The authors would like to thank Hans-Joachim Schurek for invaluable scientific advice. The authors would like to thank Monique Carrel and Mich&#232;le Heidemeyer for excellent technical assistance, David Penton Ribas and Nourdine Faresse for a critical reading of the manuscript and Carsten Wagner and J&#252;rg Biber for the NaPi-2a antibody. This work was supported by the Swiss National Centre for Competence in Research "Kidney.CH" and by a project grant (310030_143929/1) from the Swiss National Science Foundation.

Alle Verfahren mit Tieren in diesem Manuskript beschrieben, wurden auf Schweizer Recht durchgeführt nach und von der Veterinärverwaltung des Kantons Zürich, Schweiz genehmigt. 1. Puffer Vorbereitung <ol><li> Herstellung von Lösungen von 1 bis 4 und der ADH (ADH) -Lösung (Tabelle 1). </li><li> Bereiten Sie die Dialysepuffer (Tabelle 1). Hinweis: Dies ist der Puffer als Dialysepuffer während der Perfusion verwendet. Später werden die Erythrozyten in diesem Puffer verdünnt, um die endgültige Perfusat zu bilden. </li><li> Erythrozyt Vorbereitung. <ol><li> Verdünnte 250 ml menschlicher Erythrozyten-Konzentrat (geprüfte Material aus der lokalen Blutbank erhalten wird) auf 500 ml mit Dialysepuffer. Zentrifuge bei 2000 × g für 8 min. Entfernen Sie den Puffer, wobei keine Erythrozyten zu entfernen. 3x wiederholen. </li></ol></li><li> Bereiten Sie das Albumin (Rinderserumalbumin, BSA) Puffer. <ol><li> In 200 ml dialysis Puffer, lösen sich 44 g BSA einen Rührstab verwenden. Filtern Sie die Lösung mit Filterpapier. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Perfusat. <ol><li> Filtern Sie die Erythrozyten aus Schritt 1.3.1 durch Filterpapier in den BSA-Puffer. Füllen Sie auf ein Gesamtvolumen von 800 ml mit Dialysepuffer auf. HINWEIS: Dies ist die letzte Perfusat. Der Hämatokrit sollten nun zwischen 8 und 12% liegen. Das Perfusat kann bei 4 ° C bis zu 12 Stunden gelagert werden. </li></ol></li></ol> 2. Initiieren Dialyse und Oxygenation <ol><li> Schalten Sie das Wasserbad rund um den größeren Pufferbehälter, kleiner Pufferspeicher, und die feuchte Kammer (eine kleine, doppelwandige Kammer gebracht auf 37 ° C und 100% Luftfeuchtigkeit später die Nieren halten) bis 37 ° C (Abbildung 2) . </li><li> Füllen Sie den größeren Pufferspeicher mit dem Dialysepuffer und den kleineren Behälter mit dem Perfusat. </li><li> Schalten Sie die 5% CO 2/95% O 2 Gaszufluss zu dem Dialysepuffer. </li><li> Schalten Sie kontinuierliche Dialyse des Perfusat gegen den Dialysepuffer. Achten Sie darauf, Low-Flux-Dialyseschlauch zu verwenden. Gehen Sie zu Schritt 3. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig2.jpg" /> Abbildung 2: Schematische Darstellung des Perfusionskreislaufes. Schema zeigt die Hauptkomponenten des Perfusionskreislaufs und die Richtung des Pufferflusses. Alle Komponenten von dunkelblau umgeben sind bei 37 ° C mit einem Wasserbad / Thermostat gehalten. 1: Dialysepuffer von mindestens 3 - fache des Volumens des Puffers Perfusion mit 95% O 2/5% CO 2 kontinuierlich geperlt. 2: Dialysepuffer und Perfusionspuffer werden gegeneinander in einen Dialyseschlauch mit einer Rollenpumpe kontinuierlich dialysiert. 