftig und gefährlich. Handhabung entsprechend geeignete Sicherheitshinweise. </li></ol></li><li> Induzieren oxidativen Stress durch Gen-Knock-down: Super-Sonder nrf2a Genexpression im Zebrafisch-Embryonen, die durch Mikroinjektion Morpholino, wie zuvor von Timme-Laragy A. et al, 2012, 38 berichtet.. </li><li> Induzieren oxidAtive Stress nach Gewebeschäden: erzeugen ein Wundrand an der Schwanzflosse von Zebrafischembryonen bei 72 hpf, wie zuvor von Niethammer et al, 2009, 39 beschrieben.. </li></ol></li><li> Bereiten 5 ml ROS-Detection-Lösung für einzelne Zelle ROS-Nachweisverfahren: <ol><li> Lösung für allgemeine ROS-Erkennung: Lösen Sie das generische ROS-sensitive molekulare Sonde in HBSS (Hanks Balanced Salt Solution), um eine funktionierende Lösung (Konzentrationsbereich: 2,5 bis 10 uM) vorzubereiten. Diese Lösung muss kurz vor Gebrauch hergestellt werden. </li><li> Lösung für den spezifischen Nachweis von ROS induzierte Mitochondrien: Kurz vor Gebrauch auflösen eine mitochondriale ROS-empfindliche Sonde mit DMSO, einen 5 mM Stammlösung. Lösen Stammlösung in HBSS, um eine Arbeitslösung (Konzentrationsbereich: 2,5 bis 10 uM) vorzubereiten. HINWEIS: Vermeiden Sie Licht und Sauerstoff Exposition von ROS-Erkennung Arbeitslösungen und ihre jeweiligen Stammlösungen. Schützen Sie den Schlauch von Licht mit Hilfeeine Aluminiumfolie. Bewahren Sie keine oder Wiederverwendung Sonden in HBSS gelöst. Bewahren Sie die Stammlösungen bei -20 ° C für einen Monat. VORSICHT: Gehen molekulare Sonden und DMSO unter einer Abzugshaube in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien. </li></ol></li><li> Bereiten 5 ml ROS-Detection-Lösung für die gesamte Halterung ROS-Nachweismethode: Lösen Sie die generische ROS-empfindliche Sonde Stammlösung (in DMSO stabilisiert) in HBSS, um eine Arbeitslösung (Konzentrationsbereich: 2,5-5 uM) vorzubereiten. Licht-und Sauerstoffeinwirkung vermeiden. Schützen Sie den Schlauch vom Licht. Diese Lösung vor dem Gebrauch. Bewahren Sie keine oder verwenden Sie wieder diese Lösung. VORSICHT: Gehen molekulare Sonden unter einer Abzugshaube in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien. </li><li> Machen 25 ml Stopplösung durch Zugabe von 10 ml fötales Rinderserum und 15 ml 1x PBS. Halten Lösung steril. Bewahren Sie die Lösung bei 4 ° C ROS Nachweisverfahren - nur für einzelne Zelle Diese Lösung benötigt. </li><li> Stellen Sie den Zebrafisch-Luft-Inkubator bei 28 &amp;# 176; C </li><li> Stellen Sie die Zentrifuge bei 4 ° C für die einzelne Zelle ROS-Erfassungsverfahren. </li></ol> 2. Paarung von Adult Fische und Auswahl von Zebrafischembryonen <ol><li> Set-up erwachsenen Zebrafisch Paar kreuzt nach Standardprotokollen 40. Wählen Sie die entsprechende transgene Linie nach bestimmten experimentellen Anforderungen. </li><li> Eier sammeln und sie in einer 90-mm-Schale mit Fisch Wasser / Embryo Medium. Halten Sie Eier bei 28 ° C bis Embryonen entwickeln und wachsen, um die gewünschte Entwicklungsstufe (zB 48 hpf, 72 hpf; hpf: Stunden nach der Befruchtung). </li><li> Bildschirm für die Entwicklung von Embryonen. Ausschließen aller unbefruchtete Eier oder Embryonen unterentwickelt. </li><li> Anesthetize Embryonen, die durch Zugabe von 1 ml Tricaine (Stammlösung) in 50 ml Fischwasser. </li><li> Wählen Tg fluoreszierende Embryonen unter einem Stereomikroskop. </li></ol> 3. Behandlung der Embryonen mit Oxydationsmittel-Agenten <ol><li> Verwenden Sie mindestens 30 Embryonen zwischen 48 hpf und 72 pro HPF unterschiedlichen Zustand. Zweimal waschen Embryonen mit frischem Fisch Wasser, um Tricaine entfernen. </li><li> Split fluoreszierende Embryonen in drei Gerichte. Legen Sie nicht mehr als 30 Embryonen / Schale. </li><li> Entfernen Sie die Waschlösung und 10 ml der Oxidationsmittellösung oder 10 ml Fischwasser als Steuerungslösung. </li><li> Embryonen für 10 min bis 1 h Inkubation bei 28 ° C. Die Inkubationszeit hängt von dem Niveau von oxidativem Stress in spezifischen Geweben induziert werden. Kurze Perioden sind die besten als Zellen durch oxidativen Stress beeinflusst zunehmend Zelltod. </li><li> Transfer-Embryonen in eine neue Schale mit HBSS und Wasch Embryonen durch Verwirbelung. Pre-warmen HBSS bei 28 ° C </li></ol> 4. Ganze Berge ROS Erkennungsmethode <ol><li> Sammeln Embryonen nach Oxidationsbehandlung und setzen nicht mehr als 10 Embryonen in einer kleinen Röhre. Spülen mit HBSS so viel wie möglich. Schützen Sie den Schlauch von Licht mit Aluminiumfolie. </li><li> 1 ml der ROS-Nachweislösung fürjedes Rohr. </li><li> Embryonen im Dunkeln für 15 