MS2-Affinitätsreinigung gekoppelt mit RNA-Sequenzierung in grampositiven Bakterien

Zusammenfassung

Die MAPS-Technologie wurde entwickelt, um das Targetom einer bestimmten regulatorischen RNA in vivo zu untersuchen. Die sRNA von Interesse ist mit einem MS2-Aptamer gekennzeichnet, das die Co-Reinigung ihrer RNA-Partner und deren Identifizierung durch RNA-Sequenzierung ermöglicht. Dieses modifizierte Protokoll eignet sich besonders für grampositive Bakterien.

Zusammenfassung

Obwohl kleine regulatorische RNAs (sRNAs) im bakteriellen Bereich des Lebens weit verbreitet sind, sind die Funktionen vieler von ihnen nach wie vor schlecht charakterisiert, insbesondere aufgrund der Schwierigkeit, ihre mRNA-Ziele zu identifizieren. Hier beschrieben wir ein modifiziertes Protokoll der MS2-Affinity Purification in Verbindung mit RNA Sequencing (MAPS) Technologie, mit dem Ziel, alle RNA-Partner einer spezifischen sRNA in vivo aufzudecken. Im Großen und Ganzen ist das MS2-Aptamer mit der 5'-Extremität der interessierenden sRNA verschmolzen. Dieses Konstrukt wird dann in vivo exprimiert, so dass die MS2-sRNA mit ihren zellulären Partnern interagieren kann. Nach der Bakterienernte werden die Zellen mechanisch lysiert. Der Rohextrakt wird in eine Amylose-basierte Chromatographiesäule geladen, die zuvor mit dem MS2-Protein beschichtet ist, das mit dem Maltose-bindenden Protein verschmolzen ist. Dies ermöglicht die spezifische Erfassung von MS2-sRNA und interagierenden RNAs. Nach der Elution werden co-gereinigte RNAs durch Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung und anschließende bioinformatische Analyse identifiziert. Das folgende Protokoll wurde im grampositiven Humanpathogen Staphylococcus aureus implementiert und ist prinzipiell auf alle grampositiven Bakterien übertragbar. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die MAPS-Technologie eine effiziente Methode darstellt, um das regulatorische Netzwerk einer bestimmten sRNA gründlich zu erforschen und eine Momentaufnahme ihres gesamten Targetoms zu bieten. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass die von MAPS identifizierten mutmaßlichen Ziele noch durch komplementäre experimentelle Ansätze validiert werden müssen.

Einleitung

Hunderte, vielleicht sogar Tausende von kleinen regulatorischen RNAs (sRNAs) wurden in den meisten bakteriellen Genomen identifiziert, aber die Funktionen der überwiegenden Mehrheit von ihnen bleiben uncharakterisiert. Insgesamt sind sRNAs kurze nicht-kodierende Moleküle, die eine wichtige Rolle in der bakteriellen Physiologie und Anpassung an schwankende Umgebungen spielen^1,2,3. Tatsächlich stehen diese Makromoleküle im Zentrum zahlreicher komplizierter regulatorischer Netzwerke, die Stoffwechselwege, Stressreaktionen, aber auch Virulenz und Antibiotikaresistenz beeinflussen. Logischerweise wird ihre Synthese durch spezifische Umweltreize (z.B. Nährstoffmangel, oxidativer oder Membranstress) ausgelöst. Die meisten sRNAs regulieren mehrere Ziel-mRNAs auf posttranskriptioneller Ebene durch kurze und nicht zusammenhängende Basenpaarung. Sie verhindern in der Regel die Translationsinitiierung, indem sie mit Ribosomen um Translationsinitiierungsbereiche konkurrieren⁴. Die Bildung von sRNA:mRNA-Duplexen führt häufig auch zum aktiven Abbau der Ziel-mRNA durch Rekrutierung spezifischer RNasen.

