Dieses Protokoll beschreibt eine kostengünstige Methode zur Durchführung von Arzneimittelviabilitätstests mit von Patientinnen stammenden Ovarialkarzinom-Organoiden. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die Verwendung kostengünstiger und leicht verfügbarer Materialien und Laborgeräte. Diese Methode kann vor der Durchführung teurer Hochdurchsatz-Drogenscreenings angewendet werden.
Obwohl sich die Methode mit der Durchführung von Viabilitätstests in Patientinnen-Ovarialkarzinom-Organoiden befasst, kann sie auf jedes Organoidsystem angewendet werden, einschließlich solcher, die von Mäusen stammen. Beobachten Sie zunächst den Basalmembranextrakt oder BME, der Organoide enthält, unter einem Hellfeldmikroskop, um eine Konfluenz von 70 bis 90 % sicherzustellen. Geben Sie mit einer Pipette ein bis zwei Milliliter vorgewärmtes Basismedium in die Vertiefung, die die Organoide enthält, und dissoziieren Sie die Organoide mechanisch, indem Sie sie auf und ab pipettieren.
Die gesamte Organoidsuspension wird in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt und das Röhrchen fünf bis 10 Sekunden lang aufgewirbelt, um die Zellen weiter zu disaggregieren. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 1,107 G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand mit einer Einkanalpipette an und entsorgen Sie ihn.
Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Organoid-Dissoziationsreagenz, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt ist, und überführen Sie die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren Sie die Probe sieben Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Dann zentrifugiert man das Ergebnis in Zellsuspension bei 1,107 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter vorgewärmtem Basismedium. Rekonstituieren Sie die Zellen in einer Mischung aus Basismedien und BME, wobei eine Endkonzentration von 20.000 Zellen pro 10 Mikroliter beibehalten wird. Platte ein Drei-Mikroliter-Tröpfchen der resuspendierten Zellen pro Vertiefung einer schwarzen, undurchsichtigen 96-Well-Platte.
Inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Zum Schluss werden 100 Mikroliter vorgewärmtes hochentwickeltes Organoid-Medium in jede Vertiefung gegeben, bevor die Platte 24 bis 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert wird. Führen Sie eine medikamentöse Behandlung der Organoide zwei Tage nach der Beschichtung durch.
Führen Sie sieben Tage nach der Arzneimittelbehandlung einen Viabilitätstest an den Organoiden durch. Geben Sie 100 Mikroliter Viabilitäts-Assay-Reagenz in jede Vertiefung, um das Gesamtvolumen auf 200 Mikroliter zu bringen, und schütteln Sie die Platte fünf Minuten lang bei 80 U/min. Lassen Sie die Platte dann weitere 25 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Schalten Sie in der Zwischenzeit den Biolumineszenzplattenleser ein und öffnen Sie die Augensteuerungssoftware. Navigieren Sie zum Gerät"und wählen Sie Infinite 200Pro"Lumineszenz auswählen"und Standardskript"Wählen Sie als nächstes aus dem Dropdown-Menü BD 96 FB Falcon BD Falcon 96 Flat Black"als Plattentyp, um die Lumineszenzparameter einzustellen. Weisen Sie die Dämpfung als "Keine" zu.
Integrationszeit als 1000 Millisekunden und Einschwingzeit als null Millisekunden. Zum Schluss decken Sie die Platte ab, legen sie auf den Plattenleser und drücken Sie "Start", um zu beginnen. Es wurden Hellfeldbilder für die beiden verschiedenen patientenabgeleiteten Organoide (PDOs) aufgenommen, die im Protokoll verwendet werden.
PDO eins, abgeleitet aus einer Tumorbiopsie, und PDO zwei, abgeleitet aus Aszites. Die Ergebnisse des Viabilitätstests zeigten den prozentualen Anteil lebender Zellen in PDO 1 und PDO 2, nachdem beide mit unterschiedlichen Konzentrationen von Carboplatin behandelt wurden. Die berechnete Wachstumsrate oder GR-Werte wurden gegen die entsprechenden Carboplatin-Konzentrationen aufgetragen, und die GR-Metriken zeigten, dass der GR50-Wert für PDO eins viel höher war als der für PDO zwei.
Dies deutete darauf hin, dass PDO eins resistenter gegen eine Platin-Chemotherapie war. Während der Beschichtung ist es entscheidend, dass das drei Mikrolitertröpfchen der Zellsuspension direkt in der Mitte der Vertiefung platziert wird. Wenn der Tropfen zu nahe am Rand des Wells platziert wird, kann dies dazu führen, dass der Tropfen kollabiert, was sich auf die Analyseergebnisse auswirkt.