min Inkubation bei 28 ° C bis Lichtexposition zu vermeiden. </li><li> Während der Inkubationszeit bereiten einen Glasobjektträger für ganze Embryo-Analyse. Setzen Sie 300 ul von Methylcellulose auf einer &quot;Depression&quot; Glasobjektträger und breitete sie auf der Glasoberfläche mit einer Pipettenspitze. Vermeiden Sie Luftblasen beim Loslassen der Methylcellulose. </li><li> Am Ende der Inkubationszeit, sofort den ROS-Detection-Lösung und zweimal waschen mit 2 ml HBSS. Waschen Embryonen durch Umdrehen des Röhrchens mehrmals. Pipettieren, oder Wirbel. </li><li> Saugen Embryonen in eine Glaspasteurpipette. Embryonen Position nahe der Öffnung der Pipette und sanft ausgeworfen sie in die Methylcellulose. Richten Sie die Embryonen entsprechend mit einem feinen Nylon-Linie. </li><li> Vergleichen Sie die Fluoreszenz der Steuer Embryonen mit behandelten Embryonen. Alternativ fixieren Parameter der Fluoreszenz-Stereomikroskop oder konfokalen Mikroskop, so dass alle Embryonen werden unter Verwendung der gleichen abgebildetenBildeinstellungen. </li></ol> 5. Single Cell ROS-Nachweisverfahren <ol><li> Beginnen Sie ab Schritt: 3.5. Achten Sie darauf, mindestens 35 Embryonen für jede Bedingung. </li><li> Übertragen Embryonen in eine neue Schüssel. Entfernen Fisch Wasser so weit wie möglich. 10 ml eiskaltem PBS und 1x 400 ul von Protease-Inhibitoren-Cocktail. Manuelles dechorionate Embryonen mit einer Pinzette und entfernen Sie den Dottersack mit einer feinen Nadel. Hinweis: Das Entfernen Dottersack sorgt für saubere Proben für die folgenden FACS-Analyse. Dieser Schritt kann nach FACS-Gerät vermieden werden. </li><li> Über de-yolked Embryonen in eine 24-Well-Multiwell-Platte (15 Embryonen / well) und entfernen Sie alle Fische Wasser. </li><li> In 300 ul HBSS, 30 ul Collagenase P, 50 ul Trypsin-EDTA in jedem gut. </li><li> Homogenisieren Embryonen durch leichtes Auf-und Abpipettieren mit einem engen Pipettenspitze (1.000 ul). </li><li> Inkubieren bei 28 ° C für 20 min und homogenisieren Proben durch Pipettieren alle 5 min. </li><li> Überprüfen Gewebe disruption durch die Beobachtung eines aliquoten Homogenat bei der Verbindung Mikroskop. Erleichterung Einzelzellsuspension pipettiert. Embryonen inkubiert Sie nicht mehr als 30 min. </li><li> Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 200 ul Stopplösung. Mischen durch Pipettieren vorsichtig. </li><li> Übertragen Zellsuspension in eine vorgekühlte Röhrchen mit dichten Boden. Halten Röhrchen auf Eis und vermeiden Belichtung. </li><li> Zentrifugieren für 5 min bei 250 × g bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie die obere Phase und wieder aussetzen Zellen mit eiskaltem HBSS durch vorsichtiges Pipettieren. </li><li> Zählen von Zellen und stellen Sie sicher, dass Sie die gleiche Anzahl von Zellen in der alle Ihre Proben. Verwenden Sie nicht weniger als 2 x 10 6 Zellen. </li><li> Zentrifuge Zellen 5 min bei 250 × g bei 4 ° C. </li><li> Überstand entfernen und die Aussetzung der Pellet mit 1 ml HBSS Eis gekühlt, das die ROS-empfindliche Sonde. </li><li> Das Röhrchen bei Raumtemperatur für 3 min in der Dunkelheit. Inkubationszeit variieren entsprechend dem Niveau von oxidativem Stress und ter Empfindlichkeit der Sonde. </li><li> Übertragungszellen zu einer FACS-Röhrchen. Halten Röhrchen auf Eis und vermeiden Belichtung vor der FACS-Analyse. </li><li> Sortieren Zellen mit einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS). Satz Wellenlängen in Übereinstimmung mit Tg Gewebefluoreszenz (z. B. GFP) und der Erreger / Emissionsspektren der molekularen Sonde für ROS Erkennung (z. B. spezifische mitochondriale ROS-empfindlichen Sonden, generische ROS empfindlichen Sonden) verwendet. </li><li> Für jede Bedingung messen alle Proben in der gleichen Versuchs Sitzung durch die Anwendung der gleichen FACS-Einstellungen. Der prozentuale Anteil der fluoreszierenden Zellen als Mittelwert der unterschiedlichen biologischen Replikaten. Analysieren Sie mindestens zwei Wiederholungen für jede Bedingung. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Kritische Schritte Das Verfahren für die Erkennung von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen hier beschriebenen zwei verschiedenen Methoden. Der ganze Berg ROS-Nachweismethode ist vor allem ein qualitativer Test zur ROS-Erkennung, während die einzelne Zelle ROS-Detektionsverfahren ermöglicht eine spezifische quantitative Messungen (Abbildung 1). Beide Methoden bieten eine schnelle und einfache Möglichkeit, in vivo ROS-Erkennung auf Zebrafischembryonen zu beurte...