3: Durch diese Dialyse, die Perfusionspuffer mit 9% O 2/5% CO 2 und der Elektrolytspiegel konstant gehalten werden througho angereichertut Perfusion. 4: Eine Rollenpumpe treibt den Perfusionspuffer in Richtung auf die Niere. 5: Ein Windkessel entfernt peristaltischen Wellen und wirkt als Blasenfalle. 6: Druckwandler (verbunden mit 4. (Rollenpumpe) Dauerdruck zu halten , während frei abwechselnd Strömung erlaubt). 7: Während der Perfusion, bleibt die Niere in einer feuchten Kammer für 100% Luftfeuchtigkeit und 37 ° C Nierentemperatur. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 3. Chirurgische Verfahren Teil 1 (für ein Diagramm aller Ligaturen, siehe Abbildung 3) Hinweis: Führen Sie alle Ligatur mit 5-0 chirurgischen Faden. <ol><li> Anästhesieren einer Maus durch intraperitoneale Injektion (10 ul / g Körpergewicht, 20 mg / ml Ketamin und 1 mg / ml Xylazin in 0,9% NaCl gelöst). Bestätigen Sie eine ausreichende Tiefe von AnesthESIA durch die Prüfung für das Fehlen von hinteren Fuß Reflexe. </li><li> Befestigen Sie die Maus in Rückenlage in der feuchten Kammer. Schützen Sie die Augen mit vet Salbe. Legen Sie eine 1-ml-Spritze unterhalb der Wirbelsäule, die Lendengefäße zu erhöhen. </li><li> Führen Sie eine mittlere Laparotomie vom Schamkamm bis zum Brustbein Öffnung zuerst die Haut, dann die Bauchmuskeln, mit einer Schere. </li><li> Entfernen Sie den Darm und legen Sie sie auf der linken Seite der Maus seitlich aus dem Bauch. </li><li> Befreien Sie die Blase aus Bindegewebe und erforschen beide Harnleiter und die Harnröhre. </li><li> Legen Sie eine Ligatur um die linke Harnleiter (Ligatur I). Schließen Sie es. </li><li> Legen Sie eine Ligatur um die Harnröhre (Ligatur II). Schließen Sie es. </li><li> Setzen Sie ein &quot;Lasso&quot; Ligatur um die ganze Blase (Ligatur III). </li><li> Inzision der Blase 1 mm. </li><li> Kanülieren die Öffnung mit 2 cm PE 50 Schläuchen. </li><li> Schließen Ligatur III um das Rohr. </li><li> Schneiden Sie die linke Harnleiter und Harnröhre entfernt von der Ligatur. Die bladder wird jetzt nur auf der rechten Seite Harnleiter befestigt und frei bewegen. </li><li> Deaktivieren Sie die Bauchaorta von Bindegewebe und Fett. </li><li> Legen Sie eine Bauch Mitte Aorta Ligatur (Ligatur IV). </li><li> Legen Sie eine Ligatur um die Aorta unterhalb der Membran zwischen der A. mesenterica superior und der Zöliakie-Stamm (Ligatur V). </li><li> Legen Sie eine Ligatur um die A. mesenterica superior (Ligatur VI). </li><li> Legen Sie eine Aorten-Ligatur direkt unter dem rechten und über dem linken Nierenarterie (Ligatur VII). </li><li> Legen Sie eine Ligatur um die Schwanzvene Paket (Cava) (Ligatur VIII). Gehen Sie zu Schritt 4. </li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig3.jpg" /> Abbildung 3: Schematische Darstellung der Ligatures während der Operation gegeben. Mit Blick auf das offene Bauch nach der Laparotomie. Der Darm wird nach links ausgezogen. L und R zeigen die linke und die rechte Niere. Dasschwarze Linien zeigen den Bereich der jeweiligen Ligatur. Ligatures werden immer zuerst gesetzt und dann geschlossen, in der im Text angegebenen Reihenfolge. X markiert die Lage des Einschnitts für Aorta Kanülierung. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 4. Priming des Perfusionskreislaufes <ol><li> Starten Sie die Kreiselpumpe und füllen Sie den Schlauch mit Perfusat. Achten Sie darauf, alle Luftblasen aus sie zu leeren. </li><li> Füllen Sie das Windkessel Gerät etwa der mittleren Ebene mit Perfusat. </li><li> Kalibrieren Sie den Druckwandler auf 0 mm Hg, wenn alle Rohre gefüllt und Strömung ist 0. während dieser Zeit die Perfusion Nadel bei Nieren Niveau zu halten. </li><li> Halten Sie Fluss auf einem konstanten minimalen Niveau (0,6 ml / min) und gehen Sie zu Schritt 5. </li></ol> 5. Chirurgisches Verfahren Teil 2 <ol><li> Legen Sie eine Klammer zwischen Ligatur IV und der Verzweigung des linken renal Arterie. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Aorta Schwanz- der Ligatur IV, dabei nicht die Rückwand zu schneiden. </li><li> Dilatieren die Öffnung in der Aorta mit einem Gefäß Dilatator. </li><li> nur an der Klemme kanülieren die Aorta mit einer Nadel (2 cm lang, zog 50 PE), die Spitze schieben. </li><li> Öffnen Sie die Klemme. </li><li> Schieben Sie die Spitze der Nadel kranial, bis sie die Kreuzung der rechten Nierenarterie und der Aorta erreicht. </li><li> Schließen Ligatur VII. </li><li> Schließen Ligatur IV. </li><li> Öffnen Sie die Brust mit einer Schere durch die Membran zu sezieren. Mit einem einzigen Schnitt, trennen Sie die Aorta, Hohlvene, Herz und vegetative Nerven. Mit diesem Schritt wird das Tier über eine schnelle Ausbluten unter kontinuierlicher tiefer Narkose getötet. </li><li> Starten Drucksteuerung der Perfusionspumpe. Pflegen Sie den mittleren Druck zwischen 80 und 100 mmHg. </li><li> Schließen Ligatur V. </li><li> Schließen Ligatur VI. </li><li> Schließen Ligatur VIII. </li><li> Freie die rechte Niere von Binde- tissue und seine Einbettung in die adipösen Kapsel mit einer Schere. </li><li> Schneiden proximal die Aorta V. Ligatur </li><li> Schneiden Sie die A. mesenterica superior distal VI Ligatur. </li><li> Schneiden Sie die Niere tragende Gefäßbündel aus, dabei nicht in die Gefäße selbst zu schneiden. </li><li> Schneiden die Leber an der Verbindung mit der Niere. Achten Sie darauf, die Niere zu befreien, aber ein kleiner Teil der Leber verwachsen sie verlassen, so dass die Hohlvene wird durch sie offen gehalten. </li><li> Nehmen Sie die Niere Bündel aus der Maus. Entfernen Sie die Maus aus der feuchten Kammer. </li><li> Setzen Sie ein &quot;Lasso&quot; Ligatur um die Verbindung von Leber und Niere (Ligatur IX). </li><li> Kanülieren die Hohlvene mit einer venösen Leitung (2 cm PE 50). </li><li> Schließen Ligatur IX. Venöse Abfluss durch die venöse Leitung sollte sofort beginnen. </li><li> Schließen Sie die feuchte Kammer. </li></ol> 6. Downstream-Analysen <ol><li> Während der folgenden Stunde, überwachen kontinuierlich den Blutfluss und intravascular Druck 15. Sammeln Sie venösen Abfluss, die 7 für die Analyse von zum Beispiel Nierenreninfreisetzung verwendet werden kann. Sammeln Sie Urin für die Analyse der Elektrolytkonzentration und der glomerulären Filtrationsrate 14. Nach 1 Stunde Perfusion kann Nieren für Western - Blot werden schockgefroren oder für die Bildgebung Ansätze 16 festgelegt werden. </li></ol>

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</ol>

The authors have no competing financial interests and nothing else to disclose.

Die Maus perfundierte Niere isoliert ist ein Werkzeug für die Untersuchung der Nierenfunktion in einer kontrollierten Umgebung ex vivo für 1 h, die Lücke zwischen den in vivo Experimenten in intakten Tieren, die durch die Wirkung zahlreicher systemischer Faktoren fehlerhaft sein kann, und in vitro - Experimenten in isoliert nephron Segmente oder kultivierten Zellen, die notwendigerweise die Auswirkungen der intakten Organstruktur auf Funktion vernachlässigen. Es ist, nach Kenntnis der Auto...

Die isolierte Perfusion von Organen hat unter Physiologen seit vielen Jahrzehnten ein Gegenstand einer laufenden Bemühungen gewesen. Die Technik ermöglicht es, die Funktion des Organs, ohne systemische Einflüsse wie Blutdruck, Hormone oder Nerven, untersucht werden. Carl Eduard Loebell gilt als der erste sein , um die erfolgreiche Perfusion eines isolierten Niere beschrieben haben, im Jahr 1849 2. Seitdem hat sich die Perfusionsgerät erhebliche Verfeinerung erfahren. Frey und Gruber führte eine künstliche Lunge für die Sauerstoffversorgung und pulsatile Pumpen für kontinuierliche Perfusion 2. Während frühe Forscher vor allem die Nieren von großen Säugetieren nämlich sucht, Schweine und Hunde 2 3 -der erste Bericht über die Verwendung von Rattennieren, die von Weiss et al. , War in der Studie der kleinen Säuger-Organperfusion 4 ein Meilenstein. Schurek et al. die Notwendigkeit der Zugabe von Säugetieren Erythrozyten zu dem Perfusat, wenn eine ausreichende renale tubuläre berichtetOxygenierung wurde auf 5 erreicht werden. Kritisch für Langzeitversuchen war die Einführung der kontinuierlichen Dialyse des Puffers von der gleichen Arbeitsgruppe 6. Im Jahr 2003 Schweda et al. waren die ersten , eine funktionelle Maus isoliert perfundierten Niere (MIPK) 7, verfeinert später von Rahgozar et al berichten. 18 und Lindell et al. 14. Während technisch schwieriger als die Ratte perfundierten Nieren isoliert, trägt die Verwendung des MIPK den Vorteil, die Verwendung einer Vielzahl von genetisch veränderten Mäusen ermöglichen. Dieses Papier stellt die Einzelheiten des Verfahrens der Autoren für die Perfusion von isolierten Maus-Nieren für 1 Stunde. Das Verfahren ermöglicht die kontinuierliche Messung der Nierendurchflussrate, Gefäßwiderstand, Hormonfreisetzung, Blutgasanalyse, Urinanalyse und die Anwendung von Medikamenten. Nach dem Verfahren könnte Nieren für molekulare und biochemische Analyse verarbeitet werden, für die Mikroskopie festgelegt werden, odertransplantierten in eine Empfängermaus (Abbildung 1). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig1.jpg" /> Abbildung 1: Übersicht über die möglichen Input / Output an den isolierten perfundierten Nieren. BGA: Blutgasanalyse. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Diese Technik wird wahrscheinlich erhalten Aufmerksamkeit in den kommenden Jahren zu erhöhen, da viele innovative Anwendungen sind mit dem Beginn der verlängerten normothermic Nierenperfusion vor der Transplantation diskutiert (mit oder ohne die Anwendung von Anti-Ablehnung oder Genom-Bearbeitung Drogen) 8, 9, 10 , 11, die Bioengineering von ganzen Nieren von dezellularisierten Gerüste 12 und die Anwendung von hohen Dosen von fluoreszierenden Farbstoffen für Mehrphotonenabbildungs 13 </sup&gt;. Es ist auch ein ideales Modell , mit dem 14 die Rolle spezifischer Gene während der akuten Nierenschädigung zu untersuchen. Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll gegeben anderen Labors zu ermöglichen isolierten Maus Nierenperfusion erfolgreich durchzuführen. Zuerst wird die Zusammensetzung und die Herstellung des Puffers spezifiziert. Dann wird die Operation im Detail beschrieben und die kritischen Schritte gezeigt. Drittens werden Daten vorgestellt, die repräsentativ für eine erfolgreiche Vorbereitung: Nierendurchblutung, Gefäßwiderstand, glomeruläre Filtrationsrate und fraktionierte Elektrolytausscheidung-alle als funktionelle Messungen der Lebensfähigkeit-und transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahmen der Morphologie verschiedener nephron Segmente perfundiert Nieren nach 1 Stunde der Perfusion fixiert.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Perfusion Circuit:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moist chamber 834/8</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2901</td><td></td></tr><tr><td>Cannular with basket and side port</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2947</td><td></td></tr><tr><td>Thermostat TC120-ST5&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-4544</td><td></td></tr><tr><td>ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-0114</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir jacketed for buffer solution 1 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3438</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3436</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Transducer APT300&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>TAM-D Plugsys Transducer</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-1793</td><td></td></tr><tr><td>SCP Plugsys servo controller</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2806</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3717</td><td></td></tr><tr><td>HSE-USB data acquisition</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3330</td><td></td></tr><tr><td>Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone</td><td>B.Braun</td><td>7203525</td><td></td></tr><tr><td>PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D.</td><td>Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffer reagents:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoplasmal 10%</td><td>B.Braun</td><td>134518064</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid monosodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-Malic acid sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1125-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium-L-Lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022-10G</td><td></td></tr><tr><td>alpha-Ketoglutaric acid sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1875-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60130-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Creatinine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4255-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Roche</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; * 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; * 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Riedel-de-Ha&amp;euml;n</td><td>12074</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td>Antidiuretic Hormone dDAVP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2013-1MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter used for erythrocyte filtration</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 615</td><td></td></tr><tr><td>BGA Analysis:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABL 80 flex</td><td>Radiometer Medical ApS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscope:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM100 TEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the mouse isolated perfused kidney technique

