Die Autoren danken Dale Leitman für die Erstausbildung in der Verwendung von transienten Transfektions-Assays zur Bestimmung der östrogenen Aktivität von Primatenpflanzen. Vielen Dank an Bradford Westrich und C. Eric Johnson für die Unterstützung bei der Einrichtung von Laborgeräten und der Ausbildung von Studenten in Extraktionsmethoden. Abschließend möchte ich mich bei der Indiana University für die Finanzierung dieser Forschung bedanken.

1. Herstellung von Pflanzenmaterialien
<ol><li>Einfrieren von trockenen Pflanzenartikeln, die frisch mit einem Lyophilizer gesammelt wurden.<ol>
<li>Um Proben vor Licht zu schützen, decken Sie Kammern mit Aluminiumfolie während des Trocknungsprozesses ab.</li>
		<li>Um sicherzustellen, dass die Proben vollständig trocken sind, lyophilisieren, bis sich die Kammern nicht mehr kalt anfühlen und Pflanzenmaterialien beim Wiegen nicht mehr an Masse verlieren.</li>
		<li>Trockene Pflanzen in sterilen Säcken mit geringem Rückstand lagern, wenn bis zum Mahlen kein Licht entsteht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fein schleifen von Proben mit einer Schleifmühle mit 0,85 mm Maschensieb.<ol>
<li>Bewahren Sie die Bodenproben in den Säcken in Abwesenheit von Licht bis zur Extraktion auf.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Extraktion von pflanzlichen Sekundärmetaboliten
<ol><li>Um die sekundären pflanzlichen Metaboliten zu extrahieren, verwenden Sie ein Verhältnis von 1 g getrockneter Probe zu 10 ml HPLC-Methanol.<ol>
<li>Proben auf einer analytischen Waage wiegen und zu einem entsprechend großen Erlenmeyerkolben (125 – 250 ml) hinzufügen. Fügen Sie dann das entsprechende Volumen Methanol hinzu. Zeichnen Sie die Masse der extrahierten Probe auf.</li>
		<li>Bedecken Sie die Pflanzen-Methanol-Lösung mit Aluminiumfolie und drehen Sie dann 3 Tage lang bei Raumtemperatur (RT) auf einem Orbital-Shaker mit 100 Umdrehungen bei 100 Umdrehungen, sodass sich die potenziell östrogene Verbindungen in das Methanol auflösen können.</li>
		<li>Dekantieren Sie den Überstand mit Filterpapier (125 mm) in ein Tropffiltersystem.</li>
		<li>Trocknen Sie den Pflanzenextrakt mit einem Rotationsverdampfer, bis die Probe verdickt, aber gießbar ist, in einem 300 ml Rundbodenkolben. Gießen Sie die Probe in einen 50 ml Rundbodenkolben und spülen Sie den großen Kolben mit einer kleinen Menge Methanol. Trocknen Sie die Probe im kleinen Kolben weiter, bis das Methanol vollständig verdampft ist.</li>
		<li>Wiegen Sie den Probenrückstand mit einem analytischen Gleichgewicht. Rekordrückstandmasse.</li>
		<li>Den Pflanzenextrakt in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 0,1 g Extrakt auf 2 ml DMSO auflösen. Wirbel bis homogenisiert.</li>
		<li>Bewahren Sie die Pflanzenextrakt-DMSO-Lösung bei 4 °C in Bernsteinglasfläschchen bis zum Test auf.</li>
	</ol>
</li>
</ol>VORSICHT: Pflanzen können unbekannte biologisch aktive Chemikalien herstellen, und DMSO ist ein Fahrzeug, das sie über Zellmembranen transportieren kann. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und Pflege bei der Handhabung dieser Proben.
3. Humaner Östrogenrezeptor β Transfektionstest12
HINWEIS: Aseptische Technik und eine laminare Durchflusshaube sind für Tag 1 des Assay-Protokolls erforderlich.
<ol><li>Bereiten Sie Verdünnungen von 17-Estradiol für die Standardkurve vor.<ol>
<li>Das Cell Recovery Medium und Compound Screening Medium (CSM) aus dem Gefrierlager übertragen und in einem 37 °C-Wasserbad auftauen.</li>
		<li>Mikrozentrifugenrohre Zwischen- und 2 (INT1, INT2) und 1-8 beschriften.</li>
		<li>Füllen Sie INT1 mit 995 l CSM, INT2 mit 615 l CSM, Tube 1 mit 900 l CSM und Rohre 2-8 mit 600 l CSM. Rohr 8 beiseite stellen.</li>
		<li>Übertragen Sie 5 l von 100 m 17-Estradiol-Bestand in INT1. Entsorgen Sie die Spitze. Vortex.</li>
		<li>Vor jeder Übertragung pipette 3 mal ausspülen und dann 10 l von INT1 in INT2 übertragen. Entsorgen Sie die Spitze.</li>
		<li>Spülen Sie die Pipette 3 Mal, und übertragen Sie dann 100 l von INT2 in Rohr 1. Entsorgen Sie die Spitze. Übertragen Sie 300 l von Rohr 1 in Rohr 2. Wiederholen Sie dies für Rohre 3 bis 7. Entsorgen Sie 300 l aus Rohr 7 in Abfallbehälter. Tube 8 ist eine Null und erhält kein Estradiol. Die Endkonzentrationen der beschichteten Normen sind: 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 und 0 pM Estradiol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie Probenverbindungen vor.<ol>
