So kann diese Methode helfen, schlüsselwichtige Fragen über die Fähigkeit der östrogene Liganden zu regulieren Östrogen-Rezeptor Alpha und die Mechanismen der selektiven Östrogen-Rezeptor-Modulatoren zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es eine einfache Methode ist. Es zeigt Liganden-abhängige Östrogen-Rezeptor Alpha Ligand Bindung Domain Dimerisierung Aktivität in den Zellen.
Demonstriert wird das Verfahren tanner Jefferson, ein Postdoc-Student aus unserer Gruppe. Diese Methode verwendet drei verschiedene Plasmide, um die Östrogen-Rezeptor-Liganden-Bindungs-Domänendimerisierungsaktivität in Zellen zu erkennen. pG5-Luc ist das luziferase Reporter Plasmid zum Nachweis der Wirksamkeit der Dimerisierungsaktivität.
pBIND Maus-Östrogen-Rezeptor alpha EF ist ein Galactose-responsive Rortionfaktor GAL4 DNA-Bindung an eine Haupt-Flüssigmaus-Östrogen-Alpha-Ligand-Bindung Sende-Domain-Expression Plasmid, die an das GAL4-responsive Element auf dem pG5-Luc Reporter bindet. pACT Maus Östrogen-Rezeptor alpha EF ist ein Herpes simplex Virus transaktivierende Segment Protein VP16 Aktivierung Sactivated Domain verschmolzen Maus Östrogen-Rezeptor Alpha Ligand Bindung Domain Expression Plasmid, die nicht direkt an den pG5-Luc Reporter bindet. Wenn der richtige Ligand vorhanden ist, binden die Proteine, die vom pBIND-Maus-Östrogenrezeptor alpha EF und pACT Mouse Östrogenrezeptor alpha EF Plasmiden abgeleitet werden, durch die Bindungsdomäne des Östrogenrezeptors AlphaLigand.
Die Effizienz der Dimerisierung wird durch die Luziferase-Aktivität bestimmt. Der wichtigste Schritt ist die Steuerung der Aktivität des pBIND-Maus-Östrogen-Rezeptors alpha EF abgeleitetes Protein. Die Aktivität des pBIND-abgeleiteten Östrogenrezeptors Alphaligand binden Domäne in jedem Liganden ohne die pACT Östrogen-Rezeptor alpha EF Plasmid muss vor der Analyse der Liganden-abhängigen Östrogen-Rezeptor-Liganden Bindung Domain Dimerisierung Aktivität bewertet werden.
Beginnen Sie, indem Sie die entsprechenden Plasmidkombinationen in zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pro Kombination hinzufügen. Bereiten Sie die beiden Kombinationen der DNA-Mischung vor. Die erste Röhre enthält die pG5-Luc, pBIND-Östrogen-Rezeptor-alpha EF und leere pACT-Plasmide.
Zweite Röhre enthält die pG5-Luc, pBIND-Östrogen-Rezeptor-alpha EF, und pACT-Östrogen-Rezeptor-alpha EF-Plasmide. Um die DNA auszuscheiden, fügen Sie dem DNA-Gemisch in jeder Röhre eine 1/9 des DNA-Gemischvolumens von drei Mol-Natriumacetat und ein 20X-Drei-Molar-Natriumacetatvolumen von 100 % Ethanol in die DNA-Mischung in jedem Röhrchen hinzu und wirbeln die Rohre. Lagern Sie die Mischungen bei 20 Grad Celsius über Nacht, bevor Sie am nächsten Morgen mit Höchstgeschwindigkeit zentrieren.
Entsorgen Sie die Überräube und setzen Sie die unsichtbaren Pellets in 120 Mikroliter n. 45 % Ethanol pro Tube wieder auf, wobei darauf geachtet wird, dass jede DNA, die an den Innenteilen der Rohre klebt, abspült. Nach einer zweiten Zentrifugation unter den gleichen Bedingungen die Überstände entsorgen und die DNA 30 Minuten lang in einem Vakuumkonzentrator trocknen. Für die Transfektion die vorbereiteten humanen hepatozellulären Karzinomzellen zweimal mit 0,5 Millilitern Raumtemperatur PBS pro Brunnen pro Brunnen pro Waschbrunnen waschen und die Zellen mit 0,5 Millilitern frischem 37 Grad Celsius phenolrot-freiem MEM füttern, ergänzt mit 10% holzkohlegestreiftem, wärme-inaktiviertem fetalem Rinderserum und zwei Millimolar-L-Glutamin.
Als nächstes suspendieren Sie getrocknete Plasmid-DNA-Mischung und Transfektionsreagenz in dem entsprechenden Volumen von DMEM pro Anzahl von Brunnen in einzelnen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren. Fügen Sie jedem DMEM-suspendierten Plasmid-DNA-Gemischrohr ein gleiches Volumen transfektionsreagenzmediums hinzu. Nach einer fünf- bis zehnminütigen Inkubation bei Raumtemperatur 25 Mikroliter DNA-Mischung in die entsprechenden Versuchsbrunnen der 24-Well-Human-Hepatozellulären Karzinom-Zellkulturplatte für eine sechsstündige Transfektion im Zellkultur-Inkubator geben.
Und das Ende der Inkubation, ersetzen Sie das Transfektionsmedium durch 0,5 Milliliter frisches 37 Grad Celsius phenolrot-freies MEM, ergänzt durch 10% kohlegestreifte wärmeinaktivierte FBS, zwei Millimolar-L-Glutamin, 1%Penicillin-Streptomycin und Liganden pro Brunnen und geben die Zellen für weitere 16 bis 18 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück. Am nächsten Morgen die Zellen mit einem Milliliter PBS pro Brunnen waschen und die Zellen aus jedem Brunnen mit 100 Mikrolitern passiver Lysepuffer pro Brunnen und kräftigem Schütteln mit einem Wirbelmischer befestigen. Dann gefrieren Sie die Zelle lysiert in flüssigem Stickstoff.
Am Tag des dualen Luziferase-Assays die Lysate auf einem Shaker schütteln, bis die Platte Raumtemperatur erreicht, und 10 Mikroliter Lysat in einzelne Brunnen einer 96-gut weißen Kunststoffplatte übertragen. Lesen Sie dann die Luziferase-Aktivität jeder Zelllysatprobe auf einem Mikroplattenleser. Die Behandlung von pBIND-Maus-Östrogenrezeptor alpha EF und pACT-Plasmiden transfizierten Zellen mit 10 Nanomolar Estradiol stimuliert die Luziferase-Aktivität, da die Östrogenrezeptor-Alphaligandenbindungsdomäne die Liganden-abhängige Transaktivierungsfunktionsdomäne AF-2 enthält.
Ein- und 10-Nanomolar-Konzentrationen jedoch induzieren Luziferase-Aktivität in den Zellen transfiziert mit der Kombination von pBIND und pACT Maus Östrogen-Rezeptor Alpha EF Plasmide, was die Machbarkeit dieses Verfahrens zur Bewertung der Östrogenrezeptor Alpha Ligand Bindung Domain Dimerisierung Aktivität bei bis zu einem Nanomolar der Estradiol-Behandlung. Die Behandlung mit 4-Hydroxy-Tamoxifen löst keine Luziferase-Aktivität in den pBIND-Maus-Östrogenrezeptor-Alpha-EF- und pACT-Plasmid-Transfidenzellen aus, was darauf hindeutet, dass die AF-2-Funktion des Östrogenrezeptors alpha durch diesen Liganden nicht aktiviert wird. Bis zu 10 nanomolare Konzentrationen jedoch induziert Luziferase-Aktivität in den Zellen transfiziert mit der Kombination von pBIND und pACT Maus Östrogen-Rezeptor Alpha EF Plasmide, was darauf hindeutet, dass dieses Verfahren für die Bewertung der Östrogenrezeptor Alpha Liganden Bindung Domain Dimerisierung Aktivität bei bis zu 10 Nanomolar der 4-Hydroxy-Tamoxifen-Behandlung machbar ist.
Die Aktivität aus der Kombination von pBIND und pACT Maus Östrogen-Rezeptor Alpha Ligand bindenden Domänenexpression Plasmide mit 4-Hydroxy-Tamoxifen ist signifikant höher als die Kombination von pBIND und pACT humanen Östrogen-Rezeptor Alpha Ligand bindenden Domänenexpression Plasmiden. Dies deutet darauf hin, dass die 4-Hydroxy-Tamoxifen-abhängige Homodimerisierungsaktivität der Maus Östrogen-Rezeptor-Alpha-Ligand-Bindungsdomäne stärker ist als die menschliche Östrogenrezeptor-Alphaliganbindungsdomäne. Darüber hinaus ist die 4-Hydroxy-Tamoxifen-abhängige Homodimerisierungsaktivität des Maus-Östrogen-Rezeptor-Alpha-Ligand-Bindungsbereichs, der eine menschliche F-Domäne enthält, deutlich niedriger als die der Wild-Typ-Maus-Östrogen-Rezeptor-Alpha-Ligand-Bindungsdomäne.
Im Gegensatz dazu ist die 4-Hydroxy-Tamoxifen-abhängige Homodimerisierungsaktivität des menschlichen Östrogenrezeptors Alphaligand-Bindungsdomäne, die eine Maus-F-Domäne enthält, signifikant höher als die des wilden Typs humaner Östrogenrezeptor Alphaligand-Bindungsdomäne. Dies deutet darauf hin, dass die F-Domäne einen Einfluss auf die artspezifische 4-Hydroxy-Tamoxifen-abhängige Östrogenrezeptor-Alphaliganden-Bindungsdomäne Homodimerisierungsaktivität hat. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, daran zu denken, die basale Aktivität der GAL4 DNA-Bindung Seittrogen-Rezeptor Alpha Liganden binden Domain-Aktivität mit Ihrem Liganden zu testen.
Diese Tätigkeit sollte mit der Fahrzeugbehandlung gleichsein.