Oxidativer Stress ist speziell als eine Bedingung, die aus einem unsymmetrischen zellulären Redox-Zustand ergibt definiert. Die komplexen Redox-Reaktionen, die routinemäßig in den Zellen auftreten, bestimmen die zellulären Redox-Zustand. Redox-Reaktionen umfassen alle chemischen Reaktionen, die in der Übertragung von Elektronen zwischen den Atomen von biologischen Molekülen Herstellung Reduktion und Oxidation von Molekülen (dh Redoxreaktionen) bestehen. Diese Reaktionen werden durch elektronisch aktivierten Spezies (dh pro-oxidativen Spezies), die durch eine extreme strukturelle Instabilität und spontane Aktivierung von unsymmetrischen Elektronen, die mit den Nachbar Biomolekülen auszutauschen gekennzeichnet katalysiert. Diese Reaktionen führen in unregelmäßigen DNA-Schäden, Protein Carboxylierung und Lipidoxidation, und schließlich zum Zelltod führen 1. Erhöhten oxidativen Stress mit dem Altern und dem Fortschreiten von verschiedenen pathologischen Zuständen 2 verbunden. Oxidativer Stress hatberichtet für Gefäßveränderungen bei Diabetes und Herzkreislauferkrankungen 3,4 verantwortlich zu sein. Es spielt auch eine kritische Rolle bei der neuronalen Degeneration bei Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit 5. Außerdem hat oxidativen Stress als kritischer Faktor bei der Steuerung der Tumorprogression und metastatischen Ereignisse 6,7 nachgewiesen. Darüber hinaus können Entzündungen und Immunreaktionen auslösen und weitere Unterstützung oxidativen Stress 8. Oder Stickstoff (RNS; reaktive Stickstoffspezies) in lebenden Zellen sind pro-oxidativen Spezies von Sauerstoff (reaktiver Sauerstoffspezies, ROS) abgeleitet. ROS sind das Hydroxyl-Radikal, das Superoxid-Anion (OH.) (O 2 -) und Wasserstoffperoxid (H 2 O 2). Der primäre RNS ist Stickoxid (NO).. Eine Reihe von sekundären reaktiven Spezies können durch spontane Wechselwirkung zwische erzeugt werdenn ROS und RNS oder freien Metallen Ionen 9. Beispielsweise reagiert das Superoxid-Anion mit Lachgas zu Peroxynitrat (ONOO -) zu bilden, während H 2 O 2-Reaktion mit Fe 2 + Hydroxylradikale erzeugt. ROS und RNS, die aufgrund ihrer Fähigkeit, mit verschiedenen Biomolekülen reagieren, werden als gefährliche Bedrohung für die Aufrechterhaltung der physiologischen Redox-Zustand 10. Zur Aufrechterhaltung der Redox-Zustand-Zellen werden mit einer Reihe von entgiftende Anti-Oxidationsmittel-Molekülen und Enzymen ausgestattet. Die Superoxid-Dismutase (SOD), Katalase, Glutathion-Peroxidase und Peroxiredoxine bilden im Wesentlichen die Anti-Oxidationsmittel enzymatisch-Arsenal, das Zellschutz bietet von pro-oxidative Arten, darunter H 2 O 2, OH und OONO -. 11. Auch Anti-Oxidationsmittel-Moleküle wie Vitamin C und E, Polyphenole und CoenzymeQ10 (CoQ10) sind von entscheidender Bedeutung für ROS und ihre gefährlichen de löschenDerivate 12,13. Verschiebt sich jedoch eine übermäßige Produktion von ROS und RNS oder einer Funktionsstörung in dem Antioxidationsmittel-System, das zelluläre Redox-Zustand zu oxidativem Stress 14. Neben ihren negativen Beigeschmack, können ROS verschiedenen physiologischen Rollen in Zellen verschiedener Herkunft zu spielen. Die Zellen produzieren normalerweise ROS als Signalmoleküle in den normalen biologischen Ereignisse wie der Wirtsabwehr und Wundheilung 15-17 vermitteln. Reaktiven Spezies werden normalerweise in Zellen durch intrazelluläre Enzyme, wie NOX (NADPH Oxidase) und XO (Xanthin-Oxidase) in Reaktion auf Signalfaktoren, Wachstumsfaktoren und intrazelluläre Calciumspiegel Schwankungen 18,19 hergestellt. Es wurde berichtet, dass ROS differentiell moduliert die Aktivität wichtig Kernfaktoren wie p53 oder zellulären Komponenten, wie das ATM-Kinase, ein Hauptregulator der Antwort auf DNA-Schädigung 20. Analog ROS stark beeinflussen zelluläre Signal durch Vermittlung thE-Oxidation und Inaktivierung von Protein-Tyrosin-Phosphatasen (PTPs), die als kritische Regulatoren der Signaltransduktion 21 etabliert sind. Außerdem zeigen Proteom Methodik, dass RNS auch für spezifische Protein Modifikationen und Änderungen der molekularen Signal verantwortlich. RNS reagieren mit den Cystein-Thiolgruppen modifiziert sie in S-nitrothiols (SNO) und Trigger molekularen Signalwege gleichzeitig mit pathologischen Zuständen, wie entzündliche und Autoimmunerkrankungen 22,23. Da Zellkulturexperimenten die Vielzahl der in-vivo-wirkende Faktoren nur teilweise zu reproduzieren, von großem Interesse ist es Redox-Studien in Tiermodellen 24,25 durchzuführen. Um dies zu erreichen, hat der Zebrafisch wurde als geeignete Wirbeltiermodell für oxidativen Stress Dynamik 26 studieren. Der Zebrafisch ist ein neues Modell, das System mehrere Vorteile, zellulären und genetischen Ereignisse während Wirbel dev Stipendienelopment und Krankheit. Große Cluster von Embryonen erzeugt und verfügbar werden wöchentlich für experimentellen