Die vom Patienten abgeleiteten Explantate sind eine kurzfristige Methode, die sofortige Arzneimittelansprechdaten liefert, die die Patientenergebnisse genau vorhersagen können. Die PD-Plattformen ermöglichen es, Arzneimittelreaktionen in einem 3D-Kontext zu untersuchen, der die pathologischen und architektonischen Merkmale der regionalen Tumoren so genau wie möglich widerspiegelt. Explantate haben das Potenzial, neue Einblicke in den Metabolismus und Wirkmechanismus eines Medikaments zu bieten und die Identifizierung neuer pharmakodynamischer Biomarker zu erleichtern.
Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, reinigen Sie alle chirurgischen Geräte mit 70% industrieller Methylbenzinlösung. Füllen Sie eine 10 Zentimeter große Kulturschale mit 25 Millilitern frischem Medium auf Eis. Übertragen Sie die Probe mit einer Pinzette auf eine Zahnwachsoberfläche und schneiden Sie das Gewebe mit zwei Hauttransplantatklingen in Fragmente von etwa zwei bis drei Kubikmillimetern.
Die Explantate in eine 10-Zentimeter-Schale geben und sechs bis neun Stücke des Gewebes in ein Ein-Milliliter-Röhrchen mit 10% nicht gepufferter Formalinlösung für eine 24-stündige Inkubation bei Raumtemperatur geben. Füllen Sie die gewünschte Anzahl von Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte mit 1,5 Millilitern frischem Medium pro Well. Und legen Sie eine organotypische Kulturschale in jeden Brunnen, so dass sie auf dem Medium schwebt.
Legen Sie sechs bis neun Explantate auf jede Einlegescheibe und lagern Sie sie für eine 16-stündige Inkubation in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator, um die Rückgewinnung zu ermöglichen. Am nächsten Tag fügen Sie frisches Medium und Droge zu jedem Brunnen eines neuen Tellers hinzu. Fügen Sie einen Brunnen für die Fahrzeugsteuerung hinzu.
Wenn alle medikamentösen Behandlungen vorbereitet sind, verwenden Sie eine Pinzette, um einen Einsatz in jede Vertiefung der neuen Sechs-Well-Platte für eine 24- bis 48-stündige Inkubation im Kohlendioxid-Inkubator zu übertragen. Nach der medikamentösen Behandlung werden die Bandscheiben in neue sechs Vertiefungsplatten mit 10% Formalin übertragen. Und fügen Sie ein paar Tropfen 10% Formalin an die Oberseite jeder Explantation hinzu, um eine vollständige Abdeckung mit dem Fixiermittel für 24 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur zu gewährleisten.
Am nächsten Tag eine angemessene Anzahl kleiner Histologieschwämme in 70% industrieller Methylierungslösung einweichen. Und legen Sie die Schwämme in Histologiekassetten. Wenn alle Schwämme platziert wurden, übertragen Sie alle Explantate aus dem gleichen medikamentösen Behandlungszustand auf einen einzigen Schwamm, wobei die mit dem Medikament behandelte Seite jedes Explantats die eingeführte Bandscheibe berührt.
Legen Sie einen weiteren vorgetränkten Schwamm auf jede Explant und schließen Sie die Kassette, um die Explantate in der Kassette zu sichern. Tauchen Sie dann die Kassetten in 70% industrielle Methylierungslösung, bevor Sie mit der histologischen Verarbeitung fortfahren. Führen Sie nach dem Scannen eine Trainingsanalyse durch und laden Sie die Scans mit den Stempeln für das Training in die entsprechende Analysesoftware.
Navigieren Sie in der Singlemode-Ansicht durch die Bilder und wählen Sie die zu analysierenden Scans und den Scan mit intrinsischer Fluoreszenz aus. Klicken Sie mit dem intrinsischen Fluoreszenzscan in einer einzigen Ansicht auf die Autofluoreszenzauswahl, um ein Segment auf einem Bereich mit nicht gefärbtem Gewebe zu zeichnen. Klicken Sie auf Markierungen und Farben bearbeiten und geben Sie die Markernamen in das Feld ein, das jedem Fluorophor zugeordnet ist.
Klicken Sie auf Bilder vorbereiten, damit die Software die Intensität der intrinsischen Fluoreszenz von allen hochgeladenen Bildern subtrahieren kann. Klicken Sie auf den Segmentgewebeschritt oben auf dem Bildschirm, um das Trainingsfenster für die Gewebesegmentierung zu öffnen. Geben Sie im Bereich Gewebekategorien den Namen jeder zu segmentierenden Gewebekategorie ein.
Klicken Sie auf Zeichnen, um Bereiche um Gruppen von Zellen in der interessierenden Gewebekategorie zu zeichnen. Wechseln Sie dann zur nächsten Gewebekategorie und zeichnen Sie neue Regionen. Wenn alle Trainingsregionen definiert sind, verwenden Sie train tissue segmenter und warten Sie, bis sich die Trainingsgenauigkeit eingependelt hat.
Möglicherweise bis zu einem Wert nahe 100% Klicken Sie auf das Segment, um die Gewebe zu segmentieren. Nachdem Sie die Qualität der Gewebesegmentierung überprüft haben, klicken Sie auf Zellsegmentierung und wählen Sie die zu segmentierenden Zellkompartimente aus. Um die Kernkomponente zu konfigurieren, verwenden Sie den typischen Intensitätsregler, um den Schwellenwert anzupassen, der zum Erkennen der Kernpixel verwendet wird.
Live-Feedback wird vom Vorschaufenster bereitgestellt. Um die Cluster von Kernpixeln aufzuteilen, wählen Sie im Bedienfeld "Kernkomponentenaufteilung" die Schaltfläche aus, die die Färbequalität der Kerne am besten beschreibt, und verwenden Sie den Schieberegler, um die Teilungsempfindlichkeit anzupassen. Klicken Sie dann auf Alle segmentieren, um alle Bilder zu segmentieren.
Wenn alle Bilder segmentiert wurden, fügen Sie im Phänotypbedienfeld die Liste der zu erkennenden Phänotypen hinzu und geben Sie den Namen der Phänotypen in das entsprechende Textfeld ein. Klicken Sie auf Phänotypen bearbeiten, um eine bestimmte Zelle auszuwählen, und wählen Sie den entsprechenden Phänotyp im Dropdown-Menü aus. Nachdem Sie die Auswahl für das Training abgeschlossen haben, klicken Sie auf den Zugklassifikator, um das Ergebnis jedes Phänotyps zu bewerten.
Fahren Sie mit phenotype all fort, speichern Sie das Projekt und klicken Sie auf Exportieren. Wählen Sie die Registerkarte Stapelanalyse aus, und laden Sie das Projekt in den Stapelalgorithmus oder das Projektfeld. Um die Bilder und Tabellen zu exportieren, wählen Sie alle Felder in den Exportoptionen aus, klicken Sie auf Folien hinzufügen und laden Sie alle Bilder, die die Stempel für die zuvor vorbereiteten Stapel enthalten.
Klicken Sie dann auf Ausführen, um die Stapelanalyse eines Stempels zu starten und die entsprechenden Daten zu exportieren, wenn er erfasst wurde. Die multispektrale Bildgebung von NSCLC-Explantatgewebe, das für Marker der Zelllebensfähigkeit gefärbt wurde, ermöglicht die Identifizierung und Phänotypisierung einzelner Zellpopulationen sowie die Identifizierung von Tumor- und Stromakomponenten innerhalb der explantierten Tumormikroumgebung. Gewebe- und Zellsegmentierung von Zelllebensfähigkeitsmarkerfärbungen multispektrale Bilder, wie gezeigt, können verwendet werden, um Zelltod und Proliferation in patientenabgeleiteten Explantaten zu quantifizieren, die mit Medikamenten von Interesse behandelt werden.
Zum Beispiel wurde in dieser Analyse in Gewebeproben von Tumoren, die mit Nivolumab behandelt wurden, eine höhere Anzahl von sterbenden Zellen im Vergleich zu den kontrollbehandelten Tumorproben identifiziert. Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit, räumliche Informationen aus gefärbten Dissektionen zu extrahieren, wie dargestellt, die Berechnung von Interzellenabständen. Explantate können auch für eine umfassende räumliche Profilierung oder Massenzytometrie verwendet werden, wodurch Hunderte von Biomarkern gleichzeitig mit einer subsidiären Auflösung profiliert werden können, während die 3D-Struktur der Probe erhalten bleibt.
PDs könnten die Wirksamkeit der Immuntherapie vorhersagen. Beispielsweise könnte es möglich sein, empfindliche oder resistente Fälle von Immun-Checkpoint-Inhibitoren zu unterscheiden und die Mechanismen zu untersuchen, die dieser Unterscheidung zugrunde liegen.
