Einzelmolekül-Verweilzeitanalyse der Restriktionsendonuklilease-vermittelten DNA-Spaltung

Mit diesem Protokoll können wir die ortsspezifische DNA-Spaltung durch Restriktionsendonukleasen auf Einzelmolekülebene direkt beobachten. Unser Multiplex-Ansatz ermöglicht es uns, die Zeit zu messen, die Hunderte von einzelnen REasen benötigen, um den katalytischen Zyklus abzuschließen. Multiplexing ermöglicht es uns, gut gefüllte Verteilungen von der Verweildauer bis zur Spaltung zu generieren, die wir mit der Gamma-Wahrscheinlichkeitsverteilung abgleichen können, um Einblicke in den Mechanismus der DNA-Spaltung zu erhalten.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung eines frischen Röhrchens für jedes resuspendierte Oligonukleotid mit 50 Mikrolitern des Oligonukleotids und 50 Mikrolitern frisch zubereiteter DTT-Lösung in jedes Röhrchen, pipettieren Sie auf und ab, um es zu mischen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren. Pipettieren Sie das gesamte Volumen jeder Probenmischung vorsichtig auf eine vorbereitete Säule und zentrifugieren Sie sie zwei Minuten lang bei 750 g. Lagern Sie nach der Zentrifugation alle Proben, die nicht sofort verwendet werden, bei 20 Grad Celsius, um die Oxidation der Thiolgruppen und die Bildung von Disulfidbindungen zu verhindern.

Pipettieren Sie für jedes herzustellende Konstrukt ein Aliquot von 50 Mikrolitern des Quantenpunktstocks in ein Dialysegerät, wobei Sie darauf achten müssen, die Membran nicht mit der Pipettenspitze zu berühren. Dialysieren Sie gegen ein Volumen CHES-Puffer, das mindestens das 1.000-fache des Probenvolumens beträgt, und rühren Sie 15 Minuten lang bei 100 U/min. Entnehmen Sie mit einer Pipette vorsichtig die suspendierten Quantenpunkte aus dem Dialysegerät und geben Sie sie in ein frisches Röhrchen mit dem gleichen Volumen frisch zubereiteter Sulfo-SMCC-Lösung, wobei Sie zum Mischen auf und ab pipettieren.

1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit Schütteln bei 1.000 U/min inkubieren, damit das Sulfo-SMCC mit den primären Aminen auf den Quantenpunkten reagieren kann. Verwenden Sie dann eine Pipette, um jede Probe vorsichtig in ein frisches Dialysegerät zu überführen. Um überschüssiges Sulfo-SMCC zu entfernen, dialysieren Sie unter Rühren 15 Minuten lang gegen ein Volumen des CHES-Puffers, das mindestens dem 1.000-fachen des im Dialysegerät enthaltenen Volumens entspricht.

Tauschen Sie den Puffer zweimal aus und führen Sie die Dialyse mit frischem CHES-Puffer insgesamt dreimal durch, so dass die Dialyse nach jedem Pufferwechsel 15 Minuten lang fortgesetzt werden kann. Wiederholen Sie dann die Dialyse mit PBS. Gewinnen Sie mit einer Pipette vorsichtig die Lösung mit den Quantenpunkten aus dem Dialysegerät und überführen Sie jede Probe in ein frisches Röhrchen, das eine äquimolare Menge an dilatiertem Oligonukleotid enthält, das in PBS verdünnt ist.

2 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 1.000 U/min inkubieren. Geben Sie BSA zu jeder Probe für eine Endkonzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter. Verwenden Sie dann eine Pipette, um jede Probe vorsichtig in ein frisches Dialysegerät zu überführen und gegen einen Lagerpuffer zu dialysieren.

Entnehmen Sie nach der Dialyse vorsichtig jede Probe und geben Sie sie in ein frisches Röhrchen. Lagern Sie die Proben bei 4 Grad Celsius. Kombinieren Sie eine Probe von Quantenpunkt-markierten Oligonukleotiden mit einem zehnfachen molaren Überschuss an biotinyliertem Oligonukleotid.

Die Mischung in einem Heizblock auf 75 Grad Celsius erhitzen und 5 Minuten auf dieser Temperatur halten. Schalten Sie dann den Heizblock aus und lassen Sie die Mischung langsam abkühlen. Lagern Sie das fertige Konstrukt bei 4 Grad Celsius. Bohren Sie mit einem handgeführten Multifunktionswerkzeug, das mit einer konischen Diamantschleifscheibe ausgestattet ist, zwei Löcher in gegenüberliegende Ecken des Quarzschlittens, die als Ein- und Auslass dienen.

Achten Sie darauf, den Schlitten an Ort und Stelle zu sichern, schmieren Sie den Bohrer und schieben Sie ihn während des Bohrens ständig mit Wasser. Stellen Sie nach jedem Experiment den vorbereiteten Quarzobjektträger wieder her, indem Sie das gebrauchte Gerät in Aceton einweichen, um den Klebstoff und das Epoxidharz aufzulösen. Verwerfen Sie die restlichen Komponenten.

Kombinieren Sie 25 Mikroliter Streptavidin-Lösung mit 80 Mikrolitern PBS und 20 Mikrolitern Blockierungspuffer. Beschichten Sie ein mit PEG behandeltes Deckglas mit dieser Mischung und inkubieren Sie es 30 Minuten lang in einer feuchten Umgebung. Bereiten Sie während der Inkubation des Deckglases den Abstandshalter vor, um einen Strömungskanal zu erstellen.

Schneiden Sie ein 1 Zoll großes quadratisches Stück Abstandshaltermaterial aus und markieren Sie dann einen 2 Millimeter breiten Kanal, der an den Enden der Löcher ausgerichtet ist, die in den Quarzschlitten gebohrt wurden. Schneiden Sie den Kanal mit einem Skalpell aus dem Abstandsmaterial heraus. Reinigen Sie den Quarzobjektträger gründlich mit Aceton, um alle Klebstoffreste von früheren Experimenten zu entfernen.

Ziehen Sie eine Seite der Rückseite vom Bildabstandshalter ab und legen Sie sie vorsichtig auf den Quarzträger, wobei Sie darauf achten, dass die Ein- und Auslasslöcher nicht verdeckt werden. Waschen Sie den Deckbezug mit Wasser und trocknen Sie ihn mit Druckluft. Entfernen Sie die andere Seite der Rückseite vom Abstandshalter und klemmen Sie sie mit einer Kunststoffpinzette zwischen den Quarzobjektträger und den funktionalisierten Streptavidin-beschichteten Deckglas, um die Baugruppe zusammenzudrücken und Luftblasen vom Klebstoff zu entfernen.

Schneiden Sie das Ende des Schlauchs schräg ab, um einen freien Fluss der Lösung zu gewährleisten. Führen Sie dann in jedes Loch des Quarzschiebers einen 30 Zentimeter langen Polyethylenschlauch ein. Halten Sie die Rohre mit einem Rohrgestell fest und verwenden Sie dann Epoxidharz, um die Rohre und die Kanten des zusammengebauten Geräts zu versiegeln.

Sobald das Epoxidharz ausgehärtet ist, führen Sie die stumpfe Nadel einer leeren Spritze in das Auslassrohr des Geräts ein und tauchen Sie das Ende des Einlassrohrs in einen Behälter, der mit dem Blockierungspuffer gefüllt ist. Ziehen Sie den Spritzenkolben zurück, um das Gerät mit Blockierungspuffer zu füllen. Lassen Sie das Gerät dann mindestens 30 Minuten lang inkubieren, bevor Sie es verwenden.

Befestigen Sie das mikrofluidische Gerät mit Klebeband an der Tischplatte des Mikroskops. Bringen Sie das Objektiv in Kontakt mit der Unterseite des Geräts und positionieren Sie das Objektiv so, dass sich das Sichtfeld innerhalb des mikrofluidischen Kanals befindet. Nachdem Sie den Auslassschlauch an die Spritzenpumpe angeschlossen haben, spülen Sie den mikrofluidischen Kanal mit frischem Blockierungspuffer, indem Sie den Spritzenkolben zurückziehen.

Stellen Sie sicher, dass keine Blasen im Schlauch oder im Kanal eingeschlossen sind. 1 Mikroliter des vorbereiteten DNA-Substrats wird in 1 Milliliter Blockierungspuffer verdünnt. Legen Sie das Einlassröhrchen in das verdünnte DNA-Substrat und lassen Sie 800 Mikroliter der Substratlösung mit einer Geschwindigkeit von 200 Mikrolitern pro Minute durch den Kanal fließen.

Lassen Sie die DNA-Lösung 15 Minuten lang im Kanal inkubieren, nachdem der Fluss gestoppt wurde. Nach der Inkubation fließen mindestens 800 Mikroliter Blockierungspuffer mit einer Geschwindigkeit von 200 Mikrolitern pro Minute durch den Kanal, um die ungebundene DNA aus dem Kanal zu spülen. Stellen Sie den Fokus des Mikroskops so ein, dass die oberflächengebundenen Quantenpunkte deutlich sichtbar sind.

Spülen Sie das mikrofluidische Gerät mit 800 Mikrolitern experimentellem Puffer ohne Magnesium bei einer Durchflussrate von 200 Mikrolitern pro Minute. Die REase wird zu einem Aliquot aus experimentellem Puffer ohne Magnesium gegeben und durch Pipettieren vorsichtig gemischt. Fließen Sie 800 Mikroliter von 400 Einheiten pro Milliliter EcoRV mit einer Durchflussrate von 200 Mikrolitern pro Minute durch den Kanal.

Beginnen Sie das Experiment, indem Sie den experimentellen Puffer, der Magnesium und Fluorescein enthält, mit einer Durchflussrate von 200 Mikrolitern pro Minute fließen. Beginnen Sie sofort nach dem Starten der Spritzenpumpe mit der Datenerfassung. Stoppen Sie die Datenerfassung, nachdem 800 Mikroliter Puffer geflossen sind.

Nach dem Einbringen des DNA-Substrats in die Flusszelle und dem Wegspülen von überschüssiger DNA und Quantenpunkten befinden sich typischerweise Tausende von einzelnen Quantenpunkten in einem Sichtfeld. Sie sind stabil mit der Glasoberfläche verbunden und erleiden während des gesamten Versuchs kein merkliches Dimmen oder signifikantes Ausbleichen. Wenn die REase in Abwesenheit von Magnesium durch den Kanal geflossen ist, sind am Ende des Beobachtungszeitraums noch mindestens 95% der zu Beginn des Experiments vorhandenen Quantenpunkte zu sehen.

Wird der magnesiumhaltige Puffer jedoch unmittelbar nach der REase geflowt, verschwinden bis zum Ende des Beobachtungszeitraums bis zur Hälfte der Quantenpunkte, ähnlich wie bei der gemeinsamen Strömung von REase und Magnesium durch den Kanal. Das Verschwinden von Quantenpunkten geschieht schnell und führt zu einer starken Abnahme der Intensitätskurve, was einen klaren Hinweis auf den Zeitpunkt gibt, zu dem ein bestimmtes DNA-Molekül gespalten wird. Dieses Experiment wurde mit der gut untersuchten Typ II P REase EcoRV durchgeführt.

Sowohl die nichtlineare Kurvenanpassung der kleinsten Quadrate als auch die Schätzung der Maximum-Likelihood-Parameter wurden verwendet, um die Werte von n und beta aus den Daten zu extrahieren. Die beiden Methoden zur Parameterschätzung stimmten überein. Unter Verwendung der nichtlinearen Anpassung der kleinsten Quadrate betrug n 3,52 und beta 5,78 Sekunden.

Unter Verwendung der Maximum-Likelihood-Schätzung betrug n 3,41 und Beta 6,06 Sekunden. Dieser Assay kann den Nachweis erbringen, dass Zwischenschritte entlang des Spaltungswegs vorhanden sind. Die Durchführung dieses Assays unter sich ändernden Reaktionsbedingungen kann dazu beitragen, die Art von Reaktionszwischenprodukten zu bestimmen, die nicht direkt beobachtet werden können.