Anforderungen. Darüber hinaus ist die außergewöhnliche optische Klarheit der Zebrafisch-Embryonen sowie ihrer geringen Größe ermöglicht die Einzelzell-Imaging und dynamische Tracking in einem ganzen Organismen 27. In den letzten zehn Jahren eine beträchtliche Anzahl von Zebrafisch-Mutanten wurden erzeugt, um menschlichen Krankheitszuständen wie Krebs und genetischen Krankheiten 28-31 modellieren. Am wichtigsten ist, eine Vielzahl von transgenen Linien wurde erstellt, um umfangreiche Möglichkeiten der genetischen und biologischen Manipulationen 32 zu ermöglichen. Zum Beispiel sind transgene Zebrafisch gewebespezifische Leitungen regelmäßig auf in-vivo-Studien verwendet. Diese Linien exprimieren ein Fluoreszenzprotein unter der Kontrolle eines ausgewählten Promotors und bietet die Möglichkeit, Einzelzellen in vivo zu identifizieren, sowie die anatomische Struktur, die sie umfassen. Mehrere toxikologischen Studien haben bereits verwendet ter Zebrafisch, um die in vivo Wirkung von Chemikalien auf Redox-Homöostase zu bewerten, was die Eignung dieser Wirbel als Tiermodell für den Bereich der Arzneimittelforschung und oxidativen Stress 33-35. Auch wenn einige fluoreszierende Sonden wurden getestet, um oxidativen Stress in Zebrafisch-Larven 36,37 zu überwachen, gibt es keine eindeutigen Tests zu erkennen und zu messen, die Niveaus von oxidativem Stress in Zebrafisch-Gewebe und lebenden Zellen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur in vivo Quantifizierung von oxidativem Stress in lebenden Zellen von Zebrafischembryonen. Imaging-Tools, FACS-Sortierung, fluoreszierende Sonden und pro-oxidative Bedingungen kombiniert, um eine einfache Test für den Nachweis und die Quantifizierung von oxidativen Spezies in Zebrafischembryos und Geweben zu erzeugen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1261">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:285px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:528px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">516813</td>
			<td>DO NOT STORE DILUITIONS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture</td>
			<td style="width:147px;">INSTANT OCEAN</td>
			<td style="width:285px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Cgeneric ROS-sensitive probe:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CellROX Deep Red Reagent</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX&#160;</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">M36008</td>
			<td>dissolve one vial with 13&#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydroethidine</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">D23107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Rotenone</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">R8875</td>
			<td>Prepare 5mM stock solution in DMSO.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine</td>
			<td style="width:147px;">EnzoLifeScience</td>
			<td>BML-EI395</td>
			<td>dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Propidium Iodide&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">7-aminoactinomycin D (7-AAD)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Nrf2a Morpholino</td>
			<td style="width:147px;">GeneTools</td>
			<td style="width:285px;">5&#39;-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3&#39;</td>
			<td>Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td>11213857001</td>
			<td>Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">10010-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td>Dissolve one tablet in 1ml of water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">15400-054</td>
			<td>Prepare 1X working solution before usage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Compound microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereo microscope with fluorescent illumination</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:285px;">AZ100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">camera&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">AxioCamMRm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">software for fluorescence image acquisition</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">ZEN 2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescence-activated cell sorter</td>
			<td style="width:147px;">BD FACSCalibur</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:285px;">5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:147px;">BD</td>
			<td>342065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell Plate&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Sterilized, non treated Petri dishes 90mm</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:285px;">391-1915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:285px;">Leica SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of oxidative stress in zebrafish embryos