Die Maus isoliert perfundierten Nieren (MIPK) ist eine Technik zum Halten einer Mausniere unter ex vivo - Bedingungen durchbluteten und funktionell für 1 Std. Dies ist eine Voraussetzung für die Physiologie des isolierten Organs zu studieren und für viele innovative Anwendungen, die in der Zukunft möglich sein, einschließlich Perfusion Dezellularisierung für Nieren Biotechnik oder die Verabreichung von anti-Ablehnung oder Genom-Bearbeitung Medikamente in hohen Dosen zu grundieren der Niere für die Transplantation. Während der Zeit der Perfusion kann die Niere manipuliert werden, kann die Nierenfunktion bewertet werden, und verschiedene Arzneimittel verabreicht. Nach dem Verfahren kann die Niere für die Molekularbiologie, biochemische Analyse oder Mikroskopie transplantierten oder verarbeitet werden. Dieses Papier beschreibt die Perfusat und die chirurgische Technik für die ex vivo Perfusion von Mausnieren benötigt. Einzelheiten der Perfusionsgerät gegeben und Daten vorgestellt, die v zeigtAFTUNG der Zubereitung der Niere: Nierendurchblutung, Gefäßwiderstand und Urin Daten als funktionelle, Transmissionselektronenmikrographien verschiedener nephron Segmente als morphologische Ablesungen und Western-Blots von Transportproteinen verschiedener nephron Segmente als molekulare Anzeige.