Die Charakterisierung eines sRNA-Targetoms (d.h. des gesamten Satzes seiner Ziel-RNAs) ermöglicht die Identifizierung der Stoffwechselwege, in die es eingreift, und des potenziellen Signals, auf das es antwortet. Folglich können die Funktionen einer spezifischen sRNA im Allgemeinen aus ihrem Targetom abgeleitet werden. Zu diesem Zweck wurden mehrere in silico Vorhersagewerkzeuge wie IntaRNA und CopraRNA^5,6,7entwickelt. Sie stützen sich insbesondere auf Sequenz-Komplementarität, Paarungsenergie und Zugänglichkeit der potenziellen Interaktionsstelle, um mutmaßliche sRNA-Partner zu bestimmen. Vorhersagealgorithmen integrieren jedoch nicht alle Faktoren, die die Basenpaarung in vivo beeinflussen, wie die Beteiligung von RNA-Chaperonen^8, die suboptimale Interaktionen begünstigen, oder die Co-Expression beider Partner. Aufgrund ihrer inhärenten Einschränkungen bleibt die Falsch-Positiv-Rate von Vorhersagewerkzeugen hoch. Die meisten experimentellen groß angelegten Ansätze basieren auf der Co-Aufreinigung von sRNA:mRNA-Paaren, die mit einem markierten RNA-bindenden Protein (RBP)^{interagieren 6,9}. Zum Beispiel identifizierte die RIL-seq-Methode (RNA Interaction by Ligation and Sequencing) RNA-Duplexe, die mit RNA-Chaperonen wie Hfq und ProQ in Escherichia coli10^,11co-gereinigt wurden. Eine ähnliche Technologie namens UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) wurde auf RNase E- und Hfq-assoziierte sRNAs in E. coli^12,13angewendet. Trotz der gut beschriebenen Rolle von Hfq und ProQ bei der sRNA-vermittelten Regulation in^mehrerenBakterien⁸,^14,15scheint die sRNA-basierte Regulation in mehreren Organismen wie S. aureus16 , 17^,18RNA-Chaperon-unabhängig zu sein . Auch wenn die Aufreinigung von RNA-Duplexen in Verbindung mit RNasen machbar ist, wie Waters und Mitarbeiter¹³gezeigt haben, bleibt dies schwierig, da RNasen ihren schnellen Abbau auslösen. Daher stellt der MS2-Affinity Purification gekoppelt mit RNA Sequencing (MAPS) Ansatz^19,20 eine solide Alternative in solchen Organismen dar.

Im Gegensatz zu den oben genannten Methoden verwendet MAPS eine spezifische sRNA als Köder, um alle interagierenden RNAs zu erfassen, und ist daher nicht auf die Beteiligung eines RBP angewiesen. Der gesamte Prozess ist in Abbildung 1dargestellt. Kurz gesagt, die sRNA wird an der 5' mit dem MS2-RNA-Aptamer markiert, das spezifisch vom MS2-Mantelprotein erkannt wird. Dieses Protein wird mit dem Maltose-bindenden Protein (MBP) verschmolzen, um auf einem Amyloseharz immobilisiert zu werden. Daher bleiben MS2-sRNA und ihre RNA-Partner auf der Affinitätschromatographiesäule erhalten. Nach der Elution mit Maltose werden co-gereinigte RNAs mittels Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung identifiziert, gefolgt von einer bioinformatischen Analyse (Abbildung 2). Die MAPS-Technologie zeichnet letztendlich eine interagierende Karte aller potenziellen Wechselwirkungen, die in vivo auftreten.

Die MAPS-Technologie wurde ursprünglich im nicht-pathogenen gramnegativen Bakterium E. coli^{21 implementiert.} Bemerkenswerterweise half MAPS dabei, ein tRNA-abgeleitetes Fragment zu identifizieren, das spezifisch mit RyhB- und RybB-sRNAs interagiert und jegliches sRNA-Transkriptionsrauschen verhindert, um mRNA-Ziele unter nicht induzierenden Bedingungen zu regulieren. Danach wurde MAPS erfolgreich auf andere E. coli sRNAs wie DsrA²², RprA²³, CyaR²³ und GcvB²⁴ angewendet (Tabelle 1). Neben der Bestätigung bisher bekannter Ziele erweiterte MAPS das Targetom dieser bekannten sRNAs. Vor kurzem wurde MAPS in Salmonella Typhimurium durchgeführt und zeigte, dass SraL sRNA an Rho mRNA bindet und für einen Transkriptionsabschlussfaktor²⁵kodiert. Durch diese Paarung schützt SraL rho mRNA vor dem vorzeitigen Transkriptionsabschluss, der durch Rho selbst ausgelöst wird. Interessanterweise ist diese Technologie nicht auf sRNAs beschränkt und kann auf jede Art von zellulären RNAs angewendet werden, wie durch die Verwendung eines tRNA-abgeleiteten Fragments²⁶ und einer 5'-unübersetzten Region von mRNA²² veranschaulicht wird (Tabelle 1).

Die MAPS-Methode wurde auch an das pathogene grampositive Bakterium S. aureus¹⁹angepasst. Insbesondere wurde das Lyseprotokoll umfassend modifiziert, um Zellen aufgrund einer dickeren Zellwand als gramnegative Bakterien effizient zu brechen und die RNA-Integrität aufrechtzuerhalten. Dieses angepasste Protokoll entwirrte bereits das Interaktom von RsaA²⁷, RsaI²⁸ und RsaC²⁹. Dieser Ansatz gab Einblicke in die entscheidende Rolle dieser sRNAs bei den Regulationsmechanismen der Zelloberflächeneigenschaften, der Glukoseaufnahme und der oxidativen Stressreaktionen.

Das Protokoll, das 2015 in E. coli entwickelt und implementiert wurde, wurde kürzlich sehr detailliert beschrieben³⁰. Hier stellen wir das modifizierte MAPS-Protokoll zur Verfügung, das sich besonders für die Untersuchung von sRNA-regulatorischen Netzwerken in grampositiven (dickeren Zellwand) Bakterien eignet, ob nicht pathogen oder pathogen (Sicherheitsvorkehrungen).