Hohe Konzentrationen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), kann eine Änderung des zellulären Redox-Status zu oxidativem Stress Zustand führen. Diese Situation führt zu Oxidation von Molekülen (Lipid, DNA, Protein) und führt zum Zelltod. Oxidativer Stress beeinflusst auch das Fortschreiten von verschiedenen pathologischen Zuständen, wie Diabetes, Retinopathie, Neurodegeneration und Krebs. Somit ist es wichtig, dass Werkzeuge definieren oxidative Stressbedingungen nicht nur auf der Ebene einzelner Zellen, sondern auch im Zusammenhang mit ganzen Organismen zu untersuchen. Hier betrachten wir die Zebrafisch-Embryos als nützliches in vivo-System, solche Studien durchführen und präsentieren ein Protokoll zur in vivo oxidativen Stress messen. Unter Ausnutzung der Fluoreszenzsonden ROS und Zebrafisch transgenen fluoreszierende Linien entwickeln wir zwei verschiedene Methoden zur oxidativen Stress in vivo zu messen: i) eine &quot;ganze Embryo ROS-Nachweisverfahren&quot; für die qualitative Messung von oxidativem Stress und ii) ein &quot;Einzelzell ROS Nachweisverfahren &quot;für quantitative Messungen von oxidativem Stress. Hier zeigen wir die Wirksamkeit dieser Verfahren durch Erhöhung von oxidativem Stress in Geweben von Oxidationsmittel und physiologische oder genetische Methoden. Dieses Protokoll ist zugänglich für zukunfts genetischen Bildschirme, und es wird in Tiermodellen der oxidative Stress-Erkrankungen wie neurologische Störungen und Krebs helfen Adresse Ursache-Wirkungsbeziehungen von ROS.