<li>Vortex-Proben.</li>
		<li>Nehmen Sie 4 l jeder Pflanzenprobe in DMSO und fügen Sie 496 L CSM hinzu, um eine 0,8% DMSO-Lösung zu ergeben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schnell auftauen Reporterzellen.<ol>
<li>Rufen Sie das Rohr von Cell Recovery Medium aus dem 37 °C-Wasserbad auf. Desinfizieren Sie die Außenfläche mit 70% Ethanol.</li>
		<li>Holen Sie Reporterzellen aus -80 °C-Speicherung ab und tauen Sie auf, indem Sie 10 ml des vorgewärmten CRM in die Röhre gefrorener Zellen übertragen.</li>
		<li>Schließen Sie die Röhre der Reporterzellen und übertragen Sie sie für 5-10 min in ein 37°C Wasserbad.</li>
		<li>Holen Sie sich die Röhre der Reporter Cell Suspension aus dem Wasserbad. Invertieren Sie das Zellrohr mehrmals vorsichtig, um Aggregate von Zellen aufzubrechen und eine homogene Suspension zu erzeugen. Reinigen Sie die Oberfläche des Rohres mit 70% Ethanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Assay-Beschichtung<ol>
<li>Geben Sie 100 l der Reporter Cell Suspension mit einer Mehrkanalpipette in jeden Brunnen.</li>
		<li>Geben Sie 100 l Proben in Dreifacharbeit in geeignete Assaybrunnen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Platte in einen 37 °C, befeuchtet 5% CO2-Inkubator für 22-24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tauenerkennungssubstrat und Detektionspuffer in einem dunklen Kühlschrank über Nacht, um sich auf Tag 2 vorzubereiten.</li>
	<li>Kurz vor dem Ende der Platteninkubation, entfernen Sie Detektionssubstrat und Detektionspuffer aus dem Kühlschrank und legen Sie sie in einen schwachen Lichtbereich, bis sie mit RT ausgeglichen werden. Einmal bei RT, invertieren Sie jedes Rohr vorsichtig mehrmals, um Lösungen gründlich zu mischen.<ol>
<li>Unmittelbar vor Abschluss der Inkubation den gesamten Inhalt des Detektionspuffers in das Rohr des Erkennungssubstrats gießen, um Einfeinerungsreagenz zu erstellen. Mischen Sie sanft, um keinen Schaum zu produzieren.</li>
		<li>Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, invertieren Sie die Platte, um den Inhalt in einen geeigneten Abfallbehälter zu entsorgen. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte auf ein sauberes, saugfähiges Papiertuch, um die letzten Tröpfchen aus den Brunnen zu entfernen.</li>
		<li>Fügen Sie jedem Brunnen 100 L des Luciferase Detection Reagenz hinzu. Lassen Sie die Assayplatte bei RT für 15 min ruhen. Schütteln Sie die Platte nicht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Lumineszenz mit einem 96-Well-Plattenlese-Luminometer.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wasserman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+plant+consumption+predicts+red+colobus+monkey+(Procolobus+rufomitratus)+hormonal+state+and+behavior.">Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior.</a> Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).</li><li>Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+phytoestrogens+in+primate+ecology+and+evolution.">The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution.</a> International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).</li><li>DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Estrogenic+Chemicals+and+Phytoestrogens+with+Estrogen+Receptor+&#946;.">Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor &#946;.</a> Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).</li><li>Wasserman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , (2011).</li><li>Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+consequences+of+developmental+phytoestrogen+exposure.">Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure.</a> Reproduction. 143 (3), 247-260 (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der eR-Reporter-Assay, der entwickelt wurde, um pharmazeutische Wirkstoffe einzeln zu überprüfen, eignet sich auch für das Screening von pflanzlichen Lebensmitteln auf Phytoöstrogene, die biologisch durch die ER aktiv sind. Wichtige Überlegungen im Protokoll sind die behandlung der Pflanzenproben mit Sorgfalt: Frisches Pflanzenmaterial muss schnell getrocknet werden, um Schimmelbildung oder anderen biologischen Abbau zu verhindern, und es muss von Licht ferngehalten werden, um eine Photolyse der Verbindungen zu verh...

