Diese Arbeit wurde unterstützt durch Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (18K09424 an Toshihide Kurihara und 20K18393 an Yukihiro Miwa) vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT).

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Keio University School of Medicine genehmigt.
1. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten und Tieren
<ol><li>Autoklav chirurgische Instrumente und halten Sie sie in 70% Ethylalkohol. Reinigen Sie vor jedem neuen chirurgischen Eingriff chirurgische Instrumente sorgfältig mit 70% Ethylalkohol.</li>
	<li>Bereiten Sie männliche BALB/cAJc1-Mäuse (6 Wochen alt, 26-28 kg) in einem spezifisch pathogenfreien (SPF) Raum vor, um sterile Bedingungen vor, während und nach der Operation aufrechtzuerhalten.</li>
</ol>2. Transiente bilaterale gemeinsame Karotisarterienverschluss (tBCCAO)
<ol><li>Setzen Sie eine Maus unter Anästhesie durch intraperitoneale Injektion mit einer Kombination aus Midazolam (40 g/100 l), Medetomidin (7,5 g/100 l) und Butorphanoltartrat (50 g/100 l), wie zuvor beschrieben8,9. Halten Sie die Hinterhaut der Maus, um die Maus davon abzuhalten, ihre Augen zu stoßen, bis die Maus vollständig beästhebt ist.<ol>
<li>Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Maus Zehen kneifen, bis sie keine Antwort hat, von welcher Methode wird häufig für die Überprüfung der vollständigen Anästhesie10verwendet. HINWEIS: Im Allgemeinen sind weniger als 5 min erforderlich, damit Mäuse einschlafen können. Richtige Rezepte für die Vollnarkose können von Institutionen unterschiedlich sein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tragen Sie einen Tropfen von 0,1% gereinigte Natriumhyaluronat Augentropfenlösung auf die Augen auf, um Trockenheit auf den Augen unter Anästhesie zu verhindern.</li>
	<li>Legen Sie die Maus auf den Rücken und fixieren Sie die Pfoten der Maus mit Klebebändern.</li>
	<li>Desinfizieren Sie den Halsbereich der Maus mit 70% Ethylalkohol vor der Operation. HINWEIS: ZusätzlicheS Abschneiden des Fells wurde nicht durchgeführt, da dies zu einer nachfolgenden Hautentzündung führen kann11,12.</li>
	<li>Führen Sie einen sagittalen Schnitt des Halses mit einer Klinge (Abbildung 1). HINWEIS: Der Schnitt muss an der Mittellinie zwischen Hals, Brustbein und Luftröhre erfolgen.</li>
	<li>Trennen Sie beide Speicheldrüsen sorgfältig mit zwei Zangen und mobilisieren Sie sie, um die zugrunde liegenden CCAs zu visualisieren.</li>
	<li>Isolieren Sie die richtige CCA sorgfältig von den jeweiligen vagalen Nerven und begleitenden Venen, ohne ihre Strukturen zu schädigen, und legen Sie zwei 6-0 Seidennähte unter die CCA. Binden Sie die beiden Krawatten fest, um den Blutfluss zu blockieren (Abbildung 1). HINWEIS: Während des Verfahrens können kleine Venen beschädigt werden. Wenn Blutungen auftreten, ist ein Wischen erforderlich, um die CCAs klar zu visualisieren.</li>
	<li>Finden Sie die linke CCA sorgfältig von den jeweiligen vagalen Nerven und begleitenden Venen, ohne ihre Strukturen zu beschädigen, und verschließen Sie die linke CCA für 2 Sekunden durch eine Klemme (Abbildung 1). HINWEIS: Eine 6-0 Seidennahtnadel muss unter dem linken CCA platziert werden, um eine Stelle zum Spannen zu markieren.</li>