Durch die Anwendung der hier beschriebenen Verfahren können wir leicht erkennen, messen und oxidativen Stress (und ROS) im Zebrafisch embryonalen Geweben. Nach der Überquerung erwachsenen Zebrafisch, werden die Eier gesammelt und bei 28 ° C bis 72 Stunden nach der Befruchtung (hpf) zu entwickeln. Um oxidativen Stress zu induzieren, schlagen wir zwei verschiedene Ansätze: 1) die Behandlung der Embryonen mit starken pro-oxidative Reagenzien oder 2) Förderung der ROS-Bildung nach Gewebeverletzung. <p class="jove_c...

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Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

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Research

JoVE Journal

Biology

36.9K Aufrufe.  University of Torino. Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses. 

Serie: Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Forschung

Biologie

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generieren Chimäre Zebrafischembryonen durch Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Metabolic-Profil-Analyse von Zebrafischembryonen

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Die Analyse der Apoptose in Zebrafischembryonen von Whole-mount Immunfluoreszenz an aktivierte Caspase 3 Detect

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Die Produktion von Haploid Zebrafischembryonen durch<em&gt; In-vitro-</em&gt; Düngung

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Mess Oxidativer Stress Widerstandsrat<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96-Well-Mikrotiterplatten

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

Comet Assay als ein indirektes Maß für Systemische Oxidativer Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...