Mass Spectrometrie-Guided Genome Mining als Werkzeug zur Aufdeckung neuartiger Naturprodukte

Die gesamte Genomsequenzierung, der Genomabbau und die molekulare Vernetzung bilden die Grundlage für den Leitfaden für die Massenspektrometrie, das Genom-Mining-Protokoll, das wir hier beschreiben. Und sind der zeitgemäßesten Ansatz in der Entdeckung von Naturprodukten. Genomabbau und molekulare Vernetzung passen in Clustern zusammen, in kodierten Anmerkungen in der sequenziären Sequenzierung des gesamten Genoms mit chemischen Restruktursignaturen aus Rohextrakten, die massive Aussichten auf die Aufdeckung von Nabel durch aktive Moleküle bieten.

Im Prinzip zielt der Genomabbau auf eine einzelne oder eine kleine Gruppe von Molekülen pro Experiment ab. Dadurch führt eine langsame Erkennungsrate. In diesem Sinne stellt die Verwendung des Genombergbaus zusammen mit molekularer Vernetzung einen wichtigen Fortschritt für die Naturprodukteforschung dar.

Massenspektrometrie-Guide-Genom-Mining ist eine vielseitige Methode, die Informationen über mehrere Chemotypen strukturieren kann, die in der großen Datenmenge aus einem Rohextrakt gleichzeitig enthalten sind. Heute ist es High-Range-Methodik in der Lage, bakterielle, Pilz oder Pflanzen Sequenz zur Verfügung zu erforschen. Chemotyp zu Genotyp und Genotyp zu Chemotyp Bioinformatik Verbindungen zwischen biosynthetischen Clustern und sind kleine Moleküle Produkte.

Das Hören des Protokolls wird gezeigt, um Nabelzyklus Tiefen Peptid-Produkte in metabolischen Extrakten von Streptomyces Arten beobachtet charakterisieren. Aber es gilt für Pilz und Pflanzen Sequenz und Extrakte sowie. Es ist sehr wichtig, schön kuratierte Genom-Datasets zu haben und heutzutage werden fragmentierte Entwurfssequenzen zunehmend durch nahezu fertige Sequenzdaten verdrängt.

Außerdem wurden verschiedene Strategien entwickelt, um zugang zu neuen bioaktiven Naturprodukten zu erhalten und diese sicherlich mit dem MS-Guide-Ansatz zu kombinieren. Wir werden zu einer Verbesserung der Isolierung natürlicher Produkte und der Strukturaufklärung führen. Da wir hier den Genotyp mit dem Chemotyp-Ansatz verbinden, sind Bioinformatik-Verbindungen zwischen biosynthetischen Clustern und kleinen Molekülprodukten entscheidend.

die Sorte und Klasse der Verbindungen zu schätzen und nach Genom zu kodieren. Das bedeutet die Replikation. Später kann Clustering basierend auf Ionenähnlichkeiten mithilfe von GNPS vorgeformt werden.

Die Demonstration des Verfahrens wird Dr. Renata Sigrist und Professor Angolini meine Mitarbeiter in dieser Studie sein. Um in Silico Informationen über sekundäre Stoffwechsel-Gencluster zu erhalten, werden Anmerkungen aus einem vollständigen Sequenzgenom. Senden Sie die Sequenzdatei, Genbank E-M-B-L oder schnelleres Format, an eine Anti-Smash-Plattform.

So wie die Gencluster von Interesse aus den Ausgabedaten auf der Grundlage der ähnlich bekannten Cluster. Basierend auf den DNA-Sequenzinformationen des BGC entwerfen Sie Primaries zwischen 20 und 25 Nukleotiden, die den Gencluster für Ecoli-Streptomycen flankieren. Künstliche Chromosomenbibliothek Screening.

Nach Erhalt des rekombinanten heterologen Organismus nach dem Manuskript, impfen Sie ein 100. der Stämme Präkultur in geeigneten Fermentationsmedien. Wie flüssige ISP2-Medien. Platzieren Sie die Kultur sieben Tage lang auf einem Inkubator bei 30 Grad Celsius und 220 RPM.

Zentrifugieren Sie die Kulturen nach der Impfung 10 Minuten lang bei 2200 mal G. Entsorgen Sie die Zellen und übertragen Sie den Überstand in einen Trenntrichter. Fügen Sie eins zu einem Volumen von Ethylacetat und schütteln.

Warten Sie ein bis drei Minuten, bis sich die organischen und akzeptierten Schichten trennen. Und die organische Schicht in einem Erlenmeyerkolben sammeln. So erfassen Sie MS/MS-Daten.

Programmieren Sie geeignete HPLC- und Massenspektrometrie-Methoden mit der Steuerungssoftware. Es wird darauf hingewiesen, dass MS/MS-Netzwerke das nachweisbare molekulare Netzwerk unter den gegebenen spektrometrischen Massenbedingungen sind. Konvertieren Sie Massenspektren im mzXML-Format mit MS Convert from protea Wizard.

Passen Sie die Eingabeparameter für die Konvertierung an. Laden Sie die konvertierten LC-MS/MS-Dateien in die GNPS-Datenbank hoch. Es stehen zwei Optionen zur Verfügung.

Verwenden eines Dateiübertragungsprotokolls oder direkt in einem Browser über die Online-Plattform. Melden Sie sich nach dem Erstellen eines Kontos in GNPS bei dem erstellten Konto an, und wählen Sie ein molekulares Netzwerk erstellen aus. Fügen Sie eine Stellenbezeichnung hinzu.

So führen Sie grundlegende Optionen aus. Wählen Sie die mzXML-Dateien aus, um das molekulare Netzwerk auszuführen. Organisieren Sie sie in bis zu sechs Gruppen.

So wie die Bibliotheken für die Dereplikationsroutine. Wählen Sie die Vorläufer-Ionen-Massentoleranz und -Fragment Da auf Massentoleranz von 0,02 Dalton bzw. 0,05 Dalton aus. Um erweiterte Netzwerkoptionen auszuführen, wählen Sie die Parameter aus, die die Größe und das Formular des Netzwerkclusters direkt beeinflusst haben.

Erweiterte Parameter finden Sie in der GNPS-Dokumentation. Wählen Sie eine E-Mail-Adresse aus, um eine Benachrichtigung zu erhalten, wenn die Arbeit abgeschlossen ist, und senden Sie den Auftrag. So analysieren Sie die GNPS-Ergebnisse.

Melden Sie sich bei GNPS an. Wählen Sie Aufträge aus, veröffentlichten Auftrag, der zum Öffnen eines Auftrags ausgeführt wurde. Eine Webseite wird geöffnet, auf der alle Ergebnisse aus der molekularen Vernetzung angezeigt werden.

Wählen Sie Spektralfamilien in der Browsernetzwerkvisualisierung anzeigen, um alle Netzwerkcluster anzuzeigen. Eine Liste wird mit allen generierten molekularen Netzwerkclustern angezeigt. Die vorläufige molekulare Identifikation wird in allen IDs angezeigt.

Wählen Sie anzeigen aus, um sie zu visualisieren. Um den molekularen Netzwerkcluster zu analysieren, wählen Sie Netzwerk visualisieren aus. Wählen Sie im Feld Knotenbeschriftungen die übergeordnete Masse aus.

Wählen Sie im Feld Kantenbeschriftungen Co-Sign oder Delta Emz aus. So beobachten Sie Knotenähnlichkeit oder Massendifferenz zwischen Knoten. Klicken Sie bei der Analyse mehrerer Gruppen im Feld Knotenfärbung auf Kreisstriche zeichnen.

So beobachten Sie die Häufigkeit, mit der jeder Knoten in jeder Gruppe angezeigt wird. Um alle Bibliotheken anzuzeigen, wählen Sie Ansicht, alle Bibliotheken, Treffer aus. Öffnen Sie die Fragmentierungsspektren direkt in der GNPS-Plattform.

Oder in Original-Rohdateien, um Dereplikationsverbindungen und Strukturaufklärung verwandter Verbindungen manuell zu bestätigen. Das Protokoll wurde erfolgreich anhand einer Kombination aus Genom-Mining, heterologer Expression und MS-geführten Codeansätzen veranschaulicht. Zugang zu neuen spezialisierten Valinomycin- und analogen Molekülen.

Der Genom-Molekül-Workflow für das Zielvalinomycin wird hier vorgestellt. Das Chromatogramm zeigte, dass Valinomycin, Montanastatin und fünf Analoga durch Valinomycin, biosynthetische Gencluster-Expression in einem heterologen Wirt, hergestellt wurden. Molekulare Vernetzungsionen entsprechend Valinomycin, einer bereits bekannten Verbindung mit den entsprechenden biosynthetischen Genclustern, die in Streptomyces-Arten mit Anmerkungen anmerkungiert werden, CBM AI zwei Null-vier-Zwei-Genome.

Sind mit Ionen im Zusammenhang mit Analogen gruppiert, zuerst für Valinomycin biosynthetischegen Gencluster beschrieben. Die MS-Spektren und chemischen Strukturen für Valinomycin und verwandte Analoga sind hier dargestellt. Die Durchführung der gesamten Genomsequenzierung und die richtige Kuratierung von Datensätzen ist der erste Schritt zur Wahl eines biosynthetischen Clusters für MS-Guide the Genom mining.

Das gesamte Verfahren kann mit den Wild-Typen String Rohextrakt durchgeführt werden, aber Sie können wählen Sie den Gen-Cluster von Ihrem Interesse und heterologe Expression fördern. Verschiedene Methoden werden beschrieben, um den gesamten biosynthetischen Gencluster aus einer DNA-Probe zu erfassen. Der größte Vorteil dieses Protokolls ist seine Fähigkeit, stoffwechselmetabolische Profile schnell zu replizieren und genomische Informationen mit MS-Daten zu züchten.

Um diese wie neue Moleküle aufzuklären. Und der Massen-Guide-Genom-Bergbau wurde zunächst auf dem Gebiet der Peptidgenomik und Glykogenomik von Doris Chime und Kollegen beschrieben. Und nach der Einführung des NPS-Integrierten Metabolomics und Genom-Mining-Ansatzes sind die vielseitigsten Möglichkeiten geworden, molekulare Netzwerke mit biosynthetischen Fähigkeiten zu verbinden.