Mit dem Verfahren isolierten Maus-Nieren beschrieben, kann für mindestens 1 h lebensfähig bleiben. Wir testeten die Gewebelebensfähigkeit nach 1 Stunde der kontinuierlichen Perfusion mit funktionellen (Nierendurchblutung und Gefäßwiderstand, Blutgasanalyse von venösen Abflusses, der glomerulären Filtrationsrate, Harn- fraktionierte Na + und K + -Ausscheidung und Urinosmolalität) und morphologischen (Transmissionselektronenmikroskop Mikroskopie TEM) Methods i...

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The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Die Maus isoliert perfundierten Nieren (MIPK) ist eine Technik zum Halten einer Mausniere unter ex vivo - Bedingungen durchbluteten und funktionell für 1 Std. Die Puffer und die chirurgische Technik werden ausführlich beschrieben.

Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

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Research

JoVE Journal

Biology

21.7K Aufrufe.  University of Zürich.  Die Maus isoliert perfundierten Nieren (MIPK) ist eine Technik zum Halten einer Mausniere unter ex vivo - Bedingungen durchbluteten und funktionell für 1 Std. Die Puffer und die chirurgische Technik werden ausführlich beschrieben. 

Serie: The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients revealed that only a mild increase in serum creatinine levels (0.3 to 0.4 mg/dl) is associated with a 70% greater risk of death than in persons without any increase 1. Along these lines, surgical procedures requiring cross-clamping of the aorta and renal vessels are associated with a renal failure rates of up to 30% 4. Similarly, AKI after cardiac surgery occurs in over 10% of patients under normal circumstances and is associated with dramatic increases in mortality. AKI are also common complications after liver transplantation. At least 8-17% of patients end up requiring renal replacement therapy 5. Moreover, delayed graft function due to tubule cell injury during kidney transplantation is frequently related to ischemia-associated AKI 6. Moreover, AKI occurs in approximately 20% of patients suffering from sepsis 6.The occurrence of AKI is associated with dramatic increases of morbidity and mortality 1. Therapeutic approaches are very limited and the majority of interventional trials in AKI have failed in humans. Therefore, additional therapeutic modalities to prevent renal injury from ischemia are urgently needed 3, 7-9. 
To elucidate mechanisms of renal injury due to ischemia and possible therapeutic strategies murine models are intensively required 7-13. Mouse models provide the possibility of utilizing different genetic models including gene-targeted mice and tissue specific gene-targeted mice (cre-flox system). However, murine renal ischemia is technically challenging and experimental details significantly influence results. We performed a systematic evaluation of a novel model for isolated renal artery occlusion in mice, which specifically avoids the use of clamping or suturing the renal pedicle 14. This model requires a nephrectomy of the right kidney since ischemia can be only performed in one kidney due to the experimental setting. In fact, by using a hanging-weight system, the renal artery is only instrumented once throughout the surgical procedure. In addition, no venous or urethral obstruction occurs with this technique. We could demonstrate time-dose-dependent and highly reproducible renal injury with ischemia by measuring serum creatinine. Moreover, when comparing this new model with conventional clamping of the whole pedicle, renal protection by ischemic preconditioning is more profound and more reliable. Therefore his new technique might be useful for other researchers who are working in the field of acute kidney injury.

A precise murine model for acute kidney injury (AKI) due to ischemia is an important tool to investigate acute kidney injury and possibly find therapeutic tools to treat renal injury. The hanging weight system offers a tool for immediate and reliable renal artery occlusion and reperfusion without causing renal congestion.

Die Verwendung eines Hanging-weight-System für Isolated Nierenarterie Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

Forschung

Medizin

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and podocytes with their slit diaphragms. The delicate structure of the glomerular filter, especially the slit diaphragm, relies on the interplay of diverse cell surface proteins. Studying these cell surface proteins has so far been limited to in vitro studies or histologic analysis. Here, we present a murine in vivo biotinylation labeling method, which enables the study of glomerular cell surface proteins under physiologic and pathophysiologic conditions. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of a protein of interest. Semi-quantitation of glomerular cell surface abundance is readily available with this novel method, and all proteins accessible to biotin perfusion and immunoprecipitation can be studied. In addition, isolation of glomeruli with or without biotinylation enables further analysis of glomerular RNA and protein as well as primary glomerular cell culture (i.e., primary podocyte cell culture).

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Here we present a protocol for murine in vivo labeling of glomerular cell surface proteins with biotin. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of the protein of interest.

Isolierung der Glomeruli und In Vivo Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Biochemie

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kidney diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in the permeability barrier comprised of podocytes, vascular endothelial cells, and a basement membrane working in unison. Data from our laboratory using intravital 2-photon microscopy revealed a more permeable glomerular filtration barrier (GFB) than previously thought under physiologic conditions, with retrieval of filtered albumin occurring in an early subset of cells called proximal tubule cells (PTC)1,2,3.
Previous techniques used to study renal filtration and establishing the characteristic of the filtration barrier involved micropuncture of the lumen of these early tubular segments with sampling of the fluid content and analysis4. These studies determined albumin concentration in the luminal fluid to be virtually non-existent; corresponding closely to what is normally detected in the urine. However, characterization of dextran polymers with defined sizes by this technique revealed those of a size similar to serum albumin had higher levels in the tubular lumen and urine; suggesting increased permeability5.
Herein is a detailed outline of the technique used to directly visualize and quantify glomerular fluorescent albumin permeability in vivo. This method allows for detection of filtered albumin across the filtration barrier into Bowman's space (the initial chamber of urinary filtration); and also allows quantification of albumin reabsorption by proximal tubules and visualization of subsequent albumin transcytosis6. The absence of fluorescent albumin along later tubular segments en route to the bladder highlights the efficiency of the retrieval pathway in the earlier proximal tubule segments. Moreover, when this technique was applied to determine permeability of dextrans having a similar size to albumin virtually identical permeability values were reported2. These observations directly support the need to expand the focus of many proteinuric renal diseases to included alterations in proximal tubule cell reclamation.

A technique utilizing high resolution intavital 2-photon microscopy to directly visualize and quantify gloemrular filtration in surface glomeruli. This method allows for direct determination of permeability characteristics of macromolecules in both normal and diseased states.

Quantifizierung glomeruläre Permeabilität von fluoreszierenden Makromoleküle Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Ratten

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

Zuverlässig und High Efficiency Extraktion von Nieren-Immunzellen

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

Immunologie und Infektion

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only one-fourth of these patients achieving transplantation, there is a dire need for alternatives for those with failing organs. In order to decrease the harmful consequences of dialysis along with the overall healthcare costs it incurs, active investigation is ongoing in search of alternative solutions to organ transplantation. Implantable tissue-engineered renal cellular constructs are one such feasible approach to replacing lost renal functionality. Here, described for the first time, is the microdissection of murine kidneys for isolation of living corticomedullary renal segments. These segments are capable of rapid incorporation within scaffold-free endothelial-fibroblast constructs which may enable rapid connection with host vasculature once implanted. Adult mouse kidneys were procured from living donors, followed by stereoscope microdissection to obtain renal segments 200 - 300 &#181;m in diameter. Multiple renal constructs were fabricated using primary renal segments harvested from only one kidney. This method demonstrates a procedure which could salvage functional renal tissue from organs that would otherwise be discarded.

Tissue-engineered renal constructs provide a solution for the organ shortage and deleterious effects of dialysis. Here, we describe a protocol to micro dissect murine kidneys for isolation of cortico-medullary segments. These segments are implanted into scaffold-free cellular constructs, forming renal organoids.

Mikrodissektion primäre renale Gewebe Segmente und Einbindung mit neuartigen Gerüst-freie Konstrukt-Technologie

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Biotechnik

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

Optische Seimierung und Bildgebung von immunomarkiertem Nierengewebe

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

A Quantitative Detection Method for MicroRNAs in the Kidney of an Ischemic Kidney Injury Mouse Model

MicroRNAs (miRNAs) are involved in various disease states and are effective biomarkers for the early diagnosis of diseases and treatment in mice. However, standard protocols for the purification of miRNAs and detection of their expression in the kidneys of acute kidney injury (AKI) mice have not been well established. This study developed an effective and simple protocol to purify and quantify miRNAs in the kidneys of an AKI mouse model induced by renal ischemia-reperfusion using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol comprises five steps: 1) induction of AKI by renal ischemia-reperfusion, 2) harvesting of kidneys, 3) purification of total RNA, including miRNAs, from kidneys, 4) cDNA synthesis by reverse transcription of miRNA, and 5) qRT-PCR to detect miRNA expression. Using this protocol, the renal ischemia-reperfusion injury model can be generated with mild to severe forms of AKI. Additionally, if the procedure is followed properly, a consistent AKI model with minimal individual differences can be obtained. This qRT-PCR assay shows a very wide dynamic range and enables the discrimination of mature miRNAs, which can be accurately quantified with high specificity. This protocol can be used to study the miRNA expression profile in AKI kidneys.

<meta charset="utf8"></head><body>Eine quantitative Nachweismethode für microRNAs in der Niere eines Mausmodells mit ischämischer Nierenschädigung

This article presents a protocol for detecting microRNA expression in the kidneys of an acute kidney injury mouse model using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. This protocol emphasizes an ischemic kidney injury mouse model and the careful extraction of microRNA samples.

Eine quantitative Nachweismethode für microRNAs in der Niere eines Mausmodells mit ischämischer Nierenschädigung

MicroRNAs (miRNAs) are involved in various disease states and are effective biomarkers for the early diagnosis of diseases and treatment in mice. However, ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, propulsive contractions. Regular RP contractions rely on pacemaker activity, which originates from the most proximal region of the RP at the pelvis-kidney junction (PKJ). Due to the difficulty in accessing and preserving intact preparations of the PKJ, most investigations on RP pacemaking have focused on single-cell electrophysiology and Ca2+ imaging experiments. Although important revelations on RP pacemaking have emerged from such work, these experiments have several intrinsic limitations, including the inability to accurately determine cellular identity in mixed suspensions and the lack of in situ imaging of RP pacemaker activity. These factors have resulted in a limited understanding of the mechanisms that underlie normal rhythmic RP contractions. In this paper, a protocol is described to prepare intact segments of mouse PKJ using a vibratome sectioning technique. By combining this approach with mice expressing cell-specific reporters and genetically encoded Ca2+ indicators, investigators may be able to more accurately study the specific cell types and mechanisms responsible for peristaltic RP contractions that are vital for normal urine transport.

The goal of this protocol is to isolate intact pacemaker regions of the mouse renal pelvis using vibratome sectioning. These sections can then be used for in situ Ca2+ imaging to elucidate Ca2+ transient properties of pacemaker cells and other interstitial cells in vibratome slices.

Isolierung und Bildgebung von live, intakten Herzschrittmacherregionen des Nierenbeckens der Maus durch Vibratom-Schnitte

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...

Biologie

Glomeruli Isolation: A Technique to Obtain Intact Glomeruli from Murine Kidney

Source: Eymael, J. et al. <a href="https://www.jove.com/video/60324" target="_blank">Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video describes the method to isolate intact glomeruli from mouse kidneys. The encapsulated and decapsulated glomeruli thus obtained can further be used for culturing parietal epithelial cell outgrowths from the murine kidney.

Glomeruli-Isolierung: Eine Technik zur Gewinnung intakter Glomeruli aus der Murine

Source: Eymael, J. et al. Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation. J. Vis. Exp. ...

Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

Zusammenfassung

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Eine quantitative Nachweismethode für microRNAs in der Niere eines Mausmodells mit ischämischer Nierenschädigung

Eine quantitative Nachweismethode für microRNAs in der Niere eines Mausmodells mit ischämischer Nierenschädigung

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