Hier zeigen wir die Updegraff-Methode, die weltweit am weitesten verbreitete Methode zur Abschätzung des kristallinen Zellulosegehalts. Cellulose besteht im Wesentlichen aus Glucosemonomeren, die durch Beta-1, 4 glykodidische Bindungen verbunden sind. Wir haben dieses Protokoll in fünf Phasen unterteilt.
In der ersten Phase bereiten wir den pflanzlichen Biomassematerial vor. In der zweiten Phase extrahieren wir die rohe Zellwand. In der dritten Phase verwenden wir updegraff-Behandlung, bei der Updegraff aus Essigsäure und Salpetersäure besteht, die bei der Entfernung von Hemicellulose und Lignin aus unseren Proben hilft.
In der vierten Phase unterziehen wir sie einer sauren Hydrolyse mit Hilfe von Schwefelsäure, die die Glukosemonomere produziert. Schließlich verwenden wir in der fünften Phase einen Anthron-Assay, um den kristallinen Zellulosegehalt zu schätzen. Sammeln Sie das Pflanzenmaterial aus dem Gewächshaus, waschen Sie es gründlich mit Wasser, trocknen Sie es zwei Tage lang, trennen Sie das Gewebe und übertragen Sie das Gewebe in die individuell gekennzeichneten Behälter und inkubieren Sie im Inkubator bei 49 Grad Celsius für 10 Tage.
Dann schließlich in Stücke schneiden mit Schere oder Klinge. Einfrieren des Gewebes und laste in Mörtel und Stößel für feines Schleifen in gleichmäßiges Pulver oder alternativ verwenden Freezer / Mühle. Hier demonstrieren wir mit Freezer/Mill, also laden wir unsere Gewebeproben in diese Schleiffläschchen und legen sie in den Gefrierschrank/Mühle und führen die 10 CP-Geschwindigkeit für drei Zyklen aus.
Das Gewebepulver wird in der Falcon-Röhre gesammelt, wie hier gezeigt. Wiegen Sie 20 mg des Gewebepulvers und übertragen Sie in ein vorgewogenes zwei ml-Rohr. Fügen Sie einen ml Protein-Löslichkeitspuffer hinzu, um Proteine zu entfernen. Vortex.
Zentrifuge bei 15.000 U/min für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei Weitere Male.
Fügen Sie dem zurückgehaltenen Pellet ein ml steriles Wasser hinzu. Vortex. Zentrifuge bei 15.000 U/min für fünf Minuten. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei Weitere Male.
Fügen Sie dem zurückgehaltenen Pellet einen ML 70% Ethanol hinzu. Vortex. Transfer in einen vorgeheizten 70 Grad Celsius Block bei gleichzeitigem Schütteln für eine Stunde. Nach einer Stunde Inkubation zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 15.000 U/min.
Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Zum gespeicherten Pellet einen ml 100%Methylon hinzufügen. Vortex. Zentrifuge bei 15.000 U/min für fünf Minuten.
Fügen Sie ein ml Chloroform-Methanol hinzu. Vortex. Zentrifuge bei 15.000 U/min für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie einen ML Aceton hinzu. Vortex.
Bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubieren. Zentrifuge bei 15.000 U/min für fünf Minuten. Den Überstand wieder entsorgen und bei 37 Grad Celsius über Nacht trocknen oder durch Vakuumtrocknung fortsetzen.
Laden Sie Ihre Proben in den Vakuumtrockner und trocknen Sie zwei bis drei Stunden trocken oder bis das Pellet vollständig trocken ist. Wiegen Sie fünf mg des Zellwandextrakts aus dem vorherigen Schritt. In ein zwei ml Schraubverschlussrohr übertragen.
Auch positive Kontrolle an dieser Stelle enthalten. Verwenden Sie zwei mg Whatman Filterpapier für diesen Zweck. Auf ein zwei ml Schraubverschlussrohr übertragen.
Fügen Sie 1,5 ml Updegraff-Reagenz zu jedem gewogenen Zellwandextrakt hinzu. Wirbel und inkubieren bei 100 Grad Celsius in einem vorgeheizten Block für 30 Minuten. Nach 30 Minuten Inkubation in ein Rack übertragen.
Lassen Sie es auf der Bank für 10 Minuten abkühlen. Zentrifuge bei 15.000 U/min für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
Fügen Sie ein ml steriles Wasser hinzu. Vortex. Zentrifuge bei 15.000 U/min für 10 Minuten. Entsorgen Sie 500 Mikroliter des Überstandes.
Fügen Sie einen ML Aceton hinzu. Vortex. Zentrifuge bei 15.000 U/min für fünf Minuten. Entsorgen Sie einen ml des Überstandes.
Fügen Sie einen ML Aceton hinzu. Vortex. Zentrifuge bei 15.000 U/min für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand vollständig.
Fügen Sie einen ML Aceton hinzu. Vortex. Zentrifuge bei 15.000 U/min für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand.
Trocknen Sie bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nach einer eintägigen Inkubation in ein Rack übertragen. Fügen Sie ein ml 67%Schwefelsäure hinzu. Vortex.
Bei 25 Grad Celsius eine Stunde bei gleichzeitigem Schütteln inkubieren. Stellen Sie nach einer Einstündigen Inkubation sicher, dass das Pellet vollständig aufgelöst ist. Transfer in ein Rack.
Dies ist der letzte Schritt der Zelluloseextraktion. Nun sind die Proben zur Probenverdünnung bereit. Für die Probenverdünnung 10 Mikroliter jeder Probe aus dem vorherigen Schritt verwenden und 490 Mikroliter steriles Wasser hinzufügen.
Wiederholen Sie dies für alle experimentellen Proben. Für die Glukose-Standardkurvenzubereitung einen frischen Vorrat von einem mg pro ml Glukose zubereiten und null Mikrogramm auf 200 Mikrogramm Konzentrationen vorbereiten, indem man ein mg pro ml Glukose in 20 Mikroliter-Schritten hinzufügt und das Endvolumen zu einem ml mit sterilem Wasser zusammenstellt. Nehmen Sie 500 Mikroliter von jedem vorbereiteten Standard in einem Schraubverschlussrohr und fügen Sie eine ml 0,2%anthron.
Und jetzt sind die Proben bereit für den Anthron-Assay. Fügen Sie einen ml frisch zubereiteten Anthron. Mischen Sie sofort durch Wirbeln und auf Eis übertragen.
Wiederholen Sie dies für alle Standards und Beispiele auf die gleiche Weise. Dann in einen vorgeheizten 100 Grad Celsius Block für 10 Minuten übertragen. Nach 10 Minuten Inkubation auf Eis übertragen und fünf Minuten auf Eis brüten.
Nach der Inkubation nehmen Sie 200 Mikroliter jeder Probe in drei Replikationen. Wiederholen Sie dies sowohl für Standards als auch für Beispiele auf die gleiche Weise. Und eine geladene 96-Well-Platte wurde in einen Multimode-Detektor geladen.
Mit dem Smart Max Pro-Programm stellen wir die Filtereinstellung auf 620 Nanometer ein. Plattentyp bis 96-Well-Typ. Wählen Sie den gesamten Lesebereich aus.
Klicken Sie auf OK. Lesen. Leseplatte. Sie erhalten die Absorptionswerte sowohl von Standards als auch von Proben, die im Excel-Blatt zur weiteren Analyse und Abschätzung des Zellulosegehalts gesammelt werden.
Die Glukose-Standardkurve wird unter Verwendung der Glukosekonzentrationen in Mikrogramm pro ml auf der x-Achse und der normalisierten Absorptionswerte der jeweiligen Konzentration bei 620 Nanometern auf der y-Achse hergestellt. Wir erhalten die Regressionslinie mit m- und c-Werten im geplotteten Streudiagramm, das wir verwenden, um den gehaltalen Zellulosegehalt der Probe zu schätzen. Im ersten Schritt haben wir die OD-Werte auf 620 Nanometer gemittelt.
Und dann normalisierten wir die Daten, indem wir den leeren Wert subtrahierten. Wir berechnen die Glukosekonzentration mit der Formel x ist gleich OD minus c/m, wo wir c und m Werte aus dem vorherigen Schritt der Regressionslinie in der Standardkurve einstecken. Da das Gesamtvolumen, das für den Anthrontest verwendet wurde, 500 Mikroliter beträgt, teilen wir es durch Verdünnungsfaktor zwei.
Da das verwendete Probenvolumen nur 10 Mikroliter betrug, werden wir weiter um 10 dividieren, um Mikrogramm pro Mikroliter Glukosekonzentration zu erhalten, die mg pro ml Konzentration entspricht. Und dann haben wir den Feuchtigkeitsfaktor 1.11 verwendet, der der Feuchtigkeitsgewinn im Prozess ist. Und schließlich berechnen wir den prozentualen kristallinen Zellulosegehalt, indem wir ihn mit dem Zellwandgewicht dividieren, das nahe fünf mg beträgt, und multiplizieren mit 100, um den Prozentsatz zu erhalten.
Dann haben wir den kristallinen Zellulosegehalt von drei biologischen Replikationen gemittelt, um den Wert für einzelne Proben zu erhalten, der mit einem anderen experimentellen Liniendurchschnitt von drei biologischen Replikationen verglichen wird. Und t-test kann verwendet werden, um ihre Signifikanz zu testen. Hier in Tabelle A zeigen wir die Tabellenwerte der Konzentration und der jeweiligen OD bei 620 Nanometern, die weiter verwendet wurden, um ein Streudiagramm und eine Regressionslinie mit den m- und c-Werten darzustellen, die im C zur Erlangung der Zellulosegehaltsunterschiede zwischen den beiden Versuchslinien verwendet wurden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass beide Proben Zelluloseunterschiede aufweisen. Danke fürs Zuschauen.
