Diese Arbeit wurde von der USDA National Institute of Food and Agriculture, Landwirtschaft und Nahrungsmittelforschung Initiative 2010-65108 Zuschuss finanziert - 20582 zu KMJ Wir danken Brian K. Washburn für kritische Durchsicht des Manuskripts.

Ausführen der Schritte 1, 2, 4 und 6 in einem sterilen Abzug mit laminarer Strömung wird empfohlen. 1. Vorbereitung von M. truncatula A17 Sämlinge Hinweis: M. truncatula A17 Samen in diesen Studien verwendet werden unter Gewächshausbedingungen gekühlt bei ~ 22 ° C, oder in einem Pflanzenwachstumsraum bei 22-26 ° C mit ~ 150-400 mmol / m -2 s -1 Licht gehalten hergestellt. <ol><li> Gießen Sie die Keimung der Samen Platten: Mit 100 mm quadratische Platten (15 mm tief) und gießen autoklaviert 1,1-1,2% w / v Agar-10 bis zu einer Tiefe von 3-5 mm gereinigt. Jede Platte wird verwendet, um ~ 0,25 bis 0,5 g Samen (entspricht 63 bis 125 Samen / Platte) keimen werden. Hinweis: Es ist wichtig, Pflanzenzellkultur-geprüft, gereinigt Agar für alle in diesem Protokoll beschriebenen Platten zu verwenden. Der Verkäufer und Katalognummer Informationen für den Agar ist in der Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräten angegeben. </li><li> Scarify / sterilisieren M. truncatula A17 Saatguts: Wiege ausreichend Samen für die gewünschte Anzahl von Keimlingen. (M. truncatula A17 Samen ~ 4 mg) Platz Samen in sterile 125 ml-Kolben mit einer sterilen Folienabdeckung (0,25-0,5 g Samen / Kolben; dies ~ 63-125 Samen) und Pipette 20 ml konzentrierter (96%) H 2 SO 4 an den Seiten des Kolbens. Hinweis: Säure Skarifikation werden die Samen zu sterilisieren. Auch durch Pipettieren der Säure entlang der Seiten des Kolbens, wird es erneut sterilisieren das Innere des Kolbens, die in Kontakt mit den nicht sterilisierten Samen gekommen ist. </li><li> Break up Klumpen von Saatgut mit einem sterilen Glaspipette. Der Kolben schwenken häufig für 10-12 min. Klein, braun Gruben werden auf die Samen sichtbar. Dies sind winzige Löcher in der Samenschale 11. Hinweis: Tragen Sie einen Augenschutz und Handschuhe bei der Arbeit mit konzentrierter H 2 SO 4. </li><li> Entfernen H 2 SO 4 und spülen Samen: Wenn mindestens 10% der Samen haben kleine braune Gruben, oder 12 Minuten vergangen sind, je nachdem, welcherzuerst kommt, entfernen Sie alle Säure aus den Kolben mit einem sterilen Glaspipette. (Ort Abfallsäure in eine 1-2 L Becherglas mit mindestens 300 ml Leitungswasser. Dadurch wird die Säure zu verdünnen und eine Überhitzung zu vermeiden.) Neigen Sie den Kolben, um die verbleibende Säure in der Kurve der Flasche sammeln und mit einem kleinen Glaspipette auf entfernen Sie alle verbleibenden Säure. Wenn Restsäure bleibt, wird es mit dem Spülwasser reagieren, heizen die Samen und sie töten. <ol><li> Spülen von Samen schnell Gießen 100 ml sterile Reinstwasser in jeden Kolben. Die überschüssige Menge Wasser wird die Säure verdünnt und während der Reaktion der Säure mit dem Wasser Überhitzung und Saatgut Schäden zu vermeiden. Gießen Sie das Wasser ab und Flamme sterilisieren die Lippe der Flasche. </li><li> Spülen Samen 8-10x mit 50 ml sterilem Reinstwasser. Schwenken Sie die Flasche bei jeder Spülung. Der Kolben ist an dieser Stelle als steril zu betrachten und die Lippe der Flasche sollte vor jeder Spülung geflammt werden. </li></ol></li><li> Lassen Samen trinken über Nacht: Nach derletzten Spülgang, gießen Sie 50 ml sterile Reinstwasser in jeden Kolben, ersetzen Sie die sterile Folienabdeckung auf jeder Flasche und bei 4 ° C über Nacht im Dunkeln. </li><li> Platz Samen auf die Keimung Platte: Nach dem Lösen Samen über Nacht trinken, Wasser abgießen, spülen 2x mit ~ 25 ml ultrareines Wasser, dann mit 20 ml sterilem Reinstwasser, Wirbel um Samen