	<li>Nach wiedererbrechen der linken CCA, Nähte des Halses durch eine 6-0 Seidennaht und wenden Sie einen Tupfer von Antibiotikum (50 l) auf den Hals, um bakterielle Infektion zu hemmen. HINWEIS: Entfernen Sie beim Wiederöffnen des linken CCA eine Klemme, um eine Beschädigung der Arterienwand zu vermeiden.</li>
	<li>Injizieren Sie 0,75 mg/kg Atipamezolhydrochlorid intraperitoneal in die Maus, um der Maus zu helfen, sich schnell von der tiefen Anästhesie erholt zu haben. Bringen Sie die Maus in einen Mauskäfig mit vorgeheizten Pads zurück. HINWEIS: Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis die Maus wieder genügend Bewusstsein, um die Brustbeschisse zu erhalten.</li>
	<li>Injizieren Sie 0,4 mg/kg Butorphanoltartrat in die Maus, um Schmerzen zu lindern, wenn die Maus aufwacht. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Als erster Hinweis für erfolgreiches tBCCAO ist ein Augenlid-Tropfen der Maus zu beobachten (Abbildung 2).</li>
	<li>Zur Euthanasie spritzen Sie den Mäusen 3x MMB-Mischung und opfern sie für Experimente.</li>
</ol>3. Allgemeine Beobachtungen (Überlebensraten und Augenlidtropfen)
<ol><li>Überprüfen Sie nach der Operation die Überlebensraten auf alle Todesursachen am Tag 0 (nach der Operation), 1, 3 und 7.</li>
	<li>Beurteilen Sie das Augenlid-Tropfen mit einer 4-Punkt-Bewertungsskala: 1 = kein Absinken, 2 = leichtes Absinken (50 %), 3 = schweres Abtropfen (über 50 %) und 4 = starkes Abtropfen mit Augenentladung.</li>
</ol>4. Retinale Blutperfusion
<ol><li>Injizieren Sie 200 l FITC-Dextran (25 mg/ml) in den linken Herzkammerschlitz der Maus, die häufig für die Beobachtung der Blutperfusion in mausretinalen Gefäßen13,14verwendet wird.</li>
	<li>2 Minuten nach der Zirkulation die Augen enukleieren und 1 Stunde lang in 4% Paraformaldehyd fixieren. Die Netzhaut wurde, wie zuvor beschrieben15,sorgfältig erhalten und flach montiert und mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.</li>
	<li>Fotografieren Sie die retinalen ganzen Halterungen bei 4-facher Vergrößerung und verschmelzen Sie mit einem Zusammenführungsanalysator zu einem einzigen, zuvor beschriebenen16.</li>
	<li>Messen Sie die durchgedreten Bereiche mit einem Gefäßanalysetool in der NIH Fiji/ImageJ-Software.</li>
</ol>5. Westlicher Fleck
<ol><li>3 und 6 Stunden nach tBCCAO, erhalten Sie die Augen von Mäusen und sofort auf eine Petrischale mit kaltem PBS übertragen, um die Netzhaut zu isolieren.</li>
	<li>Führen Sie nach der Isolierung der Netzhaut eine westliche Blotting, wie zuvor beschrieben9.</li>
	<li>Inkubieren Sie über Nacht mit Antikörpern für den hypoxieinduzierbaren Faktor-1 (HIF-1- und ein allgemeiner Hypoxie-Marker) und für β-Actin (eine interne Belastungskontrolle), gefolgt von der Inkubation von HRP-konjugierten Sekundärantikörpern. Visualisieren Sie die Signale über Chemilumineszenz.</li>
</ol>6. Quantitative PCR (qPCR)
<ol><li>6, 12 und 24 Stunden nach tBCCAO, verarbeiten Sie die erhaltenen Netzhaut für qPCR, wie zuvor beschrieben17.</li>
	<li>Führen Sie qPCR über ein Echtzeit-PCR-System aus. Verwendete Primer sind in Tabelle 1aufgeführt. Berechnen Sie Faltenänderungen zwischen Ebenen verschiedener Transkripte nach der Methode "CT".</li>
</ol>7. Immunhistochemie (IHC)
<ol><li>3 Tage nach tBCCAO die Augen von Mäusen erhalten und in Paraffin einbetten.</li>
	<li>Schneiden Sie die paraffin-eingebetteten Augen durch ein Mikrotome, um die Augenpartien zu erhalten.</li>
	<li>Deparaffinisieren und färben Sie die Augenabschnitte von 5 m Dicke, wie zuvor beschrieben13.</li>
	<li>Inkubieren Sie mit einem Antikörper für glialfibrilläres saures Protein (GFAP; ein zuverlässiger Marker für Astrozyten und Müller-Zellen in der Netzhaut) über Nacht, gefolgt von der Inkubation von Alexa Fluor 555-konjugierten Sekundärantikörpern.</li>
	<li>Verwenden Sie DAPI (4,6-Diamidino-2-Phenylindole) zur Färbung des Kerns in der Netzhaut. Visualisierung von Signalen über ein Fluoreszenzmikroskop.</li>
	<li>Bewerten Sie die Morphologiebewertung anhand einer 4-Punkte-Bewertungsskala, wie zuvor beschrieben13,18: 0 = kein Signal, 1 = wenige positive Glia-Endfüße in der Ganglienzellschicht (GCL), 2 = wenige markierte Prozesse, die von GCL bis zur äußeren Kernschicht (ONL) reichen, und 3 = am meisten markierte Prozesse, die von GCL bis ONL reichen.</li>
</ol>8. Elektroretinographie (ERG)
<ol><li>3 und 7 Tage nach tBCCAO, führen Sie ERG mit einer Ganzfeld-Kuppel, einem Erfassungssystem und LED-Stimulatoren durch, wie zuvor beschrieben9.</li>
	<li>Nach dunkler Anpassung über Nacht, beanmaßen Sie Mäuse mit einer Kombination von MMB unter dunklem roten Licht.</li>
	<li>Verwenden Sie eine gemischte Lösung von 0,5% Tropicamid und 0,5% Phenylephrin, um die Pupillen zu verdorn.</li>
	<li>Legen Sie die aktiven Elektroden auf die Kontaktlinse und legen Sie die Referenzelektrode in den Mund.</li>
	<li>Erhalten Sie ERG-Antworten von beiden Augen jedes Tieres.</li>
	<li>Zeichnen Sie skotopische Reaktionen unter dunkler Anpassung mit verschiedenen Reizen auf.</li>
	<li>Messen Sie die Amplituden der A-Welle von der Grundlinie bis zum tiefsten Punkt der A-Welle.</li>
	<li>Messen Sie die Amplituden der B-Welle vom tiefsten Punkt der A-Welle bis zum Gipfel der B-Welle.</li>
	<li>Halten Sie alle Mäuse während des Eingriffs mit Wärmepads warm.</li>
</ol>9. Optische Kohärenztomographie (OCT)
<ol><li>2 Wochen nach tBCCAO, führen Sie OCT mit SD-OCT-System, wie zuvor berichtet8,9.</li>
	<li>Für die Messung Mäuse einer Mydriasis durch eine gemischte Lösung von 0,5% Tropicamid und 0,5% Phenylephrin und der Vollnarkose durch eine Mischung aus MMB unterziehen.</li>
	<li>Erhalten Sie B-Scan-Bilder aus äquatorialen Slices von En-Face-Scans.</li>
	<li>Untersuchen Sie die Netzhaut bei 0,2, 0,4 und 0,6 mm vom Sehnervenkopf entfernt.</li>
	<li>Messen Sie die Netzhautdicke von der retinalen Nervenfaserschicht (NFL) bis zur externen Grenzmembran (ELM), und betrachten Sie den Durchschnitt der Gemessenen Werte als Netzhautdicke einer einzelnen Maus.</li>
	<li>Zeichnen Sie die Ergebnisse als Spinnendiagramme.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

In der Studie haben wir gezeigt, dass tBCCAO, mit einfachen Nähten und einer Klemme, netzhautische Ischämie und begleitende Netzhautfunktionsstörung induzieren könnte. Darüber hinaus haben wir unser aktuelles Protokoll für die Entwicklung eines Mausmodells der retinalen Ischämie demonstriert ist einfacher und schneller im Vergleich zu anderen früheren Protokollen für die Entwicklung von retinalen ischämischen Verletzungsmodellen2,3,<sup class...

Die Netzhaut ist ein neurosensorisches Gewebe für die visuelle Funktion. Da eine erhebliche Menge an Sauerstoff für die visuelle Funktion benötigt wird, ist die Netzhaut als eines der höchsten sauerstofffordernden Gewebe im Körperbekannt 1. Die Netzhaut ist anfällig für Gefäßerkrankungen, da Sauerstoff über die Blutgefäße abgegeben wird. Verschiedene Arten von Gefäßerkrankungen, wie diabetische Retinopathie und Netzhautblutgefäß (Venen oder Arterien) Okklusion, können netzhautische Ischämie induzieren. Zur Untersuchung pathologischer Mechanismen der retinalen Ischämie werden reproduzierbare und klinisch relevante experimentelle Modelle der retinalen Ischämie als notwendig erachtet. Die mittlere zerebrale Arterienverschluss (MCAO) durch Einsetzen eines intraluminalen Filaments ist die am häufigsten verwendete Methode zur Entwicklung von in vivo Nagetiermodellen der experimentellen zerebralen Ischämie2,3. Aufgrund der Nähe der ophthalmologischen Arterie (OpA) zu MCA werden MCAO-Modelle auch gleichzeitig verwendet, um die Pathophysiologie der Netzhautischämie4,5,6zu verstehen. Um zerebrale Ischämie zusammen mit retinaler Ischämie zu induzieren, werden lange Filamente in der Regel durch Inzision der gemeinsamen Halsschlagader (CCA) oder der äußeren Halsschlagader (ECA) eingesetzt. Diese Methoden sind schwierig durchzuführen, benötigen eine lange Zeit, um die Operation abzuschließen (über 60 Minuten für eine Maus), und führen zu hohen Variabilitäten in den Ergebnissen nach der Operation7. Es ist nach wie vor wichtig, ein besseres Modell zu entwickeln, um diese Bedenken zu verbessern.
In dieser Studie verwendeten wir einfach kurze transiente bilaterale CCA-Okklusion (tBCCAO) mit Nadeln und einer Klemme, um retinale Ischämie bei Mäusen zu induzieren und analysierten typische Ergebnisse ischämischer Verletzungen in der Netzhaut. In diesem Video werden wir eine Demonstration des tBCCAO-Verfahrens geben.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride</td>
			<td>Zenoaq</td>
			<td>Antisedan</td>
			<td>For anti-anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 7500 Fast</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>For qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol tartrate</td>
			<td>Meiji Seika Pharma</td>
			<td>Vetorphale</td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZ-II Analyzer</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>-</td>
			<td>For an image merge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/cAJc1</td>
			<td>CLEA</td>
			<td>-</td>
			<td>Mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (8H10D10) Mouse mAb</td>
			<td>CST</td>
			<td>3700</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp Forcep</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>WPI 500451</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>340-07971</td>
			<td>For IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envisu SD-OCT system</td>
			<td>Leica</td>
			<td>R4310</td>
			<td>For OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran</td>
			<td>Merk</td>
			<td>FD2000S</td>
			<td>For retinal blood perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>BZ-9000</td>
			<td>For fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatifloxacin hydrate</td>
			<td>Senju Pharmaceutical</td>
			<td>Gachifuro</td>
			<td>For anti-bacterial infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>For IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Marukan</td>
			<td>RH-200</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIF-1&#945; (D1S7W) XP Rabbit mAb</td>
			<td>CST</td>
			<td>36169</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS 4000 mini</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>-</td>
			<td>For chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Sandoz K.K</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Tissue-Tek TEC 6</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>-</td>
			<td>For sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Corporation</td>
			<td>Domitor</td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Handaya</td>
			<td>HS-2307</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PuREC</td>
			<td>MAYO Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>For ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hyaluronate</td>
			<td>Santen Pharmaceutical</td>
			<td>Hyalein</td>
			<td>For eye lubrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide/Penylephrine hydrochloride</td>
			<td>Santen Pharmaceutical</td>
			<td>Mydrin-P</td>
			<td>For mydriasis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 silk suture</td>
			<td>Natsume</td>
			<td>E12-60N2</td>
			<td>For surgery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine model of ischemic retinal injury induced by transient bilateral common carotid artery occlusion

Verschiedene Gefäßerkrankungen wie diabetische Retinopathie, Okklusion der Netzhautvenen oder Arterien und das okuläre ischämische Syndrom können zu retinaler Ischämie führen. Um pathologische Mechanismen der retinalen Ischämie zu untersuchen, müssen relevante experimentelle Modelle entwickelt werden. Anatomisch ist ein Haupt-Retinal-Blutversorgungsgefäß die ophthalmologische Arterie (OpA) und OpA stammt aus der inneren Halsschlagader der gemeinsamen Halsschlagader (CCA). So könnte eine Störung der CCA effektiv retinale Ischämie verursachen. Hier haben wir ein Mausmodell der retinalen Ischämie durch vorübergehende bilaterale gemeinsame Karotisarterienverschluss (tBCCAO) etabliert, um die rechte CCA mit 6-0 Seidennähten zu binden und die linke CCA vorübergehend für 2 Sekunden über eine Klemme zu verschließen, und zeigten, dass tBCCAO akute retinale Ischämie induzieren kann, die zu einer retinalen Dysfunktion führt. Die aktuelle Methode reduziert die Abhängigkeit von chirurgischen Instrumenten, indem sie nur chirurgische Nadeln und eine Klemme verwendet, verkürzt die Okklusionszeit, um unerwartete Tiersterben zu minimieren, was häufig in Mausmodellen der mittleren Zerebrierungsokklusion zu beobachten ist, und behält die Reproduzierbarkeit der häufigen retinalen ischämischen Befunde bei. Das Modell kann verwendet werden, um die Pathophysiologie der ischämischen Retinopathien bei Mäusen zu untersuchen und kann weiter für in vivo Drogenscreening verwendet werden.

Nach systemischer Zirkulation von FITC-Dextran für 2 Minuten wurden netzhautvaskulaturen der linken und rechten Netzhaut bei den scheinbetriebenen Mäusen und tBCCAO-betriebenen Mäusen untersucht (Zusatzabbildung 1). FITC-Dextran war sowohl in den Netzhaut bei den scheinbetriebenen Mäusen als auch in der linken Netzhaut bei den tBCCAO-betriebenen Mäusen vollständig sichtbar, während es in der rechten Netzhaut bei den tBCCAO-betriebenen Mäusen teilweise nachweisbar war.
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A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion

Hier beschreiben wir ein Mausmodell der retinalen Ischämie durch vorübergehende bilaterale gemeinsame Karotisarterienverschluss mit einfachen Nähten und einer Klemme. Dieses Modell kann nützlich sein, um die pathologischen Mechanismen der retinalen Ischämie zu verstehen, die durch kardiovaskuläre Anomalien verursacht wird.

Ein murines Modell der ischämischen Netzhautverletzung induziert durch transiente bilaterale gemeinsame Carotis ArterieNverschluss

Diverse vascular diseases such as diabetic retinopathy, occlusion of retinal veins or arteries and ocular ischemic syndrome can lead to retinal ischemia. ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

7.4K Aufrufe.  Keio University School of Medicine. Hier beschreiben wir ein Mausmodell der retinalen Ischämie durch vorübergehende bilaterale gemeinsame Karotisarterienverschluss mit einfachen Nähten und einer Klemme. Dieses Modell kann nützlich sein, um die pathologischen Mechanismen der retinalen Ischämie zu verstehen, die durch kardiovaskuläre Anomalien verursacht wird.

Serie: A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified version of carotid partial ligation methods [1,2] to show that it acutely induces low and oscillatory flow conditions, two key characteristics of disturbed flow, in the mouse common carotid artery. Using this model, we have provided direct evidence that disturbed flow indeed leads to rapid and robust atherosclerosis development in Apolipoprotein E knockout mouse [3]. We also developed a method of endothelial RNA preparation with high purity from the mouse carotid intima [3]. Using this mouse model and method, we found that partial ligation causes endothelial dysfunction in a week, followed by robust and rapid atheroma formation in two weeks in a hyperlipidemic mouse model along with features of complex lesion formation such as intraplaque neovascularization by four weeks. This rapid in vivo model and the endothelial RNA preparation method could be used to determine molecular mechanisms underlying flow-dependent regulation of vascular biology and diseases. Also, it could be used to test various therapeutic interventions targeting endothelial dysfunction and atherosclerosis in considerably reduced study duration.

This describes a partial carotid ligation surgery, which causes disturbed flow conditions and subsequent atherosclerosis development (in two weeks) with intraplaque neo-vascularization (in four weeks) in the mouse common carotid artery. We also describe a novel method of RNA isolation from the carotid intima, providing high purity endothelial RNA.

Ein Modell des Disturbed Flow-Atherosklerose in Maus Halsschlagader durch partielle Ligation und eine einfache Methode zur RNA-Isolierung aus Carotid Endothelium

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

Forschung

Medizin

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

Bilaterale Arteria carotis communis Occlusion als adäquate Vorbehandlung Stimulus zu frühe ischämische Toleranz zu Focal zerebraler Ischämie induzieren

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in 20091, 2. Several models of cerebral ischemia have been developed to mimic the human condition of stroke. It has been suggested that up to 80% of all strokes result from ischemic damage in the middle cerebral artery (MCA) area3. In the early 1990s, endothelin-1 (ET-1) 4 was used to induce ischemia by applying it directly adjacent to the surface of the MCA after craniotomy. Later, this model was modified 5 by using a stereotaxic injection of ET-1 adjacent to the MCA to produce focal cerebral ischemia. The main advantages of this model include the ability to perform the procedure quickly, the ability to control artery constriction by altering the dose of ET-1 delivered, no need to manipulate the extracranial vessels supplying blood to the brain as well as gradual reperfusion rates that more closely mimics the reperfusion in humans5-7. On the other hand, the ET-1 model has disadvantages that include the need for a craniotomy, as well as higher variability in stroke volume8. This variability can be reduced with the use of laser Doppler flowmetry (LDF) to verify cerebral ischemia during ET-1 infusion. Factors that affect stroke variability include precision of infusion and the batch of the ET-1 used6. Another important consideration is that although reperfusion is a common occurrence in human stroke, the duration of occlusion for ET-1 induced MCAO may not closely mimic that of human stroke where many patients have partial reperfusion over a period of hours to days following occlusion9, 10. This protocol will describe in detail the ET-1 induced MCAO model for ischemic stroke in rats. It will also draw attention to special considerations and potential drawbacks throughout the procedure.

Several animal models of cerebral ischemia have been developed to simulate the human condition of stroke. This protocol describes the endothelin-1 (ET-1) induced middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke in rats. In addition, important considerations, advantages, and shortcomings of this model are discussed.

Endothelin-1 induzierte Middle Cerebral Artery Occlusion Modell für ischämischen Schlaganfall mit Laser Doppler Flowmetrie Guidance in Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Adult Mouse Venous Hypertension Model: Common Carotid Artery to External Jugular Vein Anastomosis.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model creating an artificial fistula between the common carotid artery (CCA) and the external jugular vein (EJV) has been widely described and proved technically feasible. This construct provokes a consistent cerebral venous hypertension (CVH), and therefore has helped studying the contribution of venous hypertension to formation, clinical symptoms, and prognosis of brain AVMs and dural AVFs. Equivalent mice models have been only scarcely described and have shown trouble with stenosis of the fistula. An established murine model would allow the study of not only pathophysiology but also potential genetic therapies for these cerebrovascular diseases.
We present a model of arteriovenous fistula that produces a durable intracranial venous hypertension in the mouse. Microsurgical anastomosis of the murine CCA and EJV can be difficult due to diminutive anatomy and frequently result in a non-patent fistula. In this step-by-step protocol we address all the important challenges encountered during this procedure. Avoiding excessive retraction of the vein during the exposure, using 11-0 sutures instead of 10-0, and making a carefully planned end-to-side anastomosis are some of the critical steps. Although this method requires advanced microsurgical skills and a longer learning curve that the equivalent in the rat, it can be consistently developed.
This novel model has been designed to integrate transgenic mouse techniques with a previously well-established experimental system that has proved useful to study brain AVMs and dural AVFs. By opening the possibility of using transgenic mice, a broader spectrum of valid models can be achieved and genetic treatments can also be tested. The experimental construct could also be further adapted to the study of other cerebrovascular diseases related with venous hypertension such as migraine, transient global amnesia, transient monocular blindness, etc.

We describe a method for creating a reliable model of cerebral venous hypertension in the adult mouse. This model has been widely described and tested in the rat. This new counterpart in the mice opens the possibility of using genetic modified animals and thereby broadens the applications of the model.

Erwachsene Maus venöse Bluthochdruckmodell: A. carotis communis, um äußere Jugularvene Anastomose.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, obesity and diabetes. Accordingly, when evaluating therapies for stroke in animals, it is important to select a model with excellent face validity. Ischemic stroke accounts for 80% of all strokes, and the majority of these occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), often inducing infarcts that affect the sensorimotor cortex, causing persistent plegia or paresis on the contralateral side of the body. We demonstrate in this video a method for producing ischemic stroke in elderly rats, which causes sustained sensorimotor disability and substantial cortical infarcts. Specifically, we induce permanent distal middle cerebral artery occlusion (MCAO) in elderly female rats by using diathermy forceps to occlude a short segment of this artery. The carotid artery on the ipsilateral side to the lesion was then permanently occluded and the contralateral carotid artery was transiently occluded for 60 min. We measure the infarct size using structural T2-weighted magnetic resonance imaging (MRI) at 24 hr and 8 weeks after stroke. In this study, the mean infarct volume was 4.5% &#177; 2.0% (standard deviation) of the ipsilateral hemisphere at 24 hr (corrected for brain swelling using Gerriet&#8217;s equation, n = 5). This model is feasible and clinically relevant as it permits the induction of sustained sensorimotor deficits, which is important for the elucidation of pathophysiological mechanisms and novel treatments.

Here we present a protocol to produce permanent distal middle cerebral artery occlusion in elderly female rats with simultaneous occlusion of the carotid arteries to generate large cortical infarcts and sustained deficits. We show confirmation of the lesion size using structural MRI at 24 hr and 8 weeks after stroke.

Darstellende Permanent Distal cerebri mit Arteria carotis communis Occlusion bei alten Ratten zu studieren kortikale Ischämie mit anhaltenden Behinderungs

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.

Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Modell von Neugeborenen Stroke in P10 Ratten

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves focal endothelial-selective transgenesis, thereby allowing an investigator to determine the biological roles of endothelial-expressed transgenes and to quantify the in vivo transcriptional activity of DNA sequences in large artery endothelial cells. The method uses surgical isolation of rabbit common carotid arteries and an arteriotomy to deliver a transgene-expressing viral vector into the arterial lumen. A short incubation period of the vector in the lumen, with subsequent aspiration of the lumen contents, is sufficient to achieve efficient and durable expression of the transgene in the endothelium, with no detectable transduction or expression outside of the isolated arterial segment. The method allows assessment of the biological activities of transgene products both in normal arteries and in models of human vascular disease, while avoiding systemic effects that could be caused either by targeting gene delivery to other sites (e.g. the liver) or by the alternative approach of delivering genetic constructs to the endothelium by germ line transgenesis. Application of the method is limited by the need for a skilled surgeon and anesthetist, a well-equipped operating room, the costs of purchasing and housing rabbits, and the need for expertise in gene-transfer vector construction and use. Results obtained with this method include: transgene-related alterations in arterial structure, cellularity, extracellular matrix, or vasomotor function; increases or reductions in arterial inflammation; alterations in vascular cell apoptosis; and progression, retardation, or regression of diseases such as intimal hyperplasia or atherosclerosis. The method also allows measurement of the ability of native and synthetic DNA regulatory sequences to alter transgene expression in endothelial cells, providing results that include: levels of transgene mRNA, levels of transgene protein, and levels of transgene enzymatic activity.

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

This method is to introduce a transgene into the endothelium of rabbit carotid arteries. Introduction of the transgene allows the assessment of the biological role of the transgene product either in normal arteries or disease models. The method is also useful for measuring activity of DNA regulatory sequences.

In Vivo Gentransfer in die Kaninchen gemeinsame Halsschlagader Endothel

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, intimal hyperplasia, and atherosclerosis. The goal of this article is to demonstrate a method for placing bilateral venous interposition grafts in a rabbit, then transducing the grafts with a gene transfer vector that achieves durable transgene expression. The method allows the investigation of the biological roles of genes and their protein products in normal vein graft homeostasis. It also allows the testing of transgenes for the activities that could prevent vein graft failure, e.g., whether the expression of a transgene prevents the neointimal growth, reduces the vascular inflammation, or reduces atherosclerosis in rabbits fed with a high-fat diet. During an initial survival surgery, the segments of right and left external jugular vein are excised and placed bilaterally as reversed end-to-side common carotid artery interposition grafts. During a second survival surgery, performed 28 days later, each of the grafts is isolated from the circulation with vascular clips and the lumens are filled (via an arteriotomy) with a solution containing a helper-dependent adenoviral (HDAd) vector. After a 20-min incubation, the vector solution is aspirated, the arteriotomy is repaired, and flow is restored. The veins are harvested at time points dictated by individual experimental protocols. The 28-day delay between the graft placement and the transduction is necessary to ensure the adaptation of the vein graft to the arterial circulation. This adaptation avoids rapid loss of transgene expression that occurs in vein grafts transduced before or immediately after grafting. The method is unique in its ability to achieve durable, stable transgene expression in grafted veins. Compared to other large animal vein graft models, rabbits have advantages of low cost and easy handling. Compared to rodent vein graft models, rabbits have larger and easier-to-manipulate blood vessels that provide abundant tissue for analysis.

This method describes the placement of interposition vein grafts in rabbits, the transduction of the grafts, and the achievement of durable transgene expression. This allows the investigation of physiological and pathological roles of transgenes and their protein products in grafted veins, and testing of gene therapies for vein graft disease.

Ein Kaninchen-Modell der dauerhafte Transgene Ausdruck in Halsschlagader, gemeinsame Halsschlagader Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, ...

Ferric Chloride-induced Canine Carotid Artery Thrombosis: A Large Animal Model of Vascular Injury

Occlusive arterial thrombosis leading to cerebral ischemic stroke and myocardial infarction contributes to ~13 million deaths every year globally. Here, we have translated a vascular injury model from a small animal into a large animal (canine), with slight modifications that can be used for pre-clinical screening of prophylactic and thrombolytic agents. In addition to the surgical methods, the modified protocol describes the step-by-step methods to assess carotid artery canalization by angiography, detailed instructions to process both the brain and carotid artery for histological analysis to verify carotid canalization and cerebral hemorrhage, and specific parameters to complete an assessment of downstream thromboembolic events by utilizing magnetic resonance imaging (MRI). In addition, specific procedural changes from the previously well-established small animal model necessary to translate into a large animal (canine) vascular injury are discussed.

Here, we present the modifications necessary to a well characterized and commonly used small animal ferric chloride-induced (FeCl3) carotid artery injury model for use in a large animal vascular injury model. The resulting model can be utilized for pre-clinical trial assessment of both prophylactic and thrombolytic pharmacological and mechanical interventions.

Eisenchlorid-induzierte eckzahn Halsschlagader Thrombosen: Eine große Tiermodell der Gefäßverletzung

Occlusive arterial thrombosis leading to cerebral ischemic stroke and myocardial infarction contributes to ~13 million deaths every year globally. Here, ...

Middle Cerebral Artery Occlusion Allowing Reperfusion via Common Carotid Artery Repair in Mice

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue plasminogen activator (tPA) as an approved drug treatment to target ischemic strokes. Current research in the field of ischemic stroke focuses on better understanding the pathophysiology of stroke, to develop and investigate novel pharmaceutical targets. Reliable experimental stroke models are crucial for the progression of potential treatments. The middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is clinically relevant and the most frequently used surgical model of ischemic stroke in rodents. However, the outcomes of this model, such as lesion volume, are associated with high levels of variability, particularly in mice. The alternative MCAO model described here allows the reperfusion of the common carotid artery (CCA) and the increased perfusion of the middle cerebral artery (MCA) territory, using a tissue pad with fibrinogen-based sealant to repair the vessel, and the improved welfare of the mice by avoiding external carotid artery (ECA) ligation. This reduces the reliance on the Circle of Willis, which is known to be highly anatomically variable in mice. Representative data show that using this alternative surgical approach decreases the variability in lesion volumes between the traditional MCAO approach and the alternative approach described here.

Intraluminal filament occlusion of the middle cerebral artery is the most frequently used in vivo model of experimental stroke in rodents. An alternative surgical approach to allow common carotid artery repair is performed here, which allows the reperfusion of the common carotid artery and a full reperfusion to the middle cerebral artery territory.

Mittlere zerebrale Arterie Okklusion so dass Reperfusion über gemeinsame Halsschlagader Reparatur bei Mäusen

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue ...