The authors would like to acknowledge Marcos Di Falco for his expertise and advice with the preparation of the samples for nano-LC MS/MS as well as Dr. Zoran Minic from the University of Regina for the LC MS/MS analysis. This work was supported by NSERC (DG402214-2011) and CRC (950-221184) funding. D.C. was supported by Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems and FQRNT.

1. Bereiten Reagenzien <ol><li> Vorbereitung SDS-Extraktionslösung: 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% Glycerin, 10 mM EDTA und 1% SDS. Filter-Sterilisation mit einem 0,22 um Filter und bei 4 ° C. </li><li> Bereiten stock Reagenzien für die Polyacrylamid-Gel nötig. <ol><li> Bereiten 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filter-Sterilisation mit einem 0,22 um Filter und bei Raumtemperatur lagern. </li><li> 0,5 M Tris-HCL pH 6,8. Filter-Sterilisation mit einem 0,22 um Filter und bei Raumtemperatur lagern. </li><li> Bereiten Sie 10% SDS. Filter zu sterilisieren mit einem 0,22 um Filter und bei Raumtemperatur lagern. </li></ol></li><li> Bereiten Sie Lösungen für in-Gel-Trypsin zu verdauen und Peptidextraktion benötigt wird. <ol><li> Bereiten 100 mM Ammoniumbicarbonat. Filter-Sterilisation mit einem 0,22 um Filter und bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie 1 M DTT Aktien. In 100 mM Ammoniumbicarbonat und Öffnungs suspendiert bei -80 ° C. </li><li> Bereiten 550 mM Iodacetamid Aktien. In Hänge100 mM Ammoniumbicarbonat und bei -80 ° C. </li><li> Bereiten 100 ng / &amp; mgr; l Trypsin Aktien. Aliquot 60 ul in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C. </li><li> Bereiten Extraktionslösung: 1% Ameisensäure, 2% Acetonitril. </li><li> Vorbereitung Resuspensionslösung: 5% Acetonitril und 0,1% Ameisensäure. </li></ol></li></ol> 2. Führen Sie Cell Lysis in Patronenfilteranlage mit Zellen in RNA Stabilization Lösung konserviert <ol><li> Vertreiben die RNA Stabilisierungslösung aus dem Patronenfiltereinheit (1,5 ml) gelöst und in einem 2 ml Mikroröhre mit einer 60 ml Spritze am Luer-Ende des Filters angebracht ist. </li><li> Zentrifugieren Sie die 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen für 10 min bei 17.000 xg, jede Zelltrümmer zu pelletieren. Dies geschieht so, dass der Filter im Schritt 2.3 nicht verstopfen. </li><li> Überstand in einem 10 K Ultrazentrifugenfiltereinheit, um alle Proteine ​​aus Zellen stammen, die von der Gefrier / tha lysiert wurden erfassenw der Probe. Werfen Sie die Tablette. Es wird in Schritt 2.5 verwendet werden. Zuführen Zentrifugation der Ultrazentrifugenfiltereinheit bei 3.270 × g für 30 min oder bis das Volumen auf etwa 600 &amp; mgr; l verringert. </li><li> Schmelzen Sie die Spitze eines p10 Spitze und blockieren die Nicht Luer-Lock-Seite des Patronenfilteranlage mit dem offenen Ende der Spitze. Dadurch wird sichergestellt, dass kein Extraktionspuffer und Biomasse während der Schritte 2,5-2,7 entweicht. </li><li> Hängen Sie das Pellet in 1 ml SDS-Extraktionslösung pipettieren und es in die ursprüngliche Patronenfilteranlage. Der einfachste Weg, um in die Patronenfilteranlage Pipette, um eine p200 Spitze auf eine p1000 Spitze stapeln und diese Doppelspitze zum Pipettieren. </li><li> 1 ml SDS-Extraktionslösung auf den Patronenfiltergerät so das Gesamtvolumen beträgt etwa 2 ml und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur, während in einem Hybridisierungsofen dreht. Platzieren 3 zerknitterten lab wischt den Boden eines 50 ml konischen Röhrchen. Parafilm beide Enden des Patronenfilteranlage geschlossenund setzen Sie den Patronenfilteranlage in das 50-ml-Tube. Schließen Sie den Deckel und setzen Sie den Schlauch in die Hybridisierungsofen. </li><li> Nach 10 Minuten statt der Sterivex Filter auf einem Schaumstoff-Schwimmer und befestigen Sie sie mit einer 5-ml-Spritze am Luer-Lock-Ende. Float und Inkubation in einem 95 ° C Wasserbad für 15 min. </li><li> Lassen Sie die Patronenfilteranlage kühl und drehen bei Raumtemperatur für 1 Stunde (wie in Schritt 2.6). </li><li> Vertreiben die SDS-Extraktionslösung / Zelllysat aus dem Filter mit einem 60-ml-Spritze in der gleichen Ultrazentrifugen-Filtereinheit wie zuvor beschrieben (Schritt 2.3). 1 ml frisches SDS-Extraktionslösung zur Patronenfilteranlage und Mischen für 30 Sekunden mit der Hand, dann in der Ultrazentrifugen-Filtereinheit auszustoßen unter Verwendung der 60-ml-Spritze. Dies wird auf die Patronenfiltereinheit spülen, um sicherzustellen, dass alle Proteine ​​entfernt wurden. </li><li> Zuführen Zentrifugation auf dem Ultrazentrifugenfiltereinheit für 45 min bei 3.270 × g oder, bis das Volumen in der Filtereinheit von weniger als 600 &amp; mgr;. </li><li> Durchfluss verwerfen und füllen Sie die Ultrazentrifugenfiltereinheit mit frischen SDS-Extraktionslösung. </li><li> Zentrifugieren Sie die Filtereinheit für einen weiteren 45 min bei 3270 x g. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.11 und 2.12 noch zweimal. Sicherzustellen, das Endvolumen in der Ultrazentrifugen-Filtereinheit beträgt höchstens 600 &amp; mgr; l am Ende der letzten Schleudern. </li><li> An diesem Punkt gespalten das Konzentrat in zwei. Eine Fraktion wird für die DNA-Niederschlag und der andere für die Proteinfällung werden. Anmerkung: Die Fraktionierung Menge hängt von der Menge an Biomasse, die gefiltert wurde, und dem beabsichtigten Verwendungszweck der Produkte. In unserem Fall teilen wir das Konzentrat mit 10% gegenüber DNA-Niederschlag und 90% gegenüber Proteinfällung. </li></ol> 3. Proteinniederschlag <ol><li> In 4 Volumina Methanol: Aceton (50:50) mit einem Volumen von Konzentrat und Vortex für 10 Sekunden. Inkubieren über Nacht bei -20 ° C. </li><li> Spin down bei 17.000 × g für 30 min. Den Überstand umfüllenund lassen Sie das Pellet trocken in einem Speedvac 1 Stunde (oder bis trocken) (kann nicht sichtbar sein). Hinweis: Nicht über das Pellet trocknen, da dies es schwierig, wieder zu suspendieren machen kann. </li><li> Aussetzen des Pellets in 25 ul SDS-Extraktionslösung. Lassen Sie sitzen für eine Stunde dann durch Auf- und Abpipettieren resuspendiert. </li><li> Quantifizierung Protein unter Verwendung eines Protein-Assay-Kit und den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 4. DNA-Niederschlag <ol><li> In SDS-Extraktionslösung auf den Konzentratfraktion, für DNA-Niederschlag, bis die 500 ul Zeichen verwendet werden. Dieser Schritt besteht einfach darin, das Volumen der Lösung zu erhöhen, so dass es leichter zu handhaben. </li><li> In 0.583 Bände eines Proteins Fällungsreagenz (wie dem MPC-Protein Fällungsreagenz) und Vortex für 10 Sekunden. Sie sollten einen weißen Niederschlag Form zu sehen. Anmerkung: Wir haben auch Phenol: Chloroform-DNA-Extraktionsverfahren, aber es ist schwieriger aufgrund der geringen Volumina. Wir erhalten eine bessere DNA-Ausbeuten unter Verwendung derMPC Protein Precipitation Reagent. </li><li> Zentrifuge bei 17.000 × g und 4 ° C für 10 min. </li><li> Überstand in einem anderen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und fügen 0,95 Volumina Isopropanol. Kehren 30-40 mal. </li><li> Zentrifuge für 10 min bei 4 ° C bei maximaler Geschwindigkeit. </li><li> Dekantieren Sie vorsichtig und den Überstand verwerfen. </li><li> Spülung zweimal mit 750 ul 70% Ethanol. </li><li> Entfernen Sie so viel Ethanol wie möglich durch Pipettieren, dann lassen Sie an der Luft trocknen. Hinweis: Nicht über die DNA zu trocknen, da dies es schwierig, wieder zu suspendieren machen kann. </li><li> Resuspendiere in 25 ul TE niedriger Puffer, pH 8 (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA). </li><li> Quantifizierung der DNA unter Verwendung eines dsDNA Assay-Kit und den Anweisungen des Herstellers. Führen Agarose-Gel (1%) Elektrophorese auf 3 ul der DNA, um seine Qualität zu überprüfen. </li></ol> 5. SDS-PAGE-Gel von Proteinen <ol><li> Vorbereitung Probenpuffer (950 &amp; mgr; l Laemmli-Probenpuffer und 50 &amp; mgr; l β-Mercaptoethanol). &lt;/ li&gt; <li> Hinzufügen des entsprechenden Volumens von 15 ug Protein oder ein Maximum von 20 ul bis gleiches Volumen Probenpuffer hinzu und kocht 4 min. Proben können nun bei -80 ° C gelagert, bis SDS-PAGE durchgeführt werden kann. </li><li> Herstellung von 10% Acrylamid-Trenngel mit einer 5% Acrylamid-Sammelgel. </li><li> Legen Sie das Gel mit Proben und 4 &amp; mgr; l eines Proteins Leiter. Führen Sie das Gel bei konstanten 120 V bis 250 kDa Leiter Marker hat gerade erreichte das Trenngel. </li><li> Fleck des Gels mit Coomassie-Beize nach den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 6. In-Gel-Trypsin Digest und Peptid-Extraktion Hinweis: Alle Schritte von hier bis 6.10 werden in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt, um eine Kontamination zu minimieren. <ol><li> Schneiden Sie überschüssiges Gel unter der 10 kDa Leiter Zeichen für jede Spur. Jede Spur wird auf dem MS / MS getrennt analysiert werden. Schneiden Sie jede Spur in 1 mm x 1 mm Quadrate, um die Oberfläche zu vergrößern und legen Sie alle squares von der Fahrspur in einen Niederbindemikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie dies für alle Spuren. (1% ige Essigsäure verwendet werden, um das Gel nicht austrocknen und schwer zu schneiden zu vermeiden). Hinweis: Die Minimierung Verunreinigungen ist entscheidend in dieser Phase, so gel Slicing in einer biologischen Sicherheitswerkbank auf dem Glas SDS-PAGE-Gel-Form verwendet wird, um das Gel zu machen durchgeführt. </li><li> De-Flecken- <ol><li> Dispense 50 ul 100 mM Ammoniumbicarbonat in jedem Low-Bindungsröhre, in der Nähe Kappe und bei 37 ° C für 10 min. </li><li> Dispense 50 ul Acetonitril, in der Nähe Kappe und bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Absaugen und entsorgen Sie 150 ul. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6.2.1 und 6.2.2. </li><li> Absaugen und entsorgen 95 &amp; mgr; l. </li></ol></li><li> Entwässerung <ol><li> Dispense 50 ul Acetonitril, nahe Kappe und warten Sie 5 Minuten. Absaugen und entsorgen 45 &amp; mgr; l und warten Sie 10 min. </li></ol></li><li> Reduktion <ol><li> Geben Sie 50 &amp; mgr; l DTT (10 mM, 100 mM verdünnt ammOnium-Bicarbonat), in der Nähe Kappe und warten 30 Minuten bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Alkylierung <ol><li> Dispense 50 ul Iodacetamid (55 mM, 100 mM Ammoniumbicarbonat verwässert), in der Nähe Kappe und warten Sie 20 min bei 37 ° C. </li><li> Dispense 100 ul Acetonitril, nahe Kappe und Inkubation für 5 min bei 37 ° C. Absaugen und entsorgen Sie 195 ul. </li></ol></li><li> Wash <ol><li> Dispense 50 ul Ammoniumbicarbonat, nahe Kappe und Inkubation für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Dispense 50 ul Acetonitril, in der Nähe Kappe und bei 37 ° C für 5 min. Absaugen und entsorgen Sie 120 ul. </li></ol></li><li> Entwässerung <ol><li> Dispense 50 ul Acetonitril, nahe Kappe und warten Sie 5 Minuten. Absaugen und entsorgen 45 &amp; mgr; l. </li><li> Dispense 50 ul Acetonitril, warten Sie 5 Minuten. </li><li> Absaugen und entsorgen 75 ul und warten Sie 5 Minuten. </li></ol></li><li> Verdauung <ol><li> Verzichten 25-30 ul von 6 ng / ul Trypsin (until alle Gelfragmente abgedeckt sind). Schließen Kappe und warten Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren über Nacht (4,5 hr Minimum) bei 37 ° C. </li><li> Lassen Sie sitzen bei Raumtemperatur für 30 min. </li></ol></li><li> Extraktion und Peptidtransfer <ol><li> Dispense 30 ul Extraktionslösung und Deckel mit Deckel für 30 Minuten auf Eis. </li><li> Saugen Sie 30 ul und verzichten saugte Volumen in einem neuen markierten Tiefbindungsrohr. </li><li> Verzichtet werden 12 &amp; mgr; l Extraktionslösung und 12 ul Acetonitril in das ursprüngliche Rohr (mit Gel). Schließen Kappe und Inkubation für 30 min auf Eis. </li><li> Saugen Sie 15 ul und Einlagen in die neue Röhre. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte (6.9.3 und 6.9.4). </li></ol></li><li> Legen Sie neue Rohre in einem SpeedVac bis trocken. </li><li> Resuspendiere in 50 ul Resuspensionslösung. Vortex auf Medium für 10 Minuten, um wieder zu suspendieren. </li><li> Pipette Peptidlösung entweder nano / LC Fläschchen oder 96-Well-Platten geeignet für Nano / LCMS / MS-Arbeit. </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEGAN+analysis+of+metagenomic+data.">MEGAN analysis of metagenomic data.</a> Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).</li><li>Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -. J., Weber, N., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+environmental+sequences+using+MEGAN4.">Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4.</a> Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).</li><li>Ea Ottesen, ., Marin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metatranscriptomic+analysis+of+autonomously+collected+and+preserved+marine+bacterioplankton.">Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton.</a> The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).</li><li>Feike, J., J&#252;rgens, K., Hollibaugh, J. T., Kr&#252;ger, S., Jost, G., Labrenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+unbiased+metatranscriptomics+in+suboxic+waters+of+the+central+Baltic+Sea+using+a+new+in+situ+fixation+system.">Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system.</a> The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Probenkonservierung ist der Schlüssel zur metaproteomic Studien und früheren Arbeiten gezeigt, dass ein RNA-Stabilisierungslösung ist eine nützliche Speicherpuffer zum Speichern von Zellen vor der Proteinextraktion 28. Idealerweise würden Proben in situ erhalten werden, um Verschiebungen in der Protein-Expression während der Handhabung 33,34 negieren. In der Tat, in situ Probenahme und Fixierungstechniken sind entwickelt worden, die für die autonome Sammlung und Aufbewahrun...

Mikroorganismen sind allgegenwärtig und spielen eine essentielle Rolle in der Erde biogeochemischen Kreisläufen 1. Derzeit gibt es zahlreiche Ansätze zur Charakterisierung von molekularen mikrobiellen Gemeinschaft Struktur und Funktion zur Verfügung. Am häufigsten ist die Analyse der 16S-rRNA-Gensequenzen aus Umwelt-DNA 2 PCR-amplifizierte - 4. Ein Nachteil des 16S-rRNA-Gen-Analyse ist, dass es nur gibt Auskunft über phylogenetische Identität und Gemeinschaftsstruktur, mit wenig Informationen über die Stoffwechselfunktion. Im Gegensatz dazu Ansätze wie Metagenomik, metatranscriptomics und Metaproteomik Informationen über Community-Struktur und den Stoffwechsel. Metagenomik, oder die Analyse der Gen-Gehalt von einer Ansammlung von Organismen, bietet Informationen über die Struktur und funktionelle Potential der Community 5-8. Obwohl stark, kann dies Funktionspotenzial nicht auf die Stoffwechsel entsprechenAktivitäten der Organismen. Eines Organismus Genotyp von den Genen, von denen jeder zu RNA transkribiert werden und weiter zu Protein translatiert wird, was zu einem Phänotyp repräsentiert. Somit, um das Verständnis der mikrobiellen funktionelle Aktivität in einer Umgebung zu unterstützen, sollte postgenomische Analyse durchgeführt 9 werden. Metatranscriptomics oder die Analyse von RNA-Transkripten ist nützlich, weil es zeigt, welche Gene in einer bestimmten Umgebung transkribiert werden. Jedoch mRNA-Niveaus nicht immer ihre entsprechenden Proteinniveaus entsprechen aufgrund Translationsregulation, RNA-Halbwertszeit und der Tatsache, dass Mehrfachkopien-Protein kann für jede mRNA 10 erzeugt werden. Aus diesen Gründen Metaproteomik wird jetzt als ein wichtiges Instrument zur Umweltmikrobiologie anerkannt. Gemeinsame metaproteomic Analysen verwenden eine Schrotflinte Proteomics Ansatz, wo die in der Nähe vollen Ergänzung der Proteine, die in einer komplexen Probe werden in der Regel durch en gereinigt und gleichzeitig analysiert,enzymatische Verdauung in Peptide und Analysen zu einem Massenspektrometer. Nachfolgende Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) &quot;Peptid-Fingerprinting&quot; wird verwendet, um die Peptidsequenz und potentiellen Proteinherkunfts durch Proteindatenbanksuche (für eine Übersicht siehe 11) zu bestimmen. Proteom-Arbeit hat einen langen Weg in den letzten 25 Jahren dank der Zunahme der genomischen Datenverfügbarkeit und der Erhöhung der Empfindlichkeit und Genauigkeit von Massenspektrometern so dass für Hochdurchsatz-Protein Identifizierung und Quantifizierung 11,12 kommen. Da Proteine ​​sind das Endprodukt der Genexpression kann metaproteomic Daten helfen, festzustellen, welche Organismen in einem bestimmten Umfeld und welche Proteine ​​sie ausdrücken aktiv sind. Dies ist vorteilhaft, wenn versucht wird, zu bestimmen, wie ein bestimmter Satz von Umgebungsvariablen den Phänotyp des Organismus oder Gemeinde betreffen. Schon früh, MS / MS-basierte metaproteomic Studien im Ozean wurden verwendet, um spezifische Proteine ​​gezielt zu identifizierenmikrobielle Abstammungslinien, wobei die erste Studie über die Licht angetrieben Protonenpumpen Proteorhodopsin in SAR11 Meeresbakterien 13. In jüngerer Zeit wurden vergleichende Analysen metaproteomic differentiellen Proteinexpressionsmuster zwischen komplexen Gemeinschaften erläutert. Beispiele hierfür sind die Identifizierung von zeitlichen Verschiebungen im Stoffwechsel in der Küsten Nordwest-Atlantik 14 oder der Antarktischen Halbinsel 5. Andere Studien haben Schwankungen der Proteinexpressionsmuster auf räumlichen Skalen von einem nährstoffarmen Ozean gyre zu einer hoch produktiven Küstenauftriebssystem 15 beschrieben, zum Beispiel entlang einer geographischen Transekt. Für weitere Bewertungen von Metaproteomik empfehlen wir Schneider et al. (2010) 9 und Williams et al. (2014) 16. Gezielte Proteomik ist in den letzten Jahren verwendet worden, um die Expression von spezifischen Stoffwechselwege in die Umgebung 17,18 quantifizieren. There sind drei Hauptphasen in metaproteomic Analyse. Die erste Phase ist die Probenvorbereitung, die Probenentnahme, die Zelllyse und die Konzentration des Proteins umfasst. Probensammlung in Marine Mikrobiologie häufig mit der Filtration von Meerwasser durch einen Vorfilter zu größeren eukaryotischen Zellen, Partikel und Partikel-assoziierten Bakterien zu entfernen, gefolgt von Filtration, für die Abscheidung von frei lebenden Mikrobenzellen, die üblicherweise mit der Verwendung eines 0,22 um Patrone Filtereinheit 19,20. Diese Filter werden in einem Plastikzylinder hüllt und eine Zelllyse und Proteinextraktionsprotokoll, das innerhalb der Filtereinheit durchgeführt werden kann, wäre ein wertvolles Werkzeug ist. Einmal Biomasse erhalten wird, müssen die Zellen lysiert werden, um die Proteinextraktion zu ermöglichen. Mehrere Verfahren können verwendet werden, einschließlich Guanidin-HCl-Lyse 21 und Natriumdodecylsulfat (SDS) basierte Lyseverfahren. Obwohl Detergenzien wie SDS sind sehr effizient bei stören Membranen und Solubilisieren vielen Proteinarten, concentrations von nur 0,1% kann mit nachgeschalteten Proteinverdauung und MS-Analyse 22 stören. Wichtiges Anliegen ist die negative Wirkung von SDS auf Trypsinverdau Effizienz, Auflösungsvermögen von Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie und Ionensuppression oder Ansammlung innerhalb der Ionenquelle 23. Die zweite Phase ist die Fraktionierung und Analyse, wo Proteine ​​einer enzymatischen Verdauung, gefolgt von LC MS / MS-Analyse unterzogen, was zu einer m / z-Fragmentierungsmuster, das verwendet werden kann, um die primäre Aminosäuresequenz des ursprünglichen tryptischen Peptids festzustellen. In Abhängigkeit von den Arten von Waschmitteln, sowie die nachgeschaltete Massenspektrometrie Workflow verschiedene Aufschlußmethoden durchgeführt werden. In unserem Protokoll wird 1-D-PAGE-Elektrophorese, gefolgt von Entfernung von SDS aus dem Gel, um jegliche Verunreinigungen zu entfernen Detergens verwendet wird. Die Analyse von Proteinen, die schwer zu solubilisieren, wie Membranproteine ​​sind, erfordert die Verwendung von hohen Konzentrationen von SDS oder andere Reinigungsmittel. Dies führt zu Kompatibilitätsprobleme mit SDS-Gelelektrophorese. Wenn das Ziel einer Studie erfordert die Solubilisierung dieser schwer Proteine ​​löslich, kann das Rohr-Gel-System verwendet werden 22,24. Das Rohr-Gel-Verfahren enthält Proteine ​​innerhalb der Gel-Matrix ohne die Verwendung von Elektrophorese. Anschließend jegliche Detergenzien zur Solubilisierung verwendet werden, bevor die Proteinverdauung entfernt. Die dritte Phase ist die Bioinformatik-Analyse. In dieser Phase werden die MS / MS Peptid Daten werden mit einer Datenbank von setzten Nukleotidsequenzen durchsucht, um festzustellen, welche Peptide und Proteine ​​in der Probe vorhanden sind. Die Identifizierung von Peptiden ist von der Datenbank gegen gesucht. Meeres metaproteomic Daten werden häufig gegen Datenbanken von Referenzgenome, Metagenom-Daten wie die Global Ocean Sampling-Datensatz 25, ebenso wie einzelne Zelle verstärkt Genome von unkultivierten li umfasst gesuchtneages 26,27. Proteinidentifikation kann auch durch den Einschluss von metagenomic Sequenzen aus der gleichen Probe erhöht, wenn der metaproteomic Daten wurden 5 abgeleitet werden. Hier stellen wir ein Protokoll für die Erzeugung von Peptiden geeignet für MS / MS-basierte Analyse von mikrobiellen Biomasse durch Filtration gesammelt und in einem RNA-Stabilisierungslösung gelagert. Das hier beschriebene Protokoll erlaubt DNA und Protein, von der gleichen Probe, so dass alle Schritte, die zu dem Protein und DNA Fällungen identisch sind, isoliert werden. Aus praktischer Sicht wird weniger Filtration erforderlich, da nur ein Filter ist sowohl für Protein und DNA-Extraktion erforderlich. Wir möchten auch, um zu bestätigen, dass dieses Protokoll wurde durch die Kombination, die Anpassung und Änderung von zwei bisher veröffentlichten Protokollen erstellt. Zelllysis Schritte von Saito et al (2011) 28 angepasst. Und die In-Gel-Trypsin-Verdauung Komponente aus Shevche angepaßtNKO et al. (2007) 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterivex -GP 0.22 &#956;m filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>77-86-1 or TB0196-500G</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>15-21-3</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPC Protein Precipitation reagent</td>
			<td>Epicenter</td>
			<td>mmP03750</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Protein Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0375EDU</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CABDH6044-4</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4HCO3</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>1066-33-7</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-4L</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 1.5ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL ROBO vial 9mm</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>VT009/C395SB</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP BM insert, No spring</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>4025P-631</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an aquatic microbial metaproteomics workflow: from cells to tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

Als Demonstration, das Protokoll führten wir auf zwei Meerwasserproben von der Oberfläche und der Chlorophyllmaximum des Küsten Ozean in Nord-Kanada gesammelt. Auf See wurde 6-7 L des Meerwassers durch eine 3 &amp; mgr; GF / D-Vorfilter geleitet, dann mikrobiellen Zellen wurden auf eine 0,22 um-Patronenfiltergerät nach dem Protokoll von Walsh et al. 20 gesammelt. Zellen wurden sofort in einem RNA-Stabilisierungslösung bis zur weiteren Verarbeitung gelagert. Nach der Rückkehr in das Labor, das P...

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An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Ein Aquatic Microbial Metaproteomik Workflow: Von der Zelle zum tryptischen Peptide Geeignet für Tandem-Massenspektrometrie-basierte Analyse

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

an-aquatic-microbial-metaproteomics-workflow-from-cells-to-tryptic

Research

JoVE Journal

Environment

8.7K Aufrufe.  Concordia University. This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Serie: An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study provides a protocol for the passive sampler preparation, calibration, extraction method and instrumental analysis. Sampling rates (RS) and passive sampler-water partition coefficients (KPW) were calculated for silicone rubber, polar organic chemical integrative sampler POCIS-A, POCIS-B, SDB-RPS and C18 disk. The uptake of the selected compounds depended on their physicochemical properties, i.e., silicone rubber showed a better uptake for more hydrophobic compounds (log octanol-water partition coefficient (KOW) &#62; 5.3), whereas POCIS-A, POCIS-B and SDB-RPS disk were more suitable for hydrophilic compounds (log KOW &#60; 0.70).

A protocol about the characterization and application of five different passive sampling devices is presented.

Charakterisierung und Anwendung von Passivsammler für die Überwachung von Pestiziden in Wasser

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Forschung

Umwelt

Alternative Method of Removing Otoliths from Sturgeon

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a transverse vertical incision on the top of the skull with a hand or electrical saw may damage the otolith if not performed correctly. Sturgeons (Acipenseridae) are one family in particular that have a very large and thick skull. A new laboratory method entering the brain cavity from the ventral side of the fish to expose the otoliths was easier than other otolith extraction methods found in the literature. Methods reviewed in the literature are designed for the field and are more efficient at processing large quantities of fish quickly. However, this new technique was designed to be more suited for a laboratory setting when time is not pressing and successful extraction from each specimen is critical. The success of finding and removing otoliths using this technique is very high and does not compromise the structure in any manner. This alternative technique is applicable to other similar fish species for extracting the otoliths.

The goal of the protocol is to show an effective method to extract the otoliths from sturgeon carcasses.

Alternative Verfahren zum Entfernen von Otolithen von Stör

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

Extraktion und Analyse von Microbial Phospholipidfettsäuren in Böden

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

Charakterisierung der aquatischen Biofilme mit Durchflusszytometrie

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

Isolierung und Analyse der mikrobiellen Lebensgemeinschaften im Boden, Rhizosphäre und Wurzeln in mehrjährige Grass Experimente

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

Experimentelles Protokoll für die Prüfung Verhaltensreaktion Profile in Larval Fish: Anwendung auf die Neuro-Stimulans Koffein

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

Zusammensetzung und Verteilungsanalyse Bioaerosole unter verschiedenen Umweltbedingungen

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

Identifizierung von pro- und Polyfluorinated chemische Spezies mit einem kombinierten gezielte und nicht gezielte Screening hochauflösende Massenspektrometrie-Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

Fluoreszierend markierte Bakterien als Tracer, um neuartige Wege des organischen Kohlenstoffflusses in aquatischen Ökosystemen zu enthüllen

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

A Guide to Concentration Alternating Frequency Response Analysis of Fuel Cells

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency response analysis (cFRA) on proton-exchange membrane (PEM) fuel cells. During cFRA experiments, the modulated concentration feed was sent to the cathode of the cell at different frequencies. The electric response, which can be cell potential or current depending on the control applied on the cell, was registered in order to formulate a frequency response transfer function. Unlike traditional electrochemical impedance spectroscopy (EIS), the novel cFRA methodology makes it possible to separate the contribution of different mass transport phenomena from the kinetic charge transfer processes in the frequency response spectra of the cell. Moreover, cFRA is able to differentiate between varying humidification states of the cathode. In this protocol, the focus is on the detailed description of the procedure to perform cFRA experiments. The most critical steps of the measurements and future improvements to the technique are discussed.

We present a protocol for concentration alternating frequency response analysis of fuel cells, a promising new method of studying fuel cell dynamics.

Ein Leitfaden zur Konzentrations-Frequenz-Antwort-Analyse von Brennstoffzellen

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency ...