Unser Protokoll ermöglicht es uns, mikrobielle Chemotaxis direkt in ihrem Lebensraum robust zu quantifizieren. Und so können wir Mikroorganismen isolieren und das metabolische Potenzial besser quantifizieren und verstehen. Der In-situ-Chemotaxis-Assay, kurz ISCA, ist ein flexibles, benutzerfreundliches und einfaches Gerät, das neue Einblicke in mikrobielle Verhaltensweisen und damit die Rolle und Funktion von Mikroorganismen in jeder Umgebung mit einer flüssigen Phase ermöglicht.
Das Verfahren für den Einsatz sowohl im Labor als auch vor Ort demonstriert Estelle Clerc, die derzeit Doktorandin in meiner Forschungsgruppe ist. Vor der Zubereitung des Chemolockanten das Medium mit einem 0,2 Mikrometer Filter filtern und die gefilterte Lösung autoklavieren. Als nächstes bereiten Sie eine 10 Millimolar Lösung von Chemoattractant in 1 Milliliter des sterilen Mediums vor, und filtern Sie die Chemoattraktionslösung mit einem 0,2 Mikrometer Spritzenfilter, um Partikel und mögliche Verunreinigungen zu entfernen.
Anschließend die gefilterte Chemolock-Stammlösung in Reihe verdünnen, nach dem experimentellen Protokoll. Um eine ISCA zu füllen, befestigen Sie eine 27-Spur-Nadel an einer 1 Milliliter-Spritze und laden Sie eine Spritze für jede Konzentration des gefilterten Chemoattractants. Halten Sie das Gerät mit dem Nachoben zeigenden Port, injizieren Sie langsam jede Konzentration der Substanz in jede der fünf Brunnen einer Reihe des Geräts, bis ein kleines Tröpfchen über jedem Port erscheint.
Wenn alle Brunnen gefüllt sind, übertragen Sie 1,5 Milliliter der Meeres- oder Süßwasserbakterienkultur von Interesse in 150 Milliliter des entsprechenden Bakterienkulturmediums. Als nächstes legen Sie zwei kleine Stücke doppelseitigen Klebebandes auf die flache Oberfläche eines 200 Milliliter-Trays. Und sichern Sie eine ISCA auf jedem Stück Klebeband.
Mit einer 50 Milliliter serologischen Pipette füllen Sie langsam die Einsatzschale mit der bakteriellen Lösung. Und lassen Sie die Bakterien auf den Chemoattractant von Interesse für eine Stunde reagieren. Um die Analyse zu beenden, verwenden Sie eine neue 50-Milliliter-Pipette, um das Medium vorsichtig aus dem ISCA-Fach zu entfernen.
Um die Samples abzurufen, positionieren Sie zuerst die ISCA, sodass der Port nach unten zeigt. Als nächstes verwenden Sie eine sterile 1 Milliliter Spritze mit einer 27-Spur-Nadel, um die Lösung aus jedem Brunnen zu ziehen. Ziehen der Proben aus jeder Reihe der gleichen Konzentration in ein einzelnes Rohr.
Analysieren Sie dann die Proben durch Durchflusszytometrie, um die Anzahl der Bakterien zu bestimmen, die von jeder Chemoattraktionskonzentration angezogen werden. Um eine ISCA für den Einsatz vor Ort vorzubereiten, sammeln Sie zunächst 5 Milliliter Wasser pro ISCA von der Feldseite und filtern Sie das Wasser durch einen 0,2-Mikrometer-Spritzenfilter in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Die Spritze gefiltertes Wasser zweimal durch eine hydrophile GP-Filterpatrone passieren und das Filtrat nach jeder Spülung in einem neuen 50-Milliliter-Konikulentenrohr einsammeln.
Filtern Sie das Wasser dann durch einen 0,02 Mikrometer Spritzenfilter in ein neues 50-Milliliter-Rohr. Verwenden Sie Aliquots des Filtrats, um alle Chemoattraktivitätsvon Interesse auf die gewünschten Konzentrationen in einzelnen 15 Milliliter konischen Röhren wieder auszusetzen. Dann verwenden Sie 10 Milliliter Spritzen, um die resuspendierten Chemoattractants durch einzelne 0,2 Mikrometer Spritzenfilter in sterile 15 Milliliter konische Zentrifugenrohre zu filtern, um unerwünschte Partikel oder wasserunlösliche Verbindungen zu entfernen.
Schrauben Sie für den ISCA-Feldeinsatz jede ISCA auf Stück 9 des Gerätegehäuses und schließen Sie das Gehäuse. Versiegeln Sie das Gehäuse mit Klebeband und verwenden Sie Bungee-Kabel, um das Gehäuse an einem Einsatzarm und einer vom Menschen hergestellten Struktur zu befestigen. Alternativ kann das Gehäuse mit einem geringen Gewicht auf einem flachen Substrat gesichert oder an einem Netz im pelagischen Ozean befestigt werden.
Tauchen Sie das Gehäuse vollständig ein, um die Füllung zu starten, und halten Sie das Gehäuse fest, um übermäßige Wasserbewegungen im Inneren zu verhindern. Sobald der Wasserstand die Oberseite des Gehäuses erreicht hat, stellen Sie sicher, dass keine Luft im Inneren eingeschlossen ist. Wenn das Gehäuse vollständig voll ist, versiegeln Sie die unteren und oberen Löcher mit zwei Steckern.
Dann lassen Sie die ISCA für 1 bis 3 Stunden an Ort und Stelle. Entfernen Sie am Ende der Probenahmezeit das Gehäuse aus dem Wasser. Legen Sie das Gehäuse über einen Behälter, um das Wasser abzuleiten, und entfernen Sie vorsichtig den oberen Teil des Klebebandes von den vorderen Löchern.
Sobald die Wasserleitung unter der Oberseite des ISCA passiert ist, entfernen Sie den unteren Stecker und entleeren Sie den Rest des Wassers. Während die ISCAs noch am Gehäuse befestigt sind, verwenden Sie eine 1 Milliliter Pipette oder eine 1 Milliliter Spritze, um das auf jeder ISCA eingeschlossene Wasser sorgfältig zu entfernen und die ISCAs zu entfernen, ohne die obere Oberfläche zu berühren. Verwenden Sie dann ein Einweg-Wischtuch, um die verbleibende Flüssigkeit auf der Oberfläche zu entfernen, und holen Sie die Proben ab, wie für die Laborprobenabrufung demonstriert.
In dieser repräsentativen In-vitro-Analyse wurde 1 Millimolar als die optimale Glutamin-Einsatzkonzentration bestimmt, da es eine signifikante chemotaktische Reaktion induzierte, die 18-fach höher war als die gefilterte Meerwasserkontrolle. Höhere und niedrigere Konzentrationen von Glutamin induzierten auch signifikante, aber schwächere, chemotaktische Reaktion. In dieser Feldeinsatzanalyse wurden fünf ISCA-Replikationen, gefüllt mit 1 Millimolar-Glutamin, für eine Stunde an einem Küstenort in der Nähe von Sydney, Australien, eingesetzt.
Und die mit Glutamin gefüllte ISCA zog fast dreimal mehr Bakterien an als die mit gefiltertem Meerwasser gefüllten Kontrollbrunnen. Das Wichtigste, was Sie bei der Bereitstellung der ISCA sowohl im Labor als auch vor Ort beachten sollten, ist, starke Flüssigkeitsströme zu vermeiden, die Chemotaxis verhindern. ISCA-abgeleitete Proben können verwendet werden, um bestimmte Organismen oder Gene zu identifizieren, das genomische Potenzial von chemotaktischen Organismen zu charakterisieren und bestimmte Stämme auf selektiven Medien gezielt zu isisolationen.