Pflanzen sind eine notwendige Nahrungsquelle für viele Tiere und liefern Kalorien und Nährstoffe, die für Überleben, Fortpflanzung, Wachstum, Entwicklung und Verhalten entscheidend sind1. Pflanzen produzieren Tausende von Chemikalien, viele als Anpassungen für ihr eigenes Wachstum, stomatische Wartung und Reproduktion. Andere Verbindungen, als pflanzliche Sekundärmetaboliten (PSMs), haben Funktionen, die weniger klar sind, obwohl einige toxisch sind und wahrscheinlich als Schutz gegen Kraut und Parasitismus (z. B. Alkaloide, Tannine)2,3verwendet werden. Einige dieser Chemikalien haben die Fähigkeit, langfristige physiologische Prozesse bei Tieren zu beeinflussen, wie endokrine Funktion, obwohl, warum diese endokrin-aktiven Phytochemikalien mit dem Wirbeltier endokrinsystem interagieren ist noch unklar2,4.
Phytoöstrogene, die am besten untersuchten endokrin-aktiven Phytochemikalien, sind polyphenolische PSMs, die Östrogene strukturell und funktionell imitieren und direkt mit der Hypothalomo-Hypophysen-Gonadenachse des endokrine Wirbeltiersystems interagieren5. Die Einnahme von Phytoöstrogenen in der menschlichen Ernährung ist mit dem Schutz gegen einige Krebsarten, Herzerkrankungen und Wechseljahrssymptome verbunden, obwohl andere Effekte Fruchtbarkeitsprobleme umfassen. Tatsächlich wurden die physiologischen Wirkungen dieser Verbindungen in den 1940er Jahren entdeckt, als Unfruchtbarkeit bei Schafen auf ihre Beweidung auf phytoöstrogenreichem Klee (Trifolium subterrareum)6zurückgeführt wurde. Bei der Verunstaltung können Phytoöstrogene in Zellen übergehen und die Wirkung von Östrogen imitieren. Während Phytoöstrogene negative Auswirkungen auf die Fruchtbarkeit von Schafen hatten, ist die Beziehung zwischen Phytoöstrogenen und Physiologie nicht einfach. Wie Schafe zeigen südliche weiße Nashörner empfindlichkeit gegenüber östrogenen Verbindungen in Futtermitteln, die aus hohen Mengen an Soja und Luzerne gewonnen werden. Töchter von Frauen, die diese Diät während der Schwangerschaft gefüttert werden, sind weniger wahrscheinlich,7zu reproduzieren. Jedoch, andere Studien haben gezeigt, dass Phytoöstrogene können auch positive Effekte haben, einschließlich reifung der Eierstockfollikel bei älteren Mäusen8, Prävention bestimmter Krebsarten, antioxidative Aktivität, und antiproliferative Effekte9.
Die Breite der Wirkung von Phytoöstrogenen sind nicht überraschend, da Östrogene eine breite Palette von biologischen Funktionen beeinflussen, einschließlich Wachstum, Entwicklung, und Regulierung der reproduktiven und zentralen Nervensysteme10. Obwohl es viele Wirkmechanismen gibt, Phytoöstrogene haben oft die Fähigkeit, Östrogen-Signalisierung durch ihre Fähigkeit, als Liganden für die intranuklearen Östrogen-Rezeptoren Alpha und Beta (ER) zu modifizieren, zu verbessern oder zu stören. Viele Phytoöstrogene haben eine phenolische Ringstruktur ähnlich wie Östrogene, die es ihnen ermöglicht, Östrogenrezeptoren zu binden. Diejenigen mit agonistischer östrogener Aktivität funktionieren wie Östrogen und bilden einen aktivierten ER-Ligand-Komplex, der an ein Östrogen-Antwortelement (ERE) dimerieren und binden kann und die Gentranskription11auslösen kann. So, Östrogene und Phytoöstrogene regulieren Zellaktivität und Systemfunktionen durch ihre Aktionen als Transkriptionsfaktoren.
Hier stellen wir die neuartige Verwendung eines zellbasierten Assays vor, um Pflanzenextrakte auf das Vorhandensein von Verbindungen zu überprüfen, die östrogene biologische Aktivität haben. Dieser Test verwendet chinesische Hamster-Ovarial-CHO-Zellen, die entwickelt wurden, um ER hoch auszudrücken, die mit der Galle (Photinus pyralis) Luziferase-Gen in Verbindung mit einem ERE-Promotor12transfiziert wurden. Wenn östrogene Verbindungen vorhanden sind, binden sie an den ER, dimerisieren und binden an die ERE, was zur Transkription des Luziferase-Gens führt. Nach Zugabe einer Substratlösung katalysiert die Luziferase eine Reaktion, die zur Photonenemission führt. Daher produzieren positive Proben leichte und negative Proben nicht.
Dieser kommerziell erhältliche Assay eliminiert die Notwendigkeit für Laboratorien, die Säugetierzellen mit dem Reportergen und dem Östrogenrezeptor13,14zu transfekieren, was instabil und variabel in der Wirksamkeit war. Der Assay bietet eine stabile Transfektionsplattform, die es ermöglicht, schnell und einfach zu bestimmen, ob eine Pflanze über Rezeptorbindung östrogene Aktivität hat.
Wir testen die Hypothese, dass Sojabohnen eine höhere östrogene Aktivität haben als alle anderen Lebensmittel angesichts ihrer bekannten Konzentrationen von östrogeneisofen15 mit menschlichen Lebensmitteln von lokalen Lebensmittelhändlern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:721px;" width="722">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1000 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">20 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">200 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">37 &#8451; water bath</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">37 &#8451;, humidified 5% CO2 incubator</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">analytical balance</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">cell culture-rated laminar flow hood</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">disposable media basin, sterile</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">drip filtration system</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Erlenmeyer flasks</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>125 mL and 250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HPLC grade methanol</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Human ER&#946; Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays</td>
			<td style="width:80px;">Indigo Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">IB00411</td>
			<td>Assay kit - analyzes 24 samples plus standard curve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">lyophilizer</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">multi-channel pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">orbital shaker</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">plate-reading luminometer</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>ex. Bioteck Synergy HTX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">rotory evaporator</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">round bottom flasks</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mL and 300 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">sterile tips</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>200 &#181;L and 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Whatman grade 1 paper</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">whirl-pak bags</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile polyethylene bags</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening for phytoestrogens using a cell-based estrogen receptor  &#946; reporter assay

Pflanzen sind eine Nahrungsquelle für viele Tiere, und sie können Tausende von Chemikalien produzieren. Einige dieser Verbindungen beeinflussen physiologische Prozesse in den Wirbeltieren, die sie verbrauchen, wie endokrine Funktion. Phytoöstrogene, die am besten untersuchten endokrin-aktiven Phytochemikalien, interagieren direkt mit der Hypothalamo-Hypophysen-Gonadenachse des endokrine Systems der Wirbeltiere. Hier stellen wir die neuartige Verwendung eines zellbasierten Assays vor, um Pflanzenextrakte auf das Vorhandensein von Verbindungen zu überprüfen, die östrogene biologische Aktivität haben. Dieser Assay verwendet Säugetierzellen, die entwickelt wurden, um Östrogenrezeptor-Beta (ER) hoch auszudrücken und die mit einem Luziferase-Gen transfiziert wurden. Die Exposition gegenüber Verbindungen mit östrogener Aktivität führt dazu, dass die Zellen Licht produzieren. Dieser Test ist eine zuverlässige und einfache Möglichkeit, auf biologische östrogene Aktivität zu testen. Es hat mehrere Verbesserungen gegenüber transienten Transfektionstests, vor allem, Benutzerfreundlichkeit, die Stabilität der Zellen und die Empfindlichkeit des Assays.

22 Extrakte von Obst und Gemüse, die häufig in der menschlichen Ernährung gefunden wurden, wurden auf das Vorhandensein von östrogene Verbindungen untersucht. Eine Vielzahl von Lebensmitteln wurden assayed, einschließlich Hülsenfrüchte, wie Sojabohnen, Schneeerbsen, und Schnapserbsen, wie die Erbsenfamilie ist eine bekannte Quelle von Phytoöstrogenen16, sowie Feigen, Datteln, Mais, Karotten, Äpfel, Bananen, Erdbeeren, Tomaten, Grünkohl und Kohl. Endokrine störende Verbindungen finden si...

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Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Wir haben einen kommerziell erhältlichen Östrogenrezeptor β Reporter-Assays für das Screening menschlicher und nichtmenschlicher Primatennahrung auf östrogene Aktivität optimiert. Wir validierten diesen Test, indem wir zeigten, dass die bekannten östrogene soja-Lebensmittel hoch registriert sind, während andere Lebensmittel keine Aktivität aufweisen.

Screening auf Phytoöstrogene mit einem Zell-basierten Östrogen-Rezeptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

screening-for-phytoestrogens-using-cell-based-estrogen-receptor

Research

JoVE Journal

Biochemistry

4.7K Aufrufe.  Indiana University. Wir haben einen kommerziell erhältlichen Östrogenrezeptor β Reporter-Assays für das Screening menschlicher und nichtmenschlicher Primatennahrung auf östrogene Aktivität optimiert. Wir validierten diesen Test, indem wir zeigten, dass die bekannten östrogene soja-Lebensmittel hoch registriert sind, während andere Lebensmittel keine Aktivität aufweisen.

Serie: Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  β Reporter Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme's biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Forschung

Biochemie

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning display increased atherosclerotic lesions in the aorta compared with female mice with intact ovarian function. However, laboratory models involving estrogen-deficient mice with atherosclerosis-prone status are lacking. This deficit is crucial because clinical estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of pre-existing or ongoing lipid disruption and atherosclerosis. In this study, we establish an in vivo estrogen-deficient mouse model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apolipoprotein E (apoE)-/- mice. We then compare the effects of 17&#946;-estradiol and pseudoprotodioscin (PPD) (a phytoestrogen) perorally administered via hazelnut spread. We find that although PPD exerts some effect on reducing final body weight and plasma TG in OVX apoE-/- mice, it has anti-atherosclerotic and cardiac-protective capacities comparable with its 17&#946;-estradiol counterpart. PPD is a phytoestrogen that has been reported to exert anti-tumor properties. Thus, the proposed method is applicable for screening phytoestrogens via peroral administration to substitute for traditional hormone replacement therapy in postmenopausal women, which has been reported to have potentially deleterious tumorigenetic capacity. Peroral administration via hazelnut spread is noninvasive, rendering it widely applicable to many patients. This article contains step-by-step demonstrations of bilateral ovariectomy via the double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice and peroral 17&#946;-estradiol or phytoestrogen hormone replacement via hazelnut spread. Plasma lipid and cardiovascular function analyses using echocardiography follow.

Clinically, estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of lipid disruption and atherosclerosis. We established an in vivo estrogen deficiency model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice. The mouse model is applicable for screening exogenous estrogen treatments of cardiovascular dysfunction after menopause.

Ein In Vivo Östrogen-Mangel-Maus-Modell zum Screening exogener Östrogen-Behandlungen von Kardiovaskulärer Dysfunktion nach den Wechseljahren

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

Kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität mit Nukleinsäuresonden

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis disorder and damage of intestinal mucosa and seems to be associated with an increased risk of colon neoplastic transformation. Accumulating evidence indicates that estrogens and estrogen receptors affect not only hormone-sensitive tissues, but also other tissues not directly related to estrogens, such as the lungs or colon. Here, we describe the protocol for the successful immunofluorescence staining of estrogen receptors in colon obtained from a murine model of TNBS-induced Crohn&#39;s disease. A detailed protocol for the induction of Crohn&#39;s disease in mice and intestine preparation is provided as well as a step-by-step immunohistochemical procedure using formalin-fixed paraffin-embedded intestine sections. The described methods are not only useful for estrogen receptor detection and estrogen signaling investigation in vivo but can also be applied to for other proteins which may be involved in the development of colitis.

The protocol presents a complete validated TNBS-induced murine model of Crohn&#39;s disease and methods for visualization of estrogen receptors by immunohistochemistry using immunofluorescence of formalin-fixed colon sections embedded in paraffin.

Visualisierung von Östrogenrezeptoren bei Mäusen mit TNBS-induzierter Morbus Crohn mit Immunfluoreszenz

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent one of the most promising targets for the pharmaceutical industry. Ergo, the design, implementation, and optimization of GPCR ligand screening assays is crucial, as they represent remote-control tools for drug discovery and for manipulating GPCR pharmacology and outcomes. In the past, G-protein dependent assays typified this area of research, detecting ligand-induced events and quantifying the generation of secondary messengers. However, since the advent of functional selectivity, as well as an increased awareness of several other G protein-independent pathways and the limitations associated with G-protein dependent assays, there is a greater push towards the creation of alternative GPCR ligand screening assays. Towards this endeavor, we describe the application of one such resource, the PRESTO-Tango platform, a luciferase reporter-based system that enables the parallel and simultaneous interrogation of the human GPCR-ome, a feat which was previously considered technically and economically unfeasible. Based on a G-protein independent &#946;-arrestin2 recruitment assay, the universality of &#946;-arrestin2-mediated trafficking and signaling at GPCRs makes PRESTO-TANGO an apt tool for studying approximately 300 non-olfactory human GPCRs, including approximately 100 orphan receptors. PRESTO-Tango&#39;s sensitivity and robustness make it suitable for primary high-throughput screens using compound libraries, employed to uncover new GPCR targets for known drugs or to discover new ligands for orphan receptors.

Given that GPCRs are attractive druggable targets, GPCR ligand screening is thus indispensable for the identification of lead compounds and for deorphanization studies. Towards these efforts, we describe PRESTO-Tango, an open-source resource platform used for simultaneous profiling of transient &#946;-arrestin2 recruitment at approximately 300 GPCRs using a TEV-based reporter assay.

Parallele Vernehmung der Rekrutierung von '-Arrestin2 für Ligand Screening auf einer GPCR-weiten Skala mit PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes to join exons and remove introns prior to cytoplasmic export of the mature mRNA. Splicing efficiency can be altered by the presence of mutations at splice sites, the influence of trans-acting splicing factors, or the activity of therapeutics. Here, we describe the protocol for a cellular assay that can be applied for monitoring the splicing efficiency of any given exon. The assay uses an adaptable plasmid encoded 3-exon/2-intron minigene reporter, which can be expressed in mammalian cells by transient transfection. Post-transfection, total cellular RNA is isolated, and the efficiency of exon splicing in the reporter mRNA is determined by either primer extension or semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). We describe how the impact of disease associated 5&#8242; splice-site mutations can be determined by introducing them in the reporter; and how the suppression of these mutations can be achieved by co-transfection with U1 small nuclear RNA (snRNA) construct carrying compensatory mutations in its 5&#8242; region that basepairs with the 5&#8242;-splice sites at exon-intron junctions in pre-mRNAs. Thus, the reporter can be used for the design of therapeutic U1 particles to improve recognition of mutant 5&#8242; splice-sites. Insertion of cis-acting&#160;regulatory sites, such as splicing enhancer or silencer sequences, into the reporter can also be used to examine the role of U1 snRNP in regulation mediated by a specific alternative splicing factor. Finally, reporter expressing cells can be incubated with small molecules to determine the effect of potential therapeutics on constitutive pre-mRNA splicing or on exons carrying mutant 5&#8242; splice sites. Overall, the reporter assay can be applied to monitor splicing efficiency in a variety of conditions to study fundamental splicing mechanisms and splicing-associated diseases.

This protocol describes a minigene reporter assay to monitor the impact of 5&#180;-splice site mutations on splicing and develops suppressor U1 snRNA for the rescue of mutation-induced splicing inhibition. The reporter and suppressor U1 snRNA constructs are expressed in HeLa cells, and splicing is analyzed by primer extension or RT-PCR.

Ein reporterbasierter zellulärer Assay zur Überwachung der Spleißeffizienz

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening (HTS) of random small molecule libraries against GPCRs is used by the pharmaceutical industry for target-specific drug discovery. In this study, an HTS was employed to identify novel small-molecule ligands of invertebrate-specific neuropeptide GPCRs as probes for physiological studies of vectors of deadly human and veterinary pathogens.
The invertebrate-specific kinin receptor was chosen as a target because it regulates many important physiological processes in invertebrates, including diuresis, feeding, and digestion. Furthermore, the pharmacology of many invertebrate GPCRs is poorly characterized or not characterized at all; therefore, the differential pharmacology of these groups of receptors with respect to the related GPCRs in other metazoans, especially humans, adds knowledge to the structure-activity relationships of GPCRs as a superfamily. An HTS assay was developed for cells in 384-well plates for the discovery of ligands of the kinin receptor from the cattle fever tick, or southern cattle tick, Rhipicephalus microplus. The tick kinin receptor was stably expressed in CHO-K1 cells.
The kinin receptor, when activated by endogenous kinin neuropeptides or other small molecule agonists, triggers Ca2+ release from calcium stores into the cytoplasm. This calcium fluorescence assay combined with a &#34;dual-addition&#34; approach can detect functional agonist and antagonist &#34;hit&#34; molecules in the same assay plate. Each assay was conducted using drug plates carrying an array of 320 random small molecules. A reliable Z&#39; factor of 0.7 was obtained, and three agonist and two antagonist hit molecules were identified when the HTS was at a 2 &#181;M final concentration. The calcium fluorescence assay reported here can be adapted to screen other GPCRs that activate the Ca2+ signaling cascade.

In this work, a high-throughput, intracellular calcium fluorescence assay for 384-well plates to screen small molecule libraries on recombinant G protein-coupled receptors (GPCRs) is described. The target, the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is expressed in CHO-K1 cells. This assay identifies agonists and antagonists using the same cells in one "dual-addition" assay.

Ein "Dual-Addition"-Calciumfluoreszenz-Assay für das Hochdurchsatz-Screening von rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

<meta charset="utf8"></head><body>Untersuchung der Kinetik und Funktion von Vitamin-A-Rezeptoren für die Retinoid-Homöostase

Methodology for Studying Interactions of Vitamin A Membrane Receptors and Opsin Protein with their Ligands in Generating the Retinylidene Protein

Distribution of dietary vitamin A/all-trans retinol (ROL) throughout the body is critical for maintaining retinoid function in peripheral tissues and generating the retinylidene protein for visual function. RBP4-ROL is the complex of ROL with retinol-binding protein 4 (RBP4), which is present in the blood. Two membrane receptors, Retinol Binding Protein 4 Receptor 2 (RBPR2) in the liver and STimulated by Retinoic Acid 6 Retinol (STRA6) in the eye, bind circulatory RBP4 and this mechanism is critical for internalizing ROL into cells. Establishing methods to investigate receptor-ligand kinetics is essential in understanding the physiological function of vitamin A receptors for retinoid homeostasis. Using Surface Plasmon Resonance (SPR) assays, we can analyze the binding affinities and kinetic parameters of vitamin A membrane receptors with its physiological ligand RBP4. 
These methodologies can reveal new structural and biochemical information of RBP4-binding motifs in RBPR2 and STRA6, which are critical for understanding pathological states of vitamin A deficiency. In the eye, internalized ROL is metabolized to 11-cis retinal, the visual chromophore that binds to opsin in photoreceptors to form the retinylidene protein, rhodopsin. The absorbance of light causes the cis-to-trans isomerization of 11-cis retinal, inducing conformational changes in rhodopsin and the subsequent activation of the phototransduction cascade. Decreased concentrations of serum and ocular ROL can impact retinylidene protein formation, which in turn can cause rhodopsin mislocalization, apoprotein opsin accumulation, night blindness, and photoreceptor outer segment degeneration, leading to Retinitis Pigmentosa or Leber Congenital Amaurosis. 
Therefore, spectrophotometric methodologies to quantify the G protein-coupled receptor opsin-11-cis retinal complex in the retina are critical for understanding mechanisms of retinal cell degeneration in the above-mentioned pathological states. With these comprehensive methodologies, investigators will be able to better assess dietary vitamin A supply in maintaining systemic and ocular retinoid homeostasis, which is critical for generating and maintaining retinylidene protein concentrations in photoreceptors, which is critical for sustaining visual function in humans.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Vitamin-A-Transportmechanismen – Verknüpfung von Leberrezeptoren mit der Sehgesundheit durch RBPR2- und RBP4-Wechselwirku

Here, we describe two quantitative methods for studying the protein-ligand interactions of vitamin A membrane receptors and photoreceptor opsin with their respective physiological ligands.

Methodik zur Untersuchung der Wechselwirkungen von Vitamin-A-Membranrezeptoren und Opsin-Protein mit ihren Liganden bei der Erzeugung des Retinyliden-Proteins

Distribution of dietary vitamin A/all-trans retinol (ROL) throughout the body is critical for maintaining retinoid function in peripheral tissues and ...