zu suspendieren und gießen Sie sie auf eine 1,1-1,2% Agar Keimung Platte aus Schritt 1.1. Wenn Samen in der Flasche bleiben, fügen Sie mehr Wasser und wieder zu gießen. Verteilen Sie die Samen von jeder Flasche eine Platte (63 bis 125 Samen / Platte). <ol><li> Schwenken Sie die Platte, um die Samen zu verteilen. Die Samen sollten gleichmäßig in einer 4-5 cm-Band an einem Ende der Platte verteilt werden. Dies wird die &quot;top&quot; der Platte sein. Der &quot;Boden&quot; 5-6 cm sollte frei von Samen (2A) gehalten werden. </li><li> Zeichnen Sie das Wasser mit einer sterilen Pipette. Kippen die Platte in einem 45 °-Winkel zu den verbleibenden Wasserablauf an der Unterseite der Platte lassen. Setzen Sie den Deckel auf der tilted Platte und vor Licht schützen. Die Platten sollten auf 10-20 min ablaufen gelassen werden. (2B). </li></ol></li><li> Richten Sie Keimung: Entfernen Sie alle Wasser, das an der Unterseite des geneigten Platte mit einer sterilen Pipette gesammelt hat. <ol><li> Setzen Sie den Deckel und verschließen Sie die Platte mit Parafilm. Handschuhe und steril zu halten (Abbildung 2C). </li><li> Stapeln Sie die Keimung Platten und dann wieder alle von ihnen bis zu einem Winkel von 90 °. Die Samen werden auf der vertikalen Oberfläche des Agars zu liegen. Voll eingesogen Samen sollten einfach auf die Agar haften. Die Wurzeln werden nach unten wachsen (Abbildung 2D). </li><li> Wickeln Sie die Stapel von Keimen Platten in Folie, um Licht zu blockieren und halten bei 25 ° C für 3 Tage. </li></ol></li></ol> Hinweis: Wenn die Keimung Erlös für weniger als 3 Tagen kann Wurzeln zu kurz, um den Agar in Mikrokosmen zu erreichen. Wenn Keimung geht mehr als 4 Tage vor der Übertragung auf Mikrokosmos Platten, Überleben von Keimlingen werdenarm sein. Wenn M. verglichen werden truncatula Ökotypen oder Mutanten mit langsameren Keimraten sind, sollte die langsam keimenden Ökotyp dürfen länger als 3 Tage, um zu keimen. 2. Vorbereitung der einzelnen Platten Mikrokosmen <ol><li> Bereiten Jensen-Medium 12 (siehe Tabelle 1 für Komposition), so dass ~ 70 ml Medium für jeden Mikrokosmos. Bereiten Sie in Krüge oder Flaschen, die sind praktisch für schnelle Gießen (nicht mehr als 1-2 l pro Krug) und hinterlassen einen magnetischen Rührstab in den Krug beim Autoklavieren. <ol><li> Nach Medium gekühlt, um ~ 55-65 ° C, Ergänzungen hinzugefügt wurden, und pH-Wert überprüft (siehe Tabelle 1), gießen in Runde 100 mm Durchmesser, 15 mm tiefe Teller. Die Platten sollten gegossen werden ~ 0,9-1 cm tief (~ 70 ml / Platte). </li><li> Komponenten der Jensen-Medium kann eine trübe Niederschlag zu bilden, so ist es wichtig, den Krug auf den Magnetrührplatte regelmäßig zurück, um Komponenten aus Absetzen zu verhindern. Niederschläge können überIVK in der Platte, nachdem sie zu verfestigen, und müssen sich nicht auf die Leistung, solange sie gleichmäßig auf die Platten verteilt sind. </li><li> Stapel Platten während des Gießens, um die Bildung von Kondenswasser auf den Plattendeckel zu verhindern. </li></ol></li><li> Nach Jensen Platten erstarrt, Kerbe beide Platten und Deckeln mit einem Gewicht von Spatel, der in eine U-Form 5 (Fig. 3A) gebogen worden ist. Erhitzen Sie die Biegung der Spatel mit einem Brenner, bis Red Hot, Kerb 5-6 Platten und dann wieder erwärmen. Wenn die Kerb Deckel auf dem Kerbplatte gelegt, wird dies eine ovale Portal, über das die Aufnahmen der Sämling wachsen (3B) erstellen. Wenn gekerbten Platten gespeichert werden sollen, einzeln zu wickeln mit Paraffinfilm .. </li></ol> 3. Vorbereitung der Kulturen Sinorhizobium meliloti Zwei Tage vor Pflanzen Impfungen, starten Kulturen aller S. meliloti-Stämme auf Sämlingen inokuliert werden. Cultures sollte LBMC (Luria-Bertani [Miller])-Medium mit 13 2,5 mM MgSO 4, 2,5 mM CaCl 2 und entsprechenden Antibiotika (TY-Medium funktioniert auch gut), gezüchtet werden. So wenig wie 2-3 ml jeder Kultur wird ausreichend sein. <ol><li> Wachsen bei 30 ° C unter Schütteln für 2 Tage, bis die Zellen dicht sind. </li><li> Für die meisten Pflanzen Impfungen, der Wachstumsphase des S. meliloti ist nicht kritisch. Typischerweise spät angemeldet oder frühen stationären Phase-Zellen verwendet werden. </li></ol> 4. Aufbahrung M. truncatula Sämlinge zu einzelnen Mikrokosmen <ol><li> Nach 3 Tagen, öffnen Sie eine Keimplatte (in Schritt 1) ​​hergestellt und sofort mit sterilem Reinstwasser fluten. Dip-Zange in Ethanol und Flamme kurz zu sterilisieren. Verwenden sterilen Pinzette vorsichtig schieben die Wurzelspitzen aller Sämlinge unter dem Wasser um ein Austrocknen zu verhindern. Wurzeln werden 2-6 cm lang reichen. Die Mehrheit wird 3-4 cm sein. Wählen Sämlinge mit geraden Wurzeln und ohne erkennbareDefekte. </li><li> Überprüfen Sie die Deckel der mittel Mikrokosmen der Jensen für den Aufbau von Kondensation. Streichen Sie den Deckel, um die Kondensation zu entfernen oder ersetzen sie durch eine neue Kerb Deckel. Wenn es einen Überschuss von Kondensation am Deckel kann der Sämling Wurzel an dem Deckel haftet und dann sterben nach der Kondensation trocknet. </li><li> Mit Hilfe der Pinzette vorsichtig wählen Sie einen Sämling von der Keimung Platte durch den Keimblättern und legen den Root auf mittlere Mikrokosmos eines Jensen. Stellen Sie sicher, dass die Wurzelspitze in Kontakt mit dem Agar. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Samenschale, wenn sie noch vorhanden ist. Die Samenschalen sollten nach dem Einweichen in Wasser für 5-10 Minuten locker sein. Necken Sie vorsichtig die Samenschale mit der Zange, bis es nachgibt, und entsorgen. Die Keimblätter und etwa 0,5 cm von Aufnahmen sollten aus dem U-Kerbe in der Platte (4A) vorstehen. Den Deckel der Platte vorsichtig wieder mit der U-Kerbe der Deckel über den Keimling, die Schaffung eines Portals für den Keimling (4B).Stellen Platten in horizontaler Stapel beiseite, bis alle Sämlinge auf Mikrokosmen gelegt. </li><li> Nutzen Sie alle Sämlinge von jeder Platte, die Keimung lebensfähig aussehen und haben einen geraden Stamm. (Wenn möglich, lassen Sie eine Platte von Sämlingen ungeöffnet als Ersatz für verwelkten Sämlinge kurz vor der Impfung zu verwenden.) </li><li> Nach dem Verlegen Sie alle Sämlinge, damit sie auf der horizontalen Jensen Mikrokosmen zu sitzen, während die S. meliloti Inokulum Suspensionen sind in Vorbereitung. </li></ol> 5. Vorbereitung von S. meliloti Inokulum Suspensionen <ol><li> Überprüfen S. meliloti-Kulturen in regelmäßigen Abständen nach der Impfung sicher sein, dass sie wachsen. Nach 2 Tagen Wachstum sollte die OD600 zwischen 2 und 4 liegen. </li><li> Pipette 0,5 ml jeder Kultur in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen und Zentrifuge pelletieren. Überstand entfernen. </li><li> Entweder in 0,85% NaCl oder sterile sterile Reinstwasser Waschen der Zellen zweimal. Die Zellen in 0,5 ml 0,85% steärgern NaCl oder Reinstwasser. </li><li> Messung der OD 600 von einer 1/10 Verdünnung von S. resuspendiert meliloti-Kulturen aus Schritt 5.3. Auf Basis dieser Messwert, machen eine Suspension von jeder Kultur in sterilem Reinstwasser bei OD 600 = 0,05. Wenn die Zelldichte zu hoch ist, kann die Knöllchenbildung gehemmt werden. Machen Sie genug von der verdünnten Suspension, so dass 100 ul kann auf jede Sämling geimpft werden. Die Trübung der OD 600 = 0,05 Suspension sollte mit dem Auge gerade noch wahrnehmbar sein. </li></ol> 6. Inokulation und Abdichtung von Mikrokosmen <ol><li> Unmittelbar vor Beginn der Impfungen, überprüfen verwelkten Sämlinge, die nicht den Transfer zum Medium Mikrokosmen der Jensen überlebt haben. Ersetzen Sie diese mit frischen Setzlinge Setzlinge von der Keimung Platten. </li><li> Öffnen Sie jeden Mikrokosmos und impfen 100 ul der entsprechenden S. meliloti-Suspension auf die Keimlingswurzel. Setzen Sie den Deckel und beiseite in horizontaler stacks von 6-10 Mikrokosmos. Für jede S. meliloti Stamm verglichen werden, zu inokulieren mindestens 15 Pflanzen. Für Stämme, die feinen Unterschiede in symbiotische Produktivität, impfen 30-35 Pflanzen. Lassen Sie mindestens 10 Pflanzen als Negativkontrolle unbeimpfte. Impfen 30-35 Pflanzen mit S. meliloti 1021 oder andere geeignete Wildtyp-Stammes, die als Positivkontrolle dienen. </li><li> Nachdem der S. meliloti Suspension Zeit zu adsorbieren auf der Wurzeloberfläche hatte und die Suspension Flüssigkeit in das Agar (mindestens 20 min.) eingeweicht, wickeln jede Platte individuell mit Paraffinfilm. Platten sollten an den Rand der Kerbe gewickelt werden, aber die Paraffinfilm sollte nicht das Wachstum des Keimlings (4C) zu blockieren. </li><li> Zum Zeitpunkt der Verpackung, eine abschließende Überprüfung zum Wurzeln in das Innere des Deckelplatte geklebt. Halten Wurzeln aus dem Deckel entfernen, lag die Platte flach auf der Bank und tippen Sie auf oder blättern Sie den Deckel, um die Wurzel wieder nach unten auf die Agar-su klopfenn-Schnittstelle. </li><li> Richten Sie die Sämling-Portale der einzelnen Stapel von 6-10 Platten. Lag die Stapel in einem 90 ° Winkel mit der nach oben weisenden Sämlingen (Fig. 4D). Die Klebrigkeit der Paraffinfilm werden die Platten an Ort und Stelle lange genug, um den gesamten Stapel in Folie wickeln zu halten, so dass ein 1-2 cm breiter Streifen ausgepackt, wo die Keimlinge entstehen (4E). Die Folie wird die Wurzeln vor Licht zu schützen. </li><li> Legen Sie die Folie verpackten Stapeln in einem beleuchteten Wachstumskammer oder Wachstums Zimmer zu 21-25 ° C, 60-70% relativer Luftfeuchtigkeit und 100-175 mmol / m -2 s -1 Licht auf einem 16 Stunden Licht / 8 h Dunkel-Zyklus ( Abbildung 1a). Unter diesen Wachstumsbedingungen, verlängerte Inkubation bei Lichtstärken von mehr als 200 mmol / m -2 s -1 kann eine nachteilige Wirkung auf das Pflanzenwachstum haben. </li></ol> 7. Die Untersuchung der Wurzelsysteme und Quantifizierung der Symbiose Phänotypen Pflanzen können in halten werdenMikrokosmen für bis zu 9 Wochen. <ol><li> Knoten-Nummer kann bei einer Reihe von Zeitpunkten nach dem Entfernen der Folie von jedem Stapel und Zählen Knoten quantifiziert werden. Entwicklung von Knötchen auf Pflanzen mit S. geimpft meliloti 1021-Wildtyp sind von 10 bis 14 Tage nach der Impfung deutlich. </li><li> Symbiotische Produktivität kann auch zu jedem Zeitpunkt durch Messen der Länge der entstehenden Aufnahmen gemessen werden. </li><li> Schluss Quantifizierung der symbiotischen Produktivität ist in der Regel mit 7 Wochen nach Inokulation durch Abnehmen des Shooting und Messung der Frischgewicht des Shootings durchgeführt. Dieser Schritt kann so spät zu 9 Wochen, wenn mehr Wachstum erwünscht ist, durchgeführt werden. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es gibt mehrere Schritte des Protokolls, die kritisch für den Erfolg sind: 1) die Notwendigkeit der Verwendung von gereinigtem, Pflanzenzellkultur getestet Agar kann nicht überbetont werden. Dies ist nicht kritisch für Alfalfa Keimlingen, aber es kritisch für das Wachstum von M. ist truncatula A17. 2) Es ist wichtig, um Setzlinge auf vertikalen Agarplatten keimen wie in Schritt 1 beschrieben. Die weit verbreitete Technik der keimenden Sämlinge auf einem invertierten horizontalen Fläche in einer 1...

Die Interaktion zwischen der Hülsenfrüchte Wirtspflanze Medicago truncatula A17 und dem Bakterium rhizobial Sinorhizobium meliloti 1021 ist eine der am meisten gefügig Modellsysteme für die Untersuchung von Knöllchenentwicklung und Stickstoff-fixierenden Symbiose. Die Genome der beiden Symbiosepartnern wurden sequenziert 1,2 und sowohl Pflanzen-und Bakterium sind zugänglich für genetische Manipulation 3,4. Analyse der Phänotypen von sowohl pflanzlichen und bakteriellen Mutanten erfordert die Fähigkeit, die Stufen des Knotens Entwicklung zu beobachten und die symbiotische Produktivität über die Zeit quantifiziert. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Beobachtung der Knöllchen Entwicklung M. truncatula cv. Jemalong A17 mit S. geimpft meliloti 1021 innerhalb der einzelnen Mikrokosmen von Standard, rund 100 mm Durchmesser, 15 mm tief Laborplatten (1A) gemacht. Das Shooting wird durch eine Kerböffnung an der Seite der Platte (ausgesetzt und wächst Figurn 1B, 1C und 1E). Wurzeln in den Mikrokosmen enthalten und steril gehalten, während eine Beobachtung durch den Deckel der Platte (Fig. 1D). Da die Aufnahmen zugänglich ist, wird sein Wachstum nicht eingeschränkt und es können in periodischen Zeitabständen, ohne die Sterilität des Wurzel gemessen werden. Das Verfahren zum Erzeugen von Kerbplatte Mikrokosmen wurde ursprünglich von Leigh et al. 5 für wachsende Alfalfa-Pflanzen entwickelten, aber es war nicht weit trotz seiner vielen Vorteile gegenüber anderen Verfahren angewandt. Eine Variante dieses Verfahrens wurde auch für die Analyse der Wechselwirkung zwischen Pflanzenwurzeln und Mykorrhiza 6 entwickelt. Wir haben nun eingerichtet und für das Wachstum von M. optimiert dieses Verfahren truncatula Pflanzen. Die Vorteile dieses Protokolls über häufigsten verwendeten Verfahren sind nachstehend beschrieben. Es gibt mehrere Methoden, die derzeit im breiten Einsatz für Knöllchen Studien von M. truncatula inokuliertlated mit S. meliloti 7. Das am häufigsten verwendete Verfahren für die großtechnische Herstellung von knotige Wurzeln ist das Wachstum in aeroponischen Senkkästen 7. Bei diesem Verfahren werden die Pflanzen in einem großen Gefäß suspendiert und Wurzeln werden mit einer Mischung aus S. belüftet meliloti-und Nährstofflösung 7. Diese Methode ist praktisch, wenn nur ein Genotyp von S. meliloti getestet werden. Da es Aerosolisierung von hohen Konzentrationen von Bakterien erfordert, gibt es eine hohe Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination zwischen den Kästen mit verschiedenen Bakterienstämmen beimpft. Ein weiteres Verfahren, das oft verwendet wird, um große Mengen von inokulierten Pflanzen herzustellen, ist das Wachstum in Kübeln oder Töpfen, Perlit, Vermiculit, Sand oder calcinierten Ton, die mit Nährstofflösung infundiert werden und mit S. inokuliert meliloti 7. Diese Methode erfordert die Verwendung von offenen Kübeln oder Töpfen und erfordert Bewässerung und die Wiederauffüllung der Nährlösung. Ein weiterer Nachteil ist, dass Pflanzen Töpfemuss dieses teilchenförmige Matrix zur Prüfung der Wurzeln und Knollen entfernt werden. Ein weiterer Nachteil dieser Methode ist, dass ein großer Bereich der Inkubator Platz benötigt, wenn viele verschiedene S. meliloti Genotypen zu vergleichen sind, weil ein separater Topf muss für jeden Bakterien Genotyp verwendet werden. Die &quot;Leonard jar&quot; ist eine Variante dieser Methode 8,9. Ein Leonard Glas besteht aus zwei sterilisierte Gefäße übereinander gestapelt der anderen und durch einen Docht verbunden sind. Wachstumsmedium ist in dem unteren Gefäß gegeben und durch den Docht durch Kapillarwirkung in eine Wachstumsmatrix von Perlit, Vermiculit, Sand oder calcinierten Ton im oberen Gefäß gezogen. Der Keimling (s) in der Wachstumsmatrix eingebracht und mit S. inokuliert meliloti. Dieses Verfahren erfordert keine Bewässerung, aber Prüfung der Wurzeln und Knollen erfordert, dass der Keimling aus dem teilchenförmigen Wachstumsmatrix entfernt werden. Es gibt mehrere Methoden, die einfach nicht zulassen Prüfung roots. Eine davon ist die transparente Kunststoff &quot;Wachstumsbeutel&quot; 7. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, dass häufige Bewässerung da nur ≤ 10 ml flüssiges Medium ist optimal für wachsende M. erforderlich truncatula in Beuteln 7. Pouch Experimente sind in der Regel auch nach ~ 2 Wochen 7 begrenzt, bedingt durch den Zerfall des Papiers Docht in dem Beutel. Zwei weitere Methoden, die üblicherweise verwendet werden, sind ähnlich unserer Verfahren, daß die Pflanzen auf Agarplatten gezüchtet und die Wurzeln sichtbar sind, aber diese Verfahren weisen Nachteile auf, die unserem Verfahren vermeidet. Bei diesen Verfahren werden die Pflanzen vollständig in 24,5 cm x 24,5 cm Agar-Platten um die Spitze mit porösen chirurgischen Band versiegelt oder in Agar-Schrägröhrchen mit Baumwolle Topfen oder Kunststoffkappen verschlossen gewachsen 7 enthalten. Beide Methoden ermöglichen eine einfache Prüfung der Wurzeln und steril gehalten werden. Jedoch werden die Agar-Schrägröhrchen in der Regel mit 20 ml Agarmedium gewachsen 7 und erfordern eine Bewässerung und Nährstoffddition für langfristige Wachstum der Pflanzen. Pflanzen innerhalb der 24,5 cm x 24,5 cm gewachsen Agar-Platte Mikrokosmen ausreichend Feuchtigkeit und Nährstoffe, die für langfristiges Wachstum, aber die wachsende Shooting wird schnell in die geschlossene Platte Mikrokosmos und Ethylengas aufbauen kann Hemmung Nodulation 7 eingeschränkt. In dem hier beschriebenen Verfahren wird der Shooting ausgesetzt und wächst frei außerhalb des Mikrokosmos, der ~ enthält 70 ml Medium, so dass langfristige Wachstum. Das hier beschriebene Verfahren kann nicht nur für die Untersuchung der Nodulation von Hülsenfruchtpflanzen, aber auch für die Untersuchung der Wurzel Phänotypen anderen mittelgroßen Anlagen nützlich sein. Der Unterschied zwischen diesen Mikrokosmen und einem traditionellen Polycarbonat Pflanzengewebe-Kulturgefäß ist, dass Wurzeln in den hier beschriebenen Platten Mikrokosmen wachsen auf der vertikalen Oberfläche des Agars anstatt nach unten in eine horizontale Schicht aus Agar am Boden des Glases. Dies ermöglicht die Wurzel aus der Agar-Oberfläche mit minimaler d angehoben werdenAmage Wurzelhaare und minimale Haftung Agar zu der Wurzeloberfläche, der die Prüfung der Wurzelhaare durch Mikroskopie ermöglicht.

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		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agar purified, plant cell culture-tested</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7921</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

single-plant, sterile microcosms for nodulation and growth of the legume plant medicago truncatula with the rhizobial symbiont sinorhizobium meliloti

Rhizobia Bakterien bilden symbiotische, Stickstoff-fixierende Knöllchen an den Wurzeln der Leguminosen-kompatible Host-Pflanzen. Einer der gut entwickelten Modellsysteme für die Untersuchung dieser Wechselwirkungen ist die Pflanze Medicago truncatula cv. Jemalong A17 und die rhizobial Bakterium Sinorhizobium meliloti 1021. Wiederholte Bildgebung von Pflanzenwurzeln und Scoring von symbiotischen Phänotypen erfordert Methoden, die nicht-destruktive entweder Pflanzen oder Bakterien sind. Die symbiotische Phänotypen von einigen pflanzlichen und bakteriellen Mutanten offensichtlich nach relativ kurzer Perioden des Wachstums und haben langfristige Beobachtung der Wirt / Symbionten Interaktion erfordert. , Feine Unterschiede in der Effizienz und symbiotische Knoten Seneszenz Phänotypen, die in den frühen Stadien der Knöllchen Verfahren ersichtlich sind, erfordern jedoch relativ lange Wachstumsperioden, bevor sie bewertet werden können. Mehrere Verfahren wurden für langfristiges Wachstum und Beobachtung dieser Wirt / Symbionten Paar entwickelt.Viele dieser Verfahren erfordern jedoch wiederholt Wässern, die die Möglichkeit der Verunreinigung durch andere Mikroorganismen erhöht. Andere Verfahren erfordern einen relativ großen Raum für das Wachstum einer großen Zahl von Pflanzen. Die hier beschriebene Methode, symbiotische Wachstum von M. truncatula / S. meliloti in sterilen Einweg-Anlage in Mikrokosmen, hat mehrere Vorteile. Pflanzen in diesen Mikrokosmen ausreichend Feuchtigkeit und Nährstoffe, um sicherzustellen, dass die Bewässerung nicht bis zu 9 Wochen erforderlich, eine Kreuzkontamination verhindert wird beim Gießen. Dies ermöglicht Phänotypen zu quantifizieren, die in kurzfristigen Wachstumssysteme, wie subtile Verzögerungen bei der Entwicklung und Knötchen Knötchen frühen Seneszenz verpasst werden könnte. Auch werden die Wurzeln und Knollen im Mikro leicht durch die Deckelplatte betrachtet, so up-Verwurzelung der Pflanzen für die Beobachtung ist nicht erforderlich.

Die Herstellung und die Impfung von diesen Mikrokosmen Platte ist relativ einfach im Vergleich zu den meisten anderen in der Einleitung beschrieben sind. Die Verwendung dieser Mikrokosmos ermöglicht auch längere Pflanzenwachstum (bis zu 9 Wochen) ohne Wasser-oder Nährstoffergänzung, Pflege von Stamm Sterilität, sowohl einfache Prüfung der Wurzeln und der Schutz der Wurzeln vor Licht, ungezwungen Wachstum von Pflanzen schießt, einfachen Zugang zu den Dreharbeiten für Längenmessung und Entfernen von Pflanzen aus ...

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Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Wachstum von Medicago truncatula Pflanzen in Symbiose mit der Stickstoff-fixierenden Bakterien Sinorhizobium meliloti einzeln steril Mikrokosmen von Standard-Laborplatten ermöglicht häufige Prüfung der Wurzelsysteme und Knötchen, ohne Sterilität. Pflanzen in den Wachstumskammern für bis zu 9 Wochen aufrechterhalten werden.

Einzel-Anlage, steril Mikrokosmen für Knöllchenbildung und des Wachstums der Pflanze Hülsenfrucht<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Mit dem Rhizobia Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Rhizobial  bacteria form symbiotic, nitrogen-fixing nodules on the roots of compatible host  legume plants.  One  of the most well-developed model systems ...

single-plant-sterile-microcosms-for-nodulation-growth-legume-plant

Research

JoVE Journal

Environment

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

16.9K Aufrufe.  Florida State University.  Wachstum von Medicago truncatula Pflanzen in Symbiose mit der Stickstoff-fixierenden Bakterien Sinorhizobium meliloti einzeln steril Mikrokosmen von Standard-Laborplatten ermöglicht häufige Prüfung der Wurzelsysteme und Knötchen, ohne Sterilität. Pflanzen in den Wachstumskammern für bis zu 9 Wochen aufrechterhalten werden. 

Serie: Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high quality paper. Black liquor is a pulping waste generated by the kraft process that has potential for downstream bioconversion. However, the recalcitrant nature of the lignocellulose resources, its chemical derivatives that constitute the majority of available organic carbon within black liquor, and its basic pH present challenges to microbial biodegradation of this waste material. Methods for the collection and modification of black liquor for microbial growth are aimed at utilization of this pulp waste to convert the lignin, organic acids, and polysaccharide degradation byproducts into valuable chemicals. The lignocellulose extraction techniques presented provide a reproducible method for preparation of lignocellulose growth substrates for understanding metabolic capacities of cultured microorganisms. Use of gas chromatography-mass spectrometry enables the identification and quantification of the fermentation products resulting from the growth of microorganisms on pulping waste. These methods when used together can facilitate the determination of the metabolic activity of microorganisms with potential to produce fermentation products that would provide greater value to the pulping system and reduce effluent waste, thereby increasing potential paper milling profits and offering additional uses for black liquor.

Industrial wastes can be collected and modified to analyze microbial growth. Lignocellulose extraction techniques provide components to analyze specific biodegradation ability. Gas chromatography-mass spectrometry identifies fermentation products of microorganisms grown on pulping waste. These methods determine the metabolic capacity of microorganisms to degrade pulping waste.

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

Forschung

Umwelt

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

Transcript und Metabolite Profiling für die Beurteilung von Tabakbaum und Pappel als Rohstoff für die Bio-basierte Industrie

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

Die Verwendung von hochauflösenden Infrarot-Thermografie (HRIT) für das Studium der Ice Ice Keimbildung und Ausbreitung in Pflanzen

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of electrical transmission between distant cells in an organism requires in vivo, artifact-free recordings of cells embedded within their native environment. The transmission of electrical signals from wounded to unwounded areas in a plant has since long piqued the interest of botanists. The phloem, the living part of the plant vasculature that is spread throughout the plant, has been postulated as a major tissue in electrical transmission in plants. The lack of suitable electrophysiological methods poses many challenges for the study of the electrical properties of the phloem cells in vivo. Here we present a novel approach for intracellular electrophysiology of sieve elements (SEs) that uses living aphids, or other phloem-feeding hemipteran insects, integrated in the electrical penetration graph (EPG) circuit. The versatility, robustness, and accuracy of this method made it possible to record and study in detail the wound-induced electrical signals in SEs of central veins of the model plant Arabidopsis thaliana1. Here we show that EPG-electrodes can be easily implemented for intracellular electrophysiological recordings of SEs in marginal veins, as well as to study the capacity of SEs to respond with electrical signals to several external stimuli. The EPG approach applied to intracellular electrophysiology of SEs can be implemented to a wide variety of plant species, in a large number of plant/insect combinations, and for many research aims.

A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.

Eine neue Anwendung der Electrical Penetration Graph (EPG) zur Erfassung und Messung elektrischer Signale in Phloem Siebelemente

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a series of incubators. A temperature gradient is passively established across the surface of the table between the heated and cooled ends and is lost quickly at distances above the surface. Since temperature is only controlled on the table surface, experiments are restricted to shallow containers, such as Petri dishes, placed on the table. Welding continuous aluminum vertical strips or gussets perpendicular to the surface of a table enables temperature control in depth via convective heat flow. Soil in the channels between gussets was maintained across a gradient of temperatures allowing a greater diversity of experimentation. The gusseted design was evaluated by germinating oat, lettuce, tomato, and melon seeds. Soil temperatures were monitored using individual, battery-powered dataloggers positioned across the table. LED lights installed in the lids or along the sides of the gradient table create a controlled temperature chamber where seedlings can be grown over a range of temperatures. The gusseted design enabled accurate determination of optimum temperatures for fastest germination rate and the highest percentage germination for each species. Germination information from gradient table experiments can help predict seed germination and seedling growth under the adverse soil conditions often encountered during field crop production. Temperature effects on seed germination, seedling growth, and soil ecology can be tested under controlled conditions in a laboratory using a gusseted thermogradient table.

Traditional thermogradient tables create a range of temperatures across the surface. Welding gussets perpendicular to the surface of a thermogradient table will control temperature in depth increasing possible research applications.

Ein Gusseted Thermogradient Tabelle zur Bekämpfung von Bodentemperaturen für das Pflanzenwachstum Beurteilung und Überwachung von Bodenprozessen

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Operation of a 25 KWth Calcium Looping Pilot-plant with High Oxygen Concentrations in the Calciner

Calcium looping (CaL) is a post-combustion CO2 capture technology that is suitable for retrofitting existing power plants. The CaL process uses limestone as a cheap and readily available CO2 sorbent. While the technology has been widely studied, there are a few available options that could be applied to make it more economically viable. One of these is to increase the oxygen concentration in the calciner to reduce or eliminate the amount of recycled gas (CO2, H2O and impurities); therefore, decreasing or removing the energy necessary to heat the recycled gas stream. Moreover, there is a resulting increase in the energy input due to the change in the combustion intensity; this energy is used to enable the endothermic calcination reaction to occur in the absence of recycled flue gases. This paper presents the operation and first results of a CaL pilot plant with 100% oxygen combustion of natural gas in the calciner. The gas coming into the carbonator was a simulated flue gas from a coal-fired power plant or cement industry. Several limestone particle size distributions are also tested to further explore the effect of this parameter on the overall performance of this operating mode. The configuration of the reactor system, the operating procedures, and the results are described in detail in this paper. The reactor showed good hydrodynamic stability and stable CO2 capture, with capture efficiencies of up to 70% with a gas mixture simulating the flue gas of a coal-fired power plant.

Operation of a 25 KWth Calcium Looping Pilot-plant with High Oxygen Concentrations in the Calciner

This manuscript describes a procedure for operating a calcium looping pilot-plant for post-combustion carbon capture with high oxygen concentrations in the calciner in order to reduce or eliminate the flue gas recycle.

Betrieb einer 25 KWth Calcium Looping Pilot-Anlage mit hohen Sauerstoffkonzentrationen in der Calcinator

Calcium looping (CaL) is a post-combustion CO2 capture technology that is suitable for retrofitting existing power plants. The CaL process uses limestone ...

Procedures of Laboratory Fumigation for Pest Control with Nitric Oxide Gas

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on fresh products and procedures for residue analysis and product quality evaluation. An airtight fumigation chamber containing fresh fruit and vegetables is first flushed with nitrogen (N2) to establish an ultralow oxygen (ULO) environment followed by injection of NO. The fumigation chamber is then kept at a low temperature of 2 - 5 &#176;C for a specified time period necessary to kill a target pest to complete a fumigation treatment. At the end of a fumigation treatment, the fumigation chamber is flushed with N2 to dilute NO prior to opening the chamber to ambient air to prevent the reaction between NO and O2, which produces NO2 and may damage delicate fresh products. At different times after NO fumigation, NO2 in headspace and nitrate and nitrite in liquid samples were measured as residues. Product quality was evaluated after 2 weeks of post-treatment cold storage to determine effects of NO fumigation on product quality. Keeping&#160;O2 from reacting with NO is critical to NO fumigation and is an important part of the protocols. Measuring NO levels is challenging and a practical solution is provided. Possible protocol modifications are also suggested for measuring NO levels in the fumigation chambers as well as residues. NO fumigation has the potential to be a practical alternative to methyl bromide fumigation for postharvest pest control on fresh and stored products. This publication is intended to assist other researchers in conducting NO fumigation research for postharvest pest control and accelerating the development of NO fumigation for practical applications.

This paper describes nitric oxide (NO) fumigation protocols for postharvest pest control. Fumigation chambers are flushed with nitrogen (N2) to establish ultralow oxygen conditions before NO is injected. At the end, chambers are flushed with N2 to dilute NO before exposing products to ambient air to prevent exposure to NO2.

Verfahren der Labor-Begasung für die Schädlingsbekämpfung mit Gas Stickstoffmonoxid

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

Die Pflanze-Infektion-Test: Spray und Wunde-vermittelten Inokulation mit Pflanzen Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for assessing plant responses to chemicals and other substances of interest is presented. This system is highly efficient in obtaining homogeneous and healthy seedlings of the C3 and C4 model species Arabidopsis thaliana and Setaria viridis, respectively. The sterile cultivation avoids algae and microorganism contamination, which are known limiting factors for plant normal growth and development in hydroponics. In addition, this system is scalable, enabling the harvest of plant material on a large scale with minor mechanical damage, as well as the harvest of individual parts of a plant if desired. A detailed protocol demonstrating that this system has an easy and low-cost assembly, as it uses pipette racks as the main platform for growing plants, is provided. The feasibility of this system was validated using Arabidopsis seedlings to assess the effect of the drug AZD-8055, a chemical inhibitor of the target of rapamycin (TOR) kinase. TOR inhibition was efficiently detected as early as 30 min after an AZD-8055 treatment in roots and shoots. Furthermore, AZD-8055-treated plants displayed the expected starch-excess phenotype. We proposed this hydroponic system as an ideal method for plant researchers aiming to monitor the action of plant inducers or inhibitors, as well as to assess metabolic fluxes using isotope-labeling compounds which, in general, requires the use of expensive reagents.

A simple, versatile, and low-cost in vitro hydroponic system was successfully optimized, enabling large-scale experiments under sterile conditions. This system facilitates the application of chemicals in a solution and their efficient absorption by roots for molecular, biochemical, and physiological studies.

Eine Flexible Low-Cost-Hydrokultur-System für die Bewertung der Pflanze Antworten auf kleine Moleküle unter sterilen Bedingungen

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

An Optimized Rhizobox Protocol to Visualize Root Growth and Responsiveness to Localized Nutrients

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive harvest or expensive equipment. We present a customizable and affordable rhizobox method that allows the non-destructive visualization of root growth over time and is particularly well-suited to studying root plasticity in response to localized resource patches. The method was validated by assessing maize genotypic variation in plasticity responses to patches containing 15N-labeled legume residue. Methods are described to obtain representative developmental measurements over time, measure root length density in resource-containing and control patches, calculate root growth rates, and determine 15N recovery by plant roots and shoots. Advantages, caveats, and potential future applications of the method are also discussed. Although care must be taken to ensure that experimental conditions do not bias root growth data, the rhizobox protocol presented here yields reliable results if carried out with sufficient attention to detail.

Visualizing and measuring root growth in situ is extremely challenging. We present a customizable rhizobox method to track root development and proliferation over time in response to nutrient enrichment. This method is used to analyze maize genotypic differences in root plasticity in response to an organic nitrogen source.

Eine optimierte Rhizobox-Protokoll zum Wurzelwachstum und Reaktionsfähigkeit auf lokalisierte Nährstoffe zu visualisieren